本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)，具體地說，涉及一種外泌體及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、皮膚損傷由機(jī)械性、物理性、化學(xué)性和生物性等因素引起，機(jī)體對(duì)損傷進(jìn)行修補(bǔ)的過程叫做組織修復(fù)。組織修復(fù)可分為三個(gè)階段：第一階段為局部炎癥反應(yīng)階段，傷口被血凝塊填充，繼而發(fā)生炎癥反應(yīng)，該階段主要作用是止血和封閉創(chuàng)口，減少感染。第二階段為細(xì)胞的增殖分化及肉芽組織的生成階段，真皮中的血管借助基質(zhì)和生長因子形成新的血管芽并向傷口內(nèi)延伸，形成新的血管網(wǎng)絡(luò)。血管形成的過程中，成纖維細(xì)胞快速增生，結(jié)合細(xì)胞基質(zhì)共同形成肉芽組織填充傷口。傷口愈合后就進(jìn)入到第三階段：傷口重塑期。在該階段，各種參與修復(fù)的組織、基質(zhì)、膠原蛋白、血管等重新磨合使得進(jìn)一步接近正常皮膚組織。膠原蛋白也由之前無序的排列逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)則的排列方式，使得皮膚能夠承受外部的張力和壓力。

2、人表皮生長因子（human?epidermal?growth?factor，hegf）是由53個(gè)氨基酸組成的單鏈小分子酸性多肽，具有多種生物學(xué)功能，具有明顯的促細(xì)胞增殖、分化和遷移的功能，從而在器官發(fā)育及傷口修復(fù)中扮演重要角色。hegf主要通過與egf受體（epidermalgrowth?factor?receptor，egfr）結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能：egf與egfr結(jié)合后，誘導(dǎo)egfr形成同源或者異源二聚體，激活受體酪氨酸激酶（rtk），引起egfr的c末端結(jié)構(gòu)中特異的酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的酪氨酸殘基成為第二信使分子，招募含有sh2（src同源2）結(jié)構(gòu)域和ptb（酸化酪氨酸結(jié)合）結(jié)構(gòu)域的信號(hào)分子進(jìn)行組裝，激活下游多條信號(hào)通路，包含ras/raf/mek/?mapk、jak/stat、pi3k/akt和plcγ/pkc，參與細(xì)胞的增殖、分化和遷移。

3、egf通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌等途徑作用于周圍細(xì)胞，激活信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和遷移，對(duì)表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞具有強(qiáng)大的生物活性，利于肉芽組織形成及皮膚創(chuàng)面的上皮化；此外，egf還可以提高血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子、tgf-α的合成及膠原的生成，加速創(chuàng)面的愈合。基于egf的損傷修復(fù)能力，egf在糖尿病性潰瘍及燒燙傷在內(nèi)的外科傷口修復(fù)中得到了廣泛的研究。

4、然而，egf在傷口修復(fù)部位很容易被存在于傷口內(nèi)的蛋白酶所降解，造成有效劑量減少的問題。因此亟需探索新的材料或者載體提高egf的生物利用率。

5、外泌體是粒徑大小在60-200nm的細(xì)胞外囊泡，可以由幾乎所有細(xì)胞分泌，能包含一些復(fù)雜的物質(zhì)（例如：蛋白、核酸、多肽等），因此可作為細(xì)胞間通訊的介質(zhì)。此外，外泌體能夠有效的保護(hù)其中的核酸成分不被降解，具有很好的藥物遞送的前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種高效制備egf?mrna表達(dá)水平顯著提升的外泌體的方法。

2、本發(fā)明提供了一種制備外泌體的方法，其包括：

3、（1）將編碼信號(hào)肽tpa和表皮生長因子（egf）的核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的aavs1區(qū)域中如seq?id?no.9與seq?id?no.10所示序列之間，獲得改造后的宿主細(xì)胞；

4、（2）收集所述改造后的宿主細(xì)胞分泌的外泌體。

5、本發(fā)明通過將編碼egf和特定信號(hào)肽的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的特定位置，從而使宿主細(xì)胞（表達(dá)表皮生長因子的單克隆細(xì)胞株）既可穩(wěn)定表達(dá)egf，顯著提升其外泌體內(nèi)的egfmrna水平，又不影響宿主細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。

6、本發(fā)明使用外泌體作為攜帶egf核酸的載體，能夠提高egf的皮膚滲透性，提高egf在傷口部位的利用率。

7、本發(fā)明方法制備的外泌體具備促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖以及遷移的功效，是一種潛在的促表皮細(xì)胞增殖的制劑，為皮膚的慢性及新創(chuàng)面治療以及燒燙傷創(chuàng)面的治療提供了新方向。

