發(fā)明領(lǐng)域本公開涉及包含至少兩種不同的重組靶位點(rts)的位點特異性整合(ssi)哺乳動物細胞，其中兩種rts在染色體上整合于nl1基因座或nl2基因座內(nèi)。該公開還涉及包含至少4種不同的rts的ssi哺乳動物細胞，其中2種rts在染色體上整合于nl1或nl2基因座內(nèi)，而2種rts在染色體上整合于單獨的基因座內(nèi)。該公開還涉及用于使用ssi哺乳動物宿主細胞系以產(chǎn)生可以額外表達難以表達的蛋白質(zhì)的重組蛋白表達細胞系的方法。

背景技術(shù)：

1、新型和生物仿制藥生物制藥持續(xù)可見高需求以及增加的銷售收入。普遍性增強的新型形式、非單克隆抗體(mab)，重組蛋白(rp)中許多可被歸類為難以表達(dte)，這可能對生物制藥工業(yè)中治療劑的遞送提出挑戰(zhàn)。dte蛋白可以與低于預(yù)期的效價或與多鏈，輔助蛋白，產(chǎn)品回收或純化的問題相關(guān)(pybus等biotechnol.bioeng.111:372-85(2014))。dte蛋白的示例包括但不限于，fc-融合蛋白，雙特異性或三特異性mab，酶，膜受體，和雙特異性t細胞接合物(micromet?ag公司，德國慕尼黑)分子和選定的mab。

2、用于將重組蛋白(rp)表達盒整合到宿主細胞基因組的一種報道的方法基于隨機整合(ri)，所述ri是通過將dna導(dǎo)入細胞并合并于基因組中存在的雙鏈斷裂(dsb)的方法。因此，當(dāng)使用這樣的方法時，整合的基因拷貝數(shù)和整合位點處的表達特征(位置上色效果(position?variegation?effect))可以高度可變。出于許多原因，這對dte蛋白來說可能會有問題。例如，對于一些多鏈蛋白，這將難以控制整合的編碼單獨鏈或輔助基因的基因拷貝數(shù)量，載體大小限制將阻礙多鏈蛋白的表達，轉(zhuǎn)染多個載體將導(dǎo)致低整合效率和可能導(dǎo)致毒性的一些dte的高表達。

3、用于整合rp表達盒的另一方法是通過使用位點特異性整合(ssi)。位于ssi細胞系基因組中的“著陸坪(landing?pad)”可以利用源自位點特異性重組酶系統(tǒng)，如源自釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)的flp-frt系統(tǒng)或源自噬菌體p1的cre-loxp系統(tǒng)的重組靶位點(rts)。在這些系統(tǒng)中，重組的酶或重組酶負責(zé)供體和包含相容重組位點(分別為frt或loxp)的靶dna之間的重組事件(參見例如，wirth等curr.op.in?biotech.18:411-9(2007))。通過使用位于待交換的盒(在供體和靶dna中)5'和3'端的不同重組位點，有可能保證重組以定向的方式發(fā)生并且只有優(yōu)選的盒區(qū)域被交換。因此，ssi可以比隨機整合方法有利。將盒整合到ssi細胞系的過程被稱之為重組酶介導(dǎo)的盒交換(emce)。實際上，用于使用emce產(chǎn)生重組蛋白的細胞系構(gòu)建涉及共轉(zhuǎn)染編碼重組酶的表達載體以及靶向表達載體，所述靶向表達載體包含感興趣的基因(編碼rp)和側(cè)接重組酶靶向序列的選擇標(biāo)志物。

