本發(fā)明涉及與作為afp-l3的核心組分的α-1,6-核心-巖藻糖基化的甲胎蛋白(afp)特異性結(jié)合的單克隆抗體和抗原結(jié)合片段。因此，本文提供的抗體和抗原結(jié)合片段也可以稱為afp-l3抗體。還提供了編碼本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段的多核苷酸、表達(dá)本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段的宿主細(xì)胞、用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段的方法以及本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段的用途。本文還提供了促進(jìn)本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段與α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp的結(jié)合的預(yù)處理劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段以及任選的本發(fā)明的預(yù)處理劑的試劑盒。

背景技術(shù)：

1、在世界范圍內(nèi)，肝癌是第七大常見癌癥和第二大癌癥死亡原因。

2、肝細(xì)胞癌(hcc)是世界范圍內(nèi)發(fā)生的原發(fā)性肝癌的主要組織學(xué)類型，占總負(fù)擔(dān)的70％至85％。已知諸如肝纖維化和肝硬化的基礎(chǔ)肝病是hcc發(fā)展的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。對(duì)于早期診斷的患者，可以通過切除、肝移植或射頻局部消融來治療hcc。因此，對(duì)于hcc而言，早期檢測(cè)和微創(chuàng)篩選方法至關(guān)重要。

3、用于診斷hcc的最常見方法是超聲檢測(cè)、諸如計(jì)算機(jī)軸向斷層掃描(cat掃描)或磁共振成像(mri)的成像技術(shù)以及血清學(xué)生物標(biāo)志物。然而，超聲檢測(cè)的預(yù)后價(jià)值差，因?yàn)樗枰辽?cm的腫瘤塊，并且成像技術(shù)對(duì)基于每個(gè)病灶的敏感性差且成本高。另一方面，近年來，已經(jīng)非常關(guān)注發(fā)現(xiàn)新的血液生物標(biāo)志物，這些新的血液生物標(biāo)志物可以用于高?；颊咧衕cc的早期檢測(cè)的監(jiān)測(cè)項(xiàng)目(yang?jd.detect?or?not?to?detect?very?early?stagehepatocellular?carcinoma？the?western?perspective.clin?mol?hepatol.2019；25(4):335-43)。

4、目前的一些醫(yī)療指南建議每6個(gè)月使用超聲或其他成像方式對(duì)高?；颊哌M(jìn)行監(jiān)測(cè)。然而，成像方法的局限性包括對(duì)早期腫瘤的敏感性差、對(duì)操作者依賴性以及在患有肥胖或非酒精性脂肪性肝炎的患者中的質(zhì)量較低。

5、甲胎蛋白(afp)是目前最成熟的針對(duì)肝細(xì)胞癌(hcc)的生物標(biāo)志物。然而，afp對(duì)hcc診斷、尤其是早期hcc診斷的敏感性和特異性仍需進(jìn)一步提高。

6、afp是一種糖蛋白，并且已經(jīng)描述了afp的各種糖基化形式。特別地，afp在天冬酰胺251處被n-糖基化。凝集素可以用于糖蛋白的分析。通過利用凝集素對(duì)糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)的選擇性結(jié)合能力，可以分離和濃縮具有特定糖鏈結(jié)構(gòu)的標(biāo)志物糖蛋白級(jí)分。就afp而言，源自扁豆凝集素-a(lca)的凝集素已被廣泛使用。通過使用lca，afp可以分級(jí)為三種變體l1、l2和l3，其中afp-l3對(duì)lca具有最高的親和力。afp-l3級(jí)分由在asn-251處用包含α-1,6-核心-巖藻糖基化的n-聚糖進(jìn)行n-糖基化的afp構(gòu)成(即，具有與n-乙酰葡糖胺(glcnac)結(jié)合的巖藻糖的afp，它經(jīng)由α-1,6鍵位于n型糖鏈的還原末端)。因此，由于afp-l3由α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp構(gòu)成，所以術(shù)語afp-l3和α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp在本文中可互換使用。甲胎蛋白(afp-l3)的扁豆凝集素(lca)反應(yīng)級(jí)分在患有hcc的患者中特異性增加(khien?vv等人,the?international?journal?of?biological?markers.2001；16(2):105-111)。