8、本發(fā)明的方法中，編碼表皮生長因子的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；編碼信號(hào)肽tpa的核苷酸序列如seq?id?no.11。

9、本發(fā)明的方法中，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為293f細(xì)胞，以利于工業(yè)化生產(chǎn)。

10、本發(fā)明的方法中，通過將攜帶編碼信號(hào)肽tpa和表皮生長因子的核苷酸序列的載體和攜帶sgrna的載體同時(shí)轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，獲得改造后的宿主細(xì)胞。

11、本發(fā)明的方法中，所述sgrna的核苷酸序列如seq?id?no.8所示。

12、本發(fā)明通過sgrna使得編碼信號(hào)肽tpa和表皮生長因子的核苷酸序列可以被引入宿主細(xì)胞基因組的特定位置。

13、作為一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方式，本發(fā)明改造宿主細(xì)胞的方法包括：

14、以293f為母細(xì)胞，在293f基因組中通過基因編輯的方法在aavs1區(qū)域的特定位點(diǎn)插入目的基因tap-egf，具體包括以下步驟：

15、步驟1：提取tap-egf序列，構(gòu)建目的基因敲入質(zhì)粒及guide?rna質(zhì)粒；

16、步驟2：用293f細(xì)胞和上述兩個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；

17、步驟3：加入抗生素（嘌呤霉素）進(jìn)行篩選；

18、步驟4：兩周后，通過稀釋法分離單克隆細(xì)胞；

19、步驟5：通過提取基因組dna，在插入位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行序列擴(kuò)增，最后進(jìn)行測序分析，篩選在目的位點(diǎn)兩側(cè)染色體雙敲入的單克隆細(xì)胞株。

20、本發(fā)明的方法步驟（2）中，先將所述改造后的宿主細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，然后收集培養(yǎng)上清液中的外泌體。

21、作為一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方式，本發(fā)明利用所述的構(gòu)建方法構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)egf的293f細(xì)胞株，然后進(jìn)行培養(yǎng)，收集上清，再通過離心及切向流的方法收集所述egf-293f細(xì)胞株分泌的外泌體。

22、本發(fā)明還提供一種外泌體，其由上述方法制備得到。

23、本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包括上述外泌體和藥學(xué)上可接受的輔料。

24、本發(fā)明還提供上述方法或外泌體或藥物組合物在制備促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖或抑制膠原蛋白生成或促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

25、本發(fā)明還提供上述方法或外泌體或藥物組合物在制備促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合產(chǎn)品中的應(yīng)用。

26、本發(fā)明的有益效果至少在于：

27、本發(fā)明制備外泌體的方法可顯著提升外泌體中egf?mrna的水平，且理論上可以盡可能降低外泌體生產(chǎn)過程中的批次間差異，提高穩(wěn)定性，利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)放大。

28、本發(fā)明方法獲得的外泌體具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及遷移的功效，并能夠降低內(nèi)源膠原蛋白的生成，提供了一種具有傷口修復(fù)功能的、“現(xiàn)貨型”的無細(xì)胞的細(xì)胞治療產(chǎn)品，為傷口愈合提供了治療的新方向。

技術(shù)特征：

1.一種制備外泌體的方法，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，編碼表皮生長因子的核苷酸序列如seq?idno.1所示；編碼信號(hào)肽tpa的核苷酸序列如seq?id?no.11。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為293f細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過將攜帶編碼信號(hào)肽tpa和表皮生長因子的核苷酸序列的載體和攜帶sgrna的載體同時(shí)轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，獲得改造后的宿主細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq?id?no.8所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，先將所述改造后的宿主細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，然后收集培養(yǎng)上清液中的外泌體。

7.一種外泌體，其特征在于，由權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法制備得到。

8.一種藥物組合物，其特征在于，包括權(quán)利要求7所述的外泌體和藥學(xué)上可接受的輔料。

9.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法或權(quán)利要求7所述的外泌體或權(quán)利要求8所述的藥物組合物在制備促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖或抑制膠原蛋白生成或促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法或權(quán)利要求7所述的外泌體或權(quán)利要求8所述的藥物組合物在制備促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合產(chǎn)品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體公開了一種外泌體及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明制備外泌體的方法包括：（1）將編碼信號(hào)肽TPA和表皮生長因子的核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的AAVS1區(qū)域中如SEQ?ID?No.9與SEQ?ID?No.10所示序列之間，獲得改造后的宿主細(xì)胞；（2）收集所述改造后的宿主細(xì)胞分泌的外泌體。本發(fā)明可顯著提升外泌體中的EGF?mRNA表達(dá)水平，從而使獲得的外泌體在皮膚創(chuàng)傷治療中獲得更好的效果。

技術(shù)研發(fā)人員：高珮芬,安文林,申久恒,趙憲,武雪,汪旭東,周晚彤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6