4、使用單一著陸坪的產(chǎn)生ssi的細胞系也有局限性。例如，這樣的方法通常，由于設(shè)計，導(dǎo)致可以間接限制rp產(chǎn)生重組蛋白表達效價的經(jīng)整合的基因拷貝數(shù)量較少。如果對于rp產(chǎn)生需要在包含單一著陸坪的ssi宿主細胞系中產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，那么所有需要的基因?qū)⑿枰ㄔ趩我惠d體中。增加整合的重組基因拷貝的一種方法是累積ssi(有時候稱為堆疊或多重，參見例如，kameyama等biotechnol.bioeng.105:1106-14(2010)，kawabe等cytotechnology?64:267-79(2012)和turan等j.mol.biol.402:52-69(2010))。藉由這樣的方法，重復(fù)輪的rmce可以用于加載單個位點，然后是rp表達盒拷貝的多個拷貝。這類ssi宿主細胞系中的著陸坪不能獨立尋址，并且需要重復(fù)輪的rmce，對于各循環(huán)將花費額外的時間。

5、本文引用各種公開文獻，其公開內(nèi)容通過引用其全部內(nèi)容納入本文。

技術(shù)實現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、存在生成這樣的ssi宿主細胞系的需求，所述ssi宿主細胞系克服了ssi宿主僅有單一基因組插入位點的限制。該發(fā)明通過使用串聯(lián)的ssi著陸坪實現(xiàn)了該需求，其中兩個或更多個著陸坪被整合于相同的基因座，可能克服了累積位點特異性整合的限制。在這樣的一個系統(tǒng)中，著陸坪是獨立地可尋址的(由于重組位點和選擇標(biāo)志物選擇)。

2、在一些實施方式中，本公開提供了包含至少兩種不同rts的哺乳動物細胞，其中兩種rts在染色體上整合于nl1基因座或nl2基因座內(nèi)。在一些實施方式中，細胞包含兩種不同的rts。在一些實施方式中，兩種不同的rts在染色體上整合于nl1基因座內(nèi)。在一些實施方式中，兩種不同的rts在染色體上整合于nl2基因座內(nèi)。在一些實施方式中，細胞包含四種不同的rts。在一些實施方式中，四種不同的rts在染色體上整合于相同的基因座。在一些實施方式中，兩種不同的rts在染色體上整合于單獨的基因座。在一些實施方式中，單獨的基因座是fer1l4基因座。在一些實施方式中，兩種不同的rts在染色體上整合于nl1基因座內(nèi)，而兩種不同的rts在染色體上整合于nl2基因座內(nèi)。在一些實施方式中，細胞包含六種不同的rts。在一些實施方式中，至少四種不同的rts在染色體上整合于相同的基因座。在一些實施方式中，至少兩種不同的rts在染色體上整合于nl1基因座或nl2基因座內(nèi)，而至少兩種不同的rts在染色體上整合于單獨的基因座。在一些實施方式中，單獨的基因座是fer1l4基因座。在一些實施方式中，至少兩種不同的rts在染色體上整合于nl1基因座內(nèi)，而至少兩種不同的rts在染色體上整合于nl2基因座內(nèi)。在一些實施方式中，rts中的至少一種是frt位點，lox位點，rox位點或att位點。在一些實施方式中，rts中的至少一種選自seq?id?no:1-30中。在一些實施方式中，細胞是小鼠細胞，人細胞，中國倉鼠卵巢(cho)細胞，cho-k1細胞，cho-dxb11細胞，cho-dg44細胞，包括各種變體的chok1svtm細胞，包括各種變體的chok1svgs-kotm(谷氨酰胺合成酶敲除)細胞，hek細胞，包括粘附和懸浮適應(yīng)型變體的hek293細胞，hela細胞，或ht1080細胞。在一些實施方式中，細胞是hek細胞。