7、最近的出版物明確指出，包含輸入變量性別、年齡、afp和脫羧基凝血酶原(dcp＝pivka-ii)(＝gaad-分?jǐn)?shù))或性別、年齡、afp、afp-l3和脫羧基凝血酶原(dcp＝pivka-ii)(＝galad-分?jǐn)?shù))的分?jǐn)?shù)可以并且將會(huì)改善hcc篩選工作的結(jié)果，以及尤其是早期hcc的檢測(cè)(zhou,j-m.,wang,t.,zhang,k-h.afp-l3?for?the?diagnosis?of?early?hepatocellularcarcinoma,medicine?2021；100(43):p?e27673)。

8、因此，非常需要可靠地檢測(cè)和量化afp-l3。

9、μtaswako?afp-l3測(cè)定(fujifilm?wako是目前最廣泛使用的檢測(cè)和量化afp-l3的方法。該測(cè)定基于親和毛細(xì)管電泳，使用lca分離afp-l3。然而，這種方法有一定的缺點(diǎn)。首先，n-聚糖分支可能導(dǎo)致檢測(cè)到錯(cuò)誤的afp-l3水平。其次，該方法繁瑣且需要特殊儀器。因此，非常期望設(shè)計(jì)基于抗體的方法(egashira?y等人,scientific?reports,2019,9:12359)。第三，凝集素的特異性不如抗體，并且通常僅表現(xiàn)出較低的結(jié)合親和力。

10、jp?s63-307900公開了一種抗體，其與和lca結(jié)合的afp(afp-lca-r)結(jié)合，但不與不和lca結(jié)合的afp(afp-lca-nr)結(jié)合。然而，該抗體的表位尚不清楚，并且不清楚該抗體是否也識(shí)別具有相同糖部分的afp以外的蛋白質(zhì)。

11、ep?3?252?073、us2018/0110889和egashira?y等人(scientific?reports,2019,9:12359)公開了針對(duì)核心-巖藻糖基化的afp(即afp-l3)的單克隆抗體，其以核心-巖藻糖依賴性方式結(jié)合并且還結(jié)合afp肽主鏈的部分。然而，如本領(lǐng)域眾所周知的，并且如egashira?y等人(scientific?reports,2019,9:12359)所述，大多數(shù)抗碳水化合物抗體對(duì)其抗原的親和力低。雖然抗體fasmab的親和力被描述為比典型的抗碳水化合物抗體更強(qiáng)，但kd值僅為6.5x?10-7m。通常，用于全自動(dòng)免疫測(cè)定(諸如測(cè)定(roche))的抗體的kd值顯著較低(例如，在低納摩爾范圍內(nèi))，即對(duì)afp-l3具有更高的親和力。

12、因此，需要提供與α-1,6-核心-巖藻糖基化的甲胎蛋白(即afp-l3)特異性結(jié)合的新型抗體，其具有改善的動(dòng)力學(xué)特性，特別是具有更高的親和力(即更低的kd)。此外，需要提供改進(jìn)的用于檢測(cè)afp-l3的免疫測(cè)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段以及其用途解決了上述需求。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種與α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp或afp的包含所述α-1,6-核心-巖藻糖基化的部分序列特異性結(jié)合的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

3、本文提供的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段以高特異性區(qū)分α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp(本文也稱為核心-巖藻糖基化的afp和1,6fucafp)與相關(guān)結(jié)構(gòu)。首先，本文提供的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段可以區(qū)分α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp與缺乏α-1,6-核心-巖藻糖殘基的afp(即非糖基化afp或具有缺乏α-1,6-核心-巖藻糖殘基的n-聚糖的afp)。其次，本文提供的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段可以區(qū)分α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp與帶有α-1,6-核心-巖藻糖殘基的游離n-聚糖。第三，本文提供的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段區(qū)分α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp與包含n-糖基化位點(diǎn)n-251的非糖基化afp肽?；谶@種結(jié)合行為，可以得出結(jié)論：抗體及其抗原結(jié)合片段結(jié)合α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp依賴于α-1,6-核心-巖藻糖基化和afp肽序列(例如，seq?id?no:2)二者的存在。因此，本文提供的抗體和抗原結(jié)合片段對(duì)α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp具有特異性，并且不顯著識(shí)別(i)具有相似的α-1,6-核心-巖藻糖基化的n-聚糖結(jié)構(gòu)的其他蛋白質(zhì)和(ii)缺乏α-1,6-核心-巖藻糖殘基的afp或其部分序列。

4、憑借這種特異性，本文提供的抗體和抗原結(jié)合是用于在免疫測(cè)定中檢測(cè)樣品中α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp(臨床上相當(dāng)于afp-l3)的水平的有價(jià)值的工具。因此，抗體和抗原結(jié)合片段以及使用它們的免疫測(cè)定可以幫助檢測(cè)hcc，特別是早期hcc。

