本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)，尤其涉及一種子宮在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜類器官誘導(dǎo)惡變模型及其建立方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥）是指子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）在子宮腔被覆內(nèi)膜及子宮以外的部位出現(xiàn)、生長、浸潤，反復(fù)出血的一種慢性、炎癥性的婦科疾病，以卵巢型居多。約10%育齡期女性患有內(nèi)異癥，且有發(fā)病率逐漸增高的趨勢。內(nèi)異癥是多種上皮性卵巢癌的前體病變，與其中的子宮內(nèi)膜樣腺癌和透明細(xì)胞癌關(guān)系最為密切。內(nèi)異癥惡變?yōu)槁殉舶┡c多種高危因素有關(guān)，其中內(nèi)異癥相關(guān)卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生與雌激素的關(guān)系較為明確。既往文獻(xiàn)報(bào)道高濃度雌激素處理手術(shù)誘導(dǎo)的內(nèi)異癥大鼠模型8個(gè)月，可見3例（6.0%）表現(xiàn)為異位內(nèi)膜不典型增生伴在位內(nèi)膜單純性增生，2例（4.0%）表現(xiàn)為異位內(nèi)膜樣腺癌伴在位內(nèi)膜非典型增生，證明了高水平雌激素可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥惡變?yōu)樽訉m內(nèi)膜樣腺癌，同時(shí)在位內(nèi)膜也發(fā)生同步異常增生。

2、內(nèi)異癥及內(nèi)異癥惡變的基礎(chǔ)研究，一直受制于缺乏成熟異位內(nèi)膜細(xì)胞系模型，而內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜細(xì)胞原代培養(yǎng)難度較大，傳代更困難，難以滿足體外實(shí)驗(yàn)需求，常常不得已采用內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜原代細(xì)胞作為體外細(xì)胞模型，目前文獻(xiàn)報(bào)道，多以原代培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行傳代并進(jìn)行分子機(jī)制研究。因此，在內(nèi)異癥惡變的機(jī)制研究中常以在位內(nèi)膜原代基質(zhì)細(xì)胞惡性生物學(xué)行為變化來判斷相應(yīng)異位內(nèi)膜惡變趨勢的分子機(jī)制，難以觀察到惡變的直接形態(tài)學(xué)證據(jù)。而內(nèi)異癥及內(nèi)異癥惡變體內(nèi)模型常采用大鼠自體內(nèi)膜移植模型、人子宮內(nèi)膜裸鼠移植模型，而動(dòng)物模型常建立時(shí)間較長、不確定因素多、實(shí)驗(yàn)成本較大，且與人有種屬差異性，無法完全解釋人類內(nèi)異癥及內(nèi)異癥惡變的發(fā)生機(jī)制，因此現(xiàn)有的內(nèi)異癥體內(nèi)體外模型都具有明顯的局限性，導(dǎo)致內(nèi)異癥及其惡變基礎(chǔ)研究嚴(yán)重滯后。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種子宮在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜類器官誘導(dǎo)惡變模型及其建立方法和應(yīng)用，以解決傳統(tǒng)的原代內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞模型培養(yǎng)難度較大，傳代困難，難以滿足體外實(shí)驗(yàn)需求的問題。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種內(nèi)異癥類器官模型建立方法，包括：

3、提取內(nèi)異癥異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞和內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞；

4、根據(jù)內(nèi)異癥異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞和內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞，構(gòu)建配對的內(nèi)異癥異位內(nèi)膜類器官及內(nèi)異癥在位內(nèi)膜類器官；

5、對內(nèi)異癥異位內(nèi)膜類器官及內(nèi)異癥在位內(nèi)膜類器官進(jìn)行傳代；

6、利用高濃度雌激素對內(nèi)異癥異位內(nèi)膜類器官及內(nèi)異癥在位內(nèi)膜類器官進(jìn)行刺激。

7、進(jìn)一步地，提取內(nèi)異癥異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞和內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞，包括：

8、將手術(shù)室新鮮采集的內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜病灶組織和在位子宮內(nèi)膜組織放入無菌離心管中，其中有10mldmem/f12培養(yǎng)基，冰盒內(nèi)運(yùn)輸，保證6小時(shí)內(nèi)處理；

9、組織反復(fù)用無菌pbs溶液先后洗滌3次，剪去異位病灶中質(zhì)地較硬的纖維結(jié)締組織，無菌眼科剪分別剪碎異位內(nèi)膜病灶組織和在位子宮內(nèi)膜組織，粉碎至無明顯顆粒，分別加入提前配置好的10mg/ml膠原酶iv+1mg/mldna酶i消化液，37度消化40-60分鐘，至無明顯組織碎屑，分別加入等體積的含10%胎牛血清的dmem/f12完全培養(yǎng)基，中止消化后，經(jīng)過100μm細(xì)胞篩保留過濾液，離心5分鐘，1000rpm，保留細(xì)胞沉淀；

10、利用紅細(xì)胞裂解液1ml-2ml處理沉淀，2分鐘后，離心5min，1000rpm，去上清，保留細(xì)胞沉淀。

11、進(jìn)一步地，根據(jù)內(nèi)異癥異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞和內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞，構(gòu)建配對的內(nèi)異癥異位內(nèi)膜類器官及內(nèi)異癥在位內(nèi)膜類器官，包括：