3、在一些實施方式中，細胞包含感興趣的第一基因，其中，感興趣的第一基因整合在染色體上。在一些實施方式中，感興趣的第一基因包含報告基因，選擇基因，治療意義的基因，輔助基因或其組合。在一些實施方式中，治療意義的基因包含編碼dte蛋白的基因。在一些實施方式中，dte蛋白選自：fc融合蛋白，酶，膜受體，雙特異性t細胞接合物(micromet?ag公司，德國慕尼黑)或單克隆抗體。在一些實施方式中，單克隆抗體是雙特異性單克隆抗體或三特異性單克隆抗體。在一些實施方式中，感興趣的第一基因位于兩種rts之間。在一些實施方式中，感興趣的第一基因位于nl1基因座內(nèi)。在一些實施方式中，細胞包含感興趣的第二基因，其中，感興趣的第二基因整合在染色體上。在一些實施方式中，感興趣的第二基因包含報告基因，選擇基因，治療意義的基因，輔助基因或其組合。在一些實施方式中，治療意義的基因包含編碼dte蛋白的基因。在一些實施方式中，dte蛋白選自：fc融合蛋白，酶，膜受體，雙特異性t細胞接合物或單克隆抗體。在一些實施方式中，感興趣的第二基因位于兩種rts之間。在一些實施方式中，感興趣的第二基因位于nl1基因座或nl2基因座內(nèi)。在一些實施方式中，感興趣的第一基因位于nl1基因座內(nèi)，而感興趣的第二基因位于nl2基因座內(nèi)。在一些實施方式中，細胞包含感興趣的第三基因，其中，感興趣的第三基因整合在染色體上。在一些實施方式中，感興趣的第三基因包含報告基因，選擇基因，治療意義的基因，輔助基因或其組合。在一些實施方式中，治療意義的基因包含編碼dte蛋白的基因。在一些實施方式中，感興趣的第三基因位于兩種rts之間。在一些實施方式中，感興趣的第三基因位于nl1基因座或nl2基因座內(nèi)。在一些實施方式中，感興趣的第三基因位于不同于nl1基因座或nl2基因座的基因座內(nèi)。在一些實施方式中，感興趣的第一基因、感興趣的第二基因和感興趣的第三基因位于三個單獨的基因座內(nèi)。在一些實施方式中，感興趣的第一基因、感興趣的第二基因和感興趣的第三基因中的至少一種位于nl1基因座內(nèi)，而第一基因、感興趣的第二基因和感興趣的第三基因中的至少一種位于nl2基因座內(nèi)。在一些實施方式中，細胞包含位點特異性重組酶基因。在一些實施方式中，位點特異性重組酶基因整合在染色體上。

4、在一些實施方式中，本公開提供了包含至少四種不同的rts的哺乳動物細胞，其中該細胞包含(a)至少兩種不同的rts，其在染色體上整合于nl1基因座或nl2基因座中；(b)感興趣的第一基因，其整合于(a)的至少兩種rts之間，其中感興趣的第一基因包含報告基因，編碼dte蛋白的基因，輔助基因或其組合；(c)和感興趣的第二基因，其整合于不同于(a)的基因座的第二染色體基因座內(nèi)，其中感興趣的第二基因包含報告基因，編碼dte蛋白的基因，輔助基因或其組合。

5、在一些實施方式中，本公開提供了包含至少四種不同的rts的哺乳動物細胞，其中該細胞包含(a)至少兩種不同的rts，其在染色體上整合于fer1l4基因座內(nèi)；(b)至少兩種不同的rts，其在染色體上整合于nl1基因座或nl2基因座內(nèi)；(c)感興趣的第一基因，其在染色體上整合于fer1l4基因座內(nèi)，其中感興趣的第一基因包含報告基因，編碼dte蛋白的基因，輔助基因或其組合；和(d)感興趣的第二基因，其在染色體上整合于(b)的nl1基因座或nl2基因座內(nèi)，其中感興趣的第二基因包含報告基因，編碼dte蛋白的基因，輔助基因或其組合。

6、在一些實施方式中，本公開提供了包含至少六種rts的哺乳動物細胞，其中該細胞包含(a)至少兩種不同的rts和感興趣的第一基因，其在染色體上整合于fer1l4基因座內(nèi)；(b)至少兩種不同的rts和感興趣的第二基因，其在染色體上整合于nl1基因座內(nèi)；和(c)至少兩種不同的rts和感興趣的第三基因，其在染色體上整合于nl2基因座內(nèi)。

