本發(fā)明涉及合成生物學(xué)和代謝工程化，特別涉及一種交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)的構(gòu)建方法及在鹽單胞菌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、傳統(tǒng)的靜態(tài)調(diào)控方法，是通過設(shè)計(jì)和改造遺傳編碼組件對(duì)目標(biāo)代謝通路進(jìn)行靜態(tài)優(yōu)化的代謝工程改造策略，具有定向性及不可逆性，改造后的細(xì)胞在生長過程中不具備感應(yīng)指定信號(hào)而做出特定調(diào)整的能力，且對(duì)代謝通路的靜態(tài)調(diào)控改造可能會(huì)影響細(xì)胞的生長狀態(tài)，在一定程度上限制了代謝工程化微生物生產(chǎn)產(chǎn)品的種類多樣性。相較于傳統(tǒng)的靜態(tài)調(diào)控，交互式穩(wěn)定表達(dá)的群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)以細(xì)胞密度作為響應(yīng)信號(hào)，可以在線感知細(xì)胞狀態(tài)并進(jìn)行實(shí)時(shí)代謝調(diào)控。因此，對(duì)代謝通路的動(dòng)態(tài)調(diào)控改造是一種具有較大應(yīng)用前景的代謝工程改造策略，交互式穩(wěn)定表達(dá)的群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)以細(xì)胞密度作為響應(yīng)信號(hào)，能夠進(jìn)行代謝通路的動(dòng)態(tài)調(diào)控，將工程菌株的細(xì)胞生長與產(chǎn)物生產(chǎn)過程解偶聯(lián)，降低產(chǎn)物生產(chǎn)對(duì)細(xì)胞生長的負(fù)擔(dān)與產(chǎn)物對(duì)于細(xì)胞的不良反應(yīng)，且該誘導(dǎo)系統(tǒng)無需外源添加誘導(dǎo)劑，在實(shí)際生產(chǎn)中能夠有效降低使用誘導(dǎo)劑所帶來的高昂成本，簡化下游處理工藝，提高生產(chǎn)效益。

2、相較于傳統(tǒng)的代謝工程底盤細(xì)菌，本發(fā)明著力于在極端環(huán)境中生存的微生物，特別是能進(jìn)行無滅菌開放式發(fā)酵的鹽單胞菌，與外源添加誘導(dǎo)劑相比，鹽單胞菌中的交互式穩(wěn)定表達(dá)的群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)可以通過混菌進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)代謝通路的動(dòng)態(tài)調(diào)控，且不會(huì)發(fā)生染菌情況。但代謝通路的靜態(tài)調(diào)控改造是目前以鹽單胞菌作為底盤細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)最常用的代謝工程化改造方法之一，由于其定向性、不可逆性及產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞潛在的不良影響等因素，導(dǎo)致產(chǎn)物種類的多樣性受限，限制了鹽單胞菌細(xì)胞工廠的應(yīng)用范圍。綜上所述，亟需開發(fā)一種基于鹽單胞菌交互式穩(wěn)定表達(dá)的群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)，能夠以細(xì)胞密度作為響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行靶基因的動(dòng)態(tài)調(diào)控，以混菌的方式實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)，無需外源添加誘導(dǎo)劑，降低實(shí)際生產(chǎn)成本，拓展鹽單胞菌細(xì)胞工廠的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提出了一種交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)的構(gòu)建方法及在鹽單胞菌中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明公開了一種交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)，所述交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)包括plux-luxr-cini誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和pcin-cinr-luxi誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)；

3、所述plux-luxr-cini誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)包括plux、luxr、cini、目的基因；

4、所述pcin-cinr-luxi誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)包括pcin、cinr、luxi、目的基因；

5、所述luxr的核苷酸序列如seq?id?no?1所示；

6、所述cini的核苷酸序列如seq?id?no?2所示；

7、所述cinr的核苷酸序列如seq?id?no?3所示；

8、所述luxi的核苷酸序列如seq?id?no?4所示；

9、所述plux是一個(gè)啟動(dòng)子，plux啟動(dòng)子可以被luxr轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和luxi信號(hào)分子蛋白復(fù)合體識(shí)別和結(jié)合，從而調(diào)控下游目的基因的表達(dá)；

10、所述luxr是一個(gè)基因，編碼luxr轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。在plux-luxr誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中，luxr轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白與信號(hào)分子或誘導(dǎo)劑(例如3-oxohexanoyl-homoserine?lactone，oc6)相互作用，并與plux啟動(dòng)子結(jié)合；