12、計(jì)算提取的內(nèi)異癥異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞和內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞數(shù)目；去除上清液，用1ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，吹打均勻后取出5ul加入45ul臺盼藍(lán)染液中，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再次離心5分鐘，1000rpm；

13、選擇無菌24孔板，將兩組細(xì)胞分別以每孔1x105個(gè)細(xì)胞與30ul基質(zhì)膠混合的比例滴入24孔板中，構(gòu)建配對的內(nèi)異癥異位內(nèi)膜類器官及內(nèi)異癥在位內(nèi)膜類器官；

14、待膠滴固化后，每孔加37度預(yù)熱的子宮內(nèi)膜類器官培養(yǎng)基0.5ml，在含5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔3-4天換液一次。

15、進(jìn)一步地，所述子宮內(nèi)膜類器官培養(yǎng)基的成分及濃度如下：

16、主要成分包括：dmem/f12?+?谷氨酰胺?and?4-羥乙基哌嗪乙磺酸；

17、另添加如下成分：

18、重組人r-脊柱蛋白1????????????????500ng/ml；

19、重組人頭蛋白?????????????????????100ng/ml；

20、b27添加劑????????????????????????2%；

21、n-2添加劑????????????????????????1%；

22、glutamaxtm????????????????????????1%；

23、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒???????????????1%；

24、青霉素-鏈霉素-兩性霉素b混合溶液??1%；

25、煙酰胺???????????????????????????2mm；

26、a83-01???????????????????????????0.5μm；

27、n-乙?；?l-半胱氨酸??????????????2mm；

28、重組人表皮生長因子???????????????50ng/ml；

29、β重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子????2ng/ml；

30、重組人成纖維細(xì)胞因子10???????????10ng/ml；

31、sb202190?????????????????????????10μm；

32、y-27632?10???????????????????????μm。

33、進(jìn)一步地，每次根據(jù)所需量按所述子宮內(nèi)膜類器官培養(yǎng)基的成分及濃度配置子宮內(nèi)膜類器官培養(yǎng)基后，經(jīng)0.22μm針式過濾器過濾后保存，一周內(nèi)使用。

34、進(jìn)一步地，對內(nèi)異癥異位內(nèi)膜類器官及內(nèi)異癥在位內(nèi)膜類器官進(jìn)行傳代，包括：

35、觀察7-14天，當(dāng)類器官密度達(dá)70%-80%時(shí)進(jìn)行傳代，傳代比例為1：2-1：3，利用p3-p6代類器官進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

36、進(jìn)一步地，利用p3-p6代類器官進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，包括：

37、吸去基質(zhì)膠旁的培養(yǎng)基后，加入4℃預(yù)冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用抗黏附潤洗液潤洗后的槍頭吹碎膠滴，吹打數(shù)次后轉(zhuǎn)移至潤洗過的離心管中，4℃離心5分鐘，1500rpm，去除凈液體層和膠層；

38、加入5倍體積的37℃預(yù)熱的類器官傳代消化液，充分吹打，于37℃孵育5分鐘；

39、加入等體積的dmem/f12完全培養(yǎng)基終止消化，4℃離心3分鐘，1500rpm，加入dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基再次4℃離心3分鐘，1500rpm,獲得細(xì)胞沉淀；

40、取出對應(yīng)體積的已低溫下液化的基質(zhì)膠，按傳代比例于冰上重懸細(xì)胞沉淀，吹打均勻后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，膠滴固化后加入37℃預(yù)熱的子宮內(nèi)膜類器官培養(yǎng)基。

41、進(jìn)一步地，利用高濃度雌激素對內(nèi)異癥異位內(nèi)膜類器官及內(nèi)異癥在位內(nèi)膜類器官進(jìn)行刺激，包括：

42、使用dmso溶解雌激素制備濃度為10mm的雌激素儲存液，以1：1000的比例稀釋制備含10μm雌二醇的子宮內(nèi)膜類器官培養(yǎng)基，每3-4天換液，持續(xù)刺激4周；對照組用同樣濃度dmso處理。

43、第二方面，本發(fā)明提供一種以上所述的內(nèi)異癥類器官模型建立方法建立的內(nèi)異癥類器官模型。

44、第三方面，本發(fā)明提供一種內(nèi)異癥類器官模型在獲得向卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌變化的趨勢上的應(yīng)用。

45、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的子宮在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜類器官誘導(dǎo)惡變模型及其建立方法和應(yīng)用，提供了一種具有向子宮內(nèi)膜樣腺癌惡變趨勢的內(nèi)異癥類器官模型，利用高濃度雌激素持續(xù)刺激的方法，可使得內(nèi)異癥類器官具有一定的細(xì)胞核異質(zhì)性，且從單層上皮結(jié)構(gòu)發(fā)展為增殖狀復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)，為內(nèi)異癥惡變?yōu)樽訉m內(nèi)膜樣腺癌的病理過程提供一個(gè)構(gòu)建方便、便于觀察、可長期培養(yǎng)的細(xì)胞模型，對后續(xù)內(nèi)異癥惡變?yōu)樽訉m內(nèi)膜樣腺癌的機(jī)制研究、探究卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生的早期階段的關(guān)鍵分子有著重要的科學(xué)意義。