7、在一些實施方式中，本公開提供了用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)者細胞的方法，其包括(a)提供包含至少四種不同的rts和編碼位點特異性重組酶的基因的細胞，其中至少兩種不同的rts在染色體上整合于nl1基因座內(nèi)而至少兩種不同的rts在染色體上整合于nl2基因座內(nèi)；(b)用第一載體和第二載體轉(zhuǎn)染(a)的細胞，所述第一載體包含編碼感興趣的第一基因的可交換盒(exchangeable?cassette)，而所述第二載體包含編碼感興趣的第二基因的可交換盒；(c)將第一可交換盒整合于nl1基因座內(nèi)并將第二可交換盒整合于nl2基因座內(nèi)；和(d)選擇包含整合到染色體中的第一可交換盒和第二可交換盒的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)者細胞。在一些實施方式中，感興趣的第一基因包含報告基因，選擇基因，治療意義的基因，輔助基因或其組合。在一些實施方式中，治療意義的基因包含編碼dte蛋白的基因。在一些實施方式中，dte蛋白包括fc融合蛋白，酶，膜受體，雙特異性t細胞接合物或單克隆抗體。在一些實施方式中，單克隆抗體是雙特異性單克隆抗體或三特異性單克隆抗體。在一些實施方式中，感興趣的第一基因位于兩種rts之間。在一些實施方式中，感興趣的第二基因包含報告基因，選擇基因，治療意義的基因，輔助基因或其組合。在一些實施方式中，治療意義的基因包含編碼dte蛋白的基因。在一些實施方式中，感興趣的第二基因位于兩種rts之間。

8、在一些實施方式中，本公開提供了用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)者細胞的方法，其包括(a)提供包含至少四種不同的rts和編碼位點特異性重組酶的基因的細胞，其中至少兩種不同的rts在染色體上整合于fer1l4基因座內(nèi)而至少兩種不同的rts在染色體上整合于nl1基因座或nl2基因座內(nèi)；(b)用第一載體和第二載體轉(zhuǎn)染(a)的細胞，所述第一載體包含編碼感興趣的第一基因的可交換盒，而所述第二載體包含編碼感興趣的第二基因的可交換盒；(c)將第一可交換盒整合于fer1l4基因座內(nèi)并將第二可交換盒整合于nl1基因座或nl2基因座內(nèi)；和(d)選擇包含整合到染色體中的第一可交換盒和第二可交換盒的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)者細胞。在一些實施方式中，感興趣的第一基因包含報告基因，選擇基因，治療意義的基因，輔助基因或其組合。在一些實施方式中，治療意義的基因包含編碼dte蛋白的基因。在一些實施方式中，dte蛋白由fc融合蛋白，酶，膜受體，雙特異性t細胞接合物或單克隆抗體組成。在一些實施方式中，單克隆抗體是雙特異性單克隆抗體或三特異性單克隆抗體。在一些實施方式中，感興趣的第一基因位于兩種rts之間。在一些實施方式中，感興趣的第二基因包含報告基因，選擇基因，治療意義的基因，輔助基因或其組合。在一些實施方式中，治療意義的基因包含編碼dte蛋白的基因。在一些實施方式中，感興趣的第二基因位于兩種rts之間。

9、在一些實施方式中，本公開提供了用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)者細胞的方法，其包括(a)提供包含至少六種不同的rts和編碼位點特異性重組酶的基因的細胞，其中至少兩種不同的rts在染色體上整合于fer1l4基因座內(nèi)，而至少兩種不同的rts在染色體上整合于nl1基因座內(nèi)，至少兩種不同的rts在染色體上整合于nl2基因座內(nèi)；(b)用第一載體、第二載體和第三載體轉(zhuǎn)染(a)的細胞，所述第一載體包含編碼感興趣的第一基因的可交換盒，所述第二載體包含編碼感興趣的第二基因的可交換盒，且所述第三載體包含編碼感興趣的第三基因的可交換盒；(c)將第一可交換盒整合于fer1l4基因座內(nèi)，第二可交換盒整合于nl1基因座內(nèi)，且第三可交換盒整合于nl2基因座內(nèi)；和(d)選擇包含整合到染色體中的第一可交換盒、第二可交換盒和第三可交換盒的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)者細胞。