11、所述luxi是一個(gè)基因，編碼plux-luxr誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的信號(hào)分子或誘導(dǎo)劑oc6；

12、所述pcin是一個(gè)啟動(dòng)子，pcin啟動(dòng)子可以被cinr轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和cini信號(hào)分子蛋白復(fù)合體識(shí)別和結(jié)合，從而調(diào)控下游目的基因的表達(dá)；

13、所述cinr是一個(gè)基因，編碼cinr轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。在pcin-cinr誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中，cinr轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白與信號(hào)分子或誘導(dǎo)劑(例如3-hydroxytetradecanoyl-homoserinelactone，ohc14)相互作用，并與pcin啟動(dòng)子結(jié)合；

14、所述cini是一個(gè)基因，編碼pcin-cinr誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的信號(hào)分子或誘導(dǎo)劑ohc14。

15、所述目的基因可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x定任意一種基因，本發(fā)明實(shí)施例中的目的基因選自熒光蛋白中的superfolder?gfp(sfgfp)一種。

16、進(jìn)一步的，所述plux為野生型啟動(dòng)子plux、突變型啟動(dòng)子plux中的任意一種；

17、所述突變型啟動(dòng)子plux為野生型啟動(dòng)子plux-10核心區(qū)序列ttgt突變?yōu)閏atg、ggtg、ctgt、atgt、gtgg中的任意一種；

18、所述野生型啟動(dòng)子plux的核苷酸序列如seq?id?no?5所示。

19、進(jìn)一步的，所述pcin為野生型啟動(dòng)子pcin、突變型啟動(dòng)子pcin中的任意一種；

20、所述突變型啟動(dòng)子pcin為野生型啟動(dòng)子pcin-10核心區(qū)序列g(shù)aac突變?yōu)閠taa、tcat、gccc、tggg、gggg中的任意一種；

21、所述野生型啟動(dòng)子pcin的核苷酸序列如seq?id?no?6所示。

22、本發(fā)明還提供了所述交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

23、(1)plux-luxr-cini誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法如下：

24、(i)將plux和luxr-cini構(gòu)建在同一質(zhì)粒上，得到含有plux-luxr-cini的質(zhì)粒；

25、或

26、將plux和luxr-cini分別構(gòu)建在不同的質(zhì)粒上，得到含有plux的質(zhì)粒和含有l(wèi)uxr-cini的質(zhì)粒；

27、(ii)將所述含有plux-luxr-cini的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至鹽單胞菌中，得到含有plux-luxr-cini的質(zhì)粒的鹽單胞菌；

28、或

29、將所述含有l(wèi)uxr-cini的質(zhì)粒整合至鹽單胞菌基因組上，得到基因組含有l(wèi)uxr-cini的鹽單胞菌，再將含有plux的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至基因組含有l(wèi)uxr-cini的鹽單胞菌中，得到含有plux的質(zhì)粒且基因組含有l(wèi)uxr-cini的鹽單胞菌；其中，將luxr-cini整合至鹽單胞菌基因組attp位點(diǎn)上。

30、(2)pcin-cinr-luxi誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法如下：

31、(i)將pcin和cinr-luxi構(gòu)建在同一質(zhì)粒上，得到含有pcin-cinr-luxi的質(zhì)粒；

32、或

33、將pcin和cinr-luxi分別構(gòu)建在不同的質(zhì)粒上，得到含有pcin的質(zhì)粒和含有cinr-luxi的質(zhì)粒；

34、(ii)將所述含有pcin-cinr-luxi的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至鹽單胞菌中，得到含有pcin-cinr-luxi的質(zhì)粒的鹽單胞菌；

35、或

36、將所述含有cinr-luxi的質(zhì)粒整合至鹽單胞菌基因組上，得到基因組含有cinr-luxi的鹽單胞菌，再將含有pcin的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至基因組含有cinr-luxi的鹽單胞菌中，得到含有pcin的質(zhì)粒且基因組含有cinr-luxi的鹽單胞菌；其中，將luxr-cini整合至鹽單胞菌基因組attp位點(diǎn)上。

37、(3)將步驟(1)中(ii)得到的鹽單胞菌和步驟(2)中(ii)得到的鹽單胞菌進(jìn)行混菌及發(fā)酵培養(yǎng)。

38、進(jìn)一步的，步驟(1)中(ii)得到的鹽單胞菌與步驟(2)中(ii)得到的鹽單胞菌按照1:9、1:4、1:1、4:1、9:1中的任一體積比互混。

39、優(yōu)選地，混菌的比例為(0.25～1):1，本發(fā)明實(shí)施例中混菌的比例優(yōu)選為1：4。

40、進(jìn)一步的，步驟(1)中(ii)得到的鹽單胞菌與步驟(2)中(ii)得到的鹽單胞菌混菌的時(shí)間為0h-16h。

41、本發(fā)明還提供一種交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)表達(dá)放大系統(tǒng)，所述交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)表達(dá)放大系統(tǒng)包含所述的plux-luxr-cini誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、所述的pcin-cinr-luxi誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、鹽單胞菌中的類t7啟動(dòng)子、t7?rna聚合酶、目的基因。

42、本發(fā)明還提供了所述的交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)表達(dá)放大系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

43、(1)將所述基因組含有cinr-luxi的鹽單胞菌基因組上的ptac-rnap啟動(dòng)子替換為所述的野生型啟動(dòng)子pcin，得到基因組含有野生型啟動(dòng)子pcin的鹽單胞菌；

44、(2)將所述基因組含有l(wèi)uxr-cini的鹽單胞菌基因組上的ptac-rnap啟動(dòng)子替換為所述的野生型啟動(dòng)子plux，得到基因組含有野生型啟動(dòng)子plux的鹽單胞菌；

45、(3)將類t7啟動(dòng)子和目的基因的核苷酸序列插入質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒；

46、其中，本發(fā)明實(shí)施例中所述類t7啟動(dòng)子選擇的是pmmp1啟動(dòng)子。

47、(4)將步驟(3)所述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至步驟(1)得到的鹽單胞菌和步驟(2)得到的鹽單胞菌，進(jìn)行混菌及發(fā)酵培養(yǎng)。

48、其中，所述混菌的比例優(yōu)選為(0.25～1):1，本發(fā)明實(shí)施例中混菌的比例優(yōu)選為1：4。

49、本發(fā)明還提供了一種交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)表達(dá)抑制系統(tǒng)，所述交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)表達(dá)抑制系統(tǒng)包含所述的plux-luxr-cini誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、所述的pcin-cinr-luxi誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、dcas9、grna、目的基因。

50、本發(fā)明還提供了所述的交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)表達(dá)抑制系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

51、(1)構(gòu)建pcin-dcas9-啟動(dòng)子-目的基因表達(dá)模塊，將表達(dá)模塊插入質(zhì)粒中，得到第一質(zhì)粒；

52、構(gòu)建pcin-grna表達(dá)模塊，將表達(dá)模塊插入質(zhì)粒中，得到第二質(zhì)粒；

53、將第一質(zhì)粒和第二質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化至所述基因組含有cinr-luxi的鹽單胞菌中，得到帶有雙質(zhì)粒的鹽單胞菌；

54、(2)構(gòu)建plux-dcas9-啟動(dòng)子-目的基因表達(dá)模塊，將表達(dá)模塊插入質(zhì)粒中，得到第三質(zhì)粒；

55、構(gòu)建plux-grna表達(dá)模塊，將表達(dá)模塊插入質(zhì)粒中，得到第四質(zhì)粒；

56、將第三質(zhì)粒和第四質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化至所述基因組含有l(wèi)uxr-cini的鹽單胞菌中，得到帶有雙質(zhì)粒的鹽單胞菌；

57、(3)將步驟(1)和(2)得到的帶有雙質(zhì)粒的鹽單胞菌進(jìn)行混菌及發(fā)酵培養(yǎng)。

58、本發(fā)明還提供了所述交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)或所述交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)表達(dá)放大系統(tǒng)或所述交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)抑制表達(dá)系統(tǒng)在鹽單胞菌中的應(yīng)用。

59、綜上，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明達(dá)到了以下技術(shù)效果：本發(fā)明公開的交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)，相較于以往的代謝通路靜態(tài)調(diào)控，能夠以細(xì)胞密度作為響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行靶基因的動(dòng)態(tài)調(diào)控，以混菌的方法實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)，無需外源添加誘導(dǎo)劑，減低實(shí)際生產(chǎn)成本，擴(kuò)展了鹽單胞菌細(xì)胞工廠的應(yīng)用前景。同時(shí)，在所述的交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)基礎(chǔ)上可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的放大表達(dá)或抑制，可用于研究基因間相互作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等復(fù)雜生物學(xué)過程。通過所述交互式穩(wěn)定表達(dá)群體響應(yīng)混菌誘導(dǎo)系統(tǒng)，可以模擬細(xì)胞間的相互作用，探究不同基因在復(fù)雜環(huán)境下的調(diào)控機(jī)制。