5、本文提供的抗體和抗原結(jié)合片段顯示出對(duì)α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp的驚人的高親和力，如本文通過分析與α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp肽的結(jié)合所例證的。用于這種相互作用測(cè)量的kd在個(gè)位數(shù)納摩爾范圍內(nèi)，即，比基于現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)這種afp糖肽抗體的教導(dǎo)所預(yù)期的kd低幾個(gè)數(shù)量級(jí)(egashira?y等人,scientific?reports,2019,9:12359)。egashira?y等人已經(jīng)報(bào)道了針對(duì)α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp的抗體的親和力為650nm，該親和力具有驚人地低kd(即高結(jié)合親和力)，這強(qiáng)調(diào)了可以鑒定具有本文報(bào)道的親和力的抗體的意外發(fā)現(xiàn)。

6、有趣的是，本文鑒定的兩種最好的單克隆抗體，即克隆19b12和3c5，顯示出非常高的序列同源性，還尤其是在cdr殘基中。cdr殘基總共有3個(gè)氨基酸差異：一個(gè)插入和兩個(gè)氨基酸取代。

7、因此，在實(shí)施例中，根據(jù)本公開的第一方面的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段包含

8、(i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)，該vh包含：cdr-h1，其具有seq?id?no:3(19b12和3c5的cdr-h1)或其經(jīng)一個(gè)氨基酸取代修飾的變體的氨基酸序列；cdr-h2，其具有seq?id?no:4或5(分別為19b12和3c5的cdr-h2)或seq?id?no:4或5的經(jīng)至多兩個(gè)氨基酸取代修飾的變體的氨基酸序列；和cdr-h3，其具有seq?id?no:6(19b12和3c5的cdr-h3)或其經(jīng)一個(gè)氨基酸取代修飾的變體的氨基酸序列；以及

9、(ii)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)，該vl包含：cdr-l1，其具有seq?id?no:7或8(分別為19b12和3c5的cdr-l1)或seq?id?no:7或8的經(jīng)至多兩個(gè)氨基酸取代修飾的變體的氨基酸序列；cdr-l2，其具有seq?id?no:9(19b12和3c5的cdr-l2)或其經(jīng)一個(gè)氨基酸取代修飾的變體的氨基酸序列；和cdr-l3，其具有seq?id?no:10(19b12和3c5的cdr-l3)或其經(jīng)一個(gè)氨基酸取代修飾的變體的氨基酸序列。

10、在第二方面，本發(fā)明提供了一種多核苷酸，其編碼

11、(i)根據(jù)第一方面的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和/或

12、(ii)根據(jù)第一方面的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段的輕鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。

13、在第三方面，公開了一種包含根據(jù)本發(fā)明第二方面的多核苷酸的載體。

14、根據(jù)本發(fā)明第四方面，本文提供了一種包含第二方面的多核苷酸或第三方面的載體的宿主細(xì)胞。

15、在第五方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生根據(jù)第一方面的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段的方法，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)第四方面的宿主細(xì)胞以及分離所述抗體或抗原結(jié)合片段。還公開了通過此類方法獲得的或可獲得的抗體。

16、根據(jù)第六方面，提供了一種組合物，其包含根據(jù)第一方面的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段、根據(jù)第二方面的多核苷酸、根據(jù)第三方面的載體或根據(jù)第四方面的宿主細(xì)胞。

17、在第六方面的實(shí)施例中，提供了一種包含根據(jù)本發(fā)明第一方面的抗體的診斷組合物。

18、本發(fā)明人已經(jīng)使用本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段生成了用于確定α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp的水平的免疫測(cè)定。用該測(cè)定確定的α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp的水平與用μtaswako?afp-l3測(cè)定確定的水平非常相關(guān)，后者是目前用于檢測(cè)和量化afp-l3的最廣泛使用的方法。因此，使用本發(fā)明的抗體的免疫測(cè)定是高度可靠的工具，例如有助于hcc檢測(cè)，克服了μtaswako?afp-l3的缺點(diǎn)。

19、因此，在第七方面，本發(fā)明涉及第一方面的抗體或抗原結(jié)合片段用于體外免疫測(cè)定、特別是用于檢測(cè)α-1,6-核心-巖藻糖基化的甲胎蛋白(afp)或afp-l3的體外免疫測(cè)定的用途。

20、類似地，本發(fā)明的第八方面涉及一種用于使用根據(jù)第一方面的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段來檢測(cè)樣品中的α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp或包含所述α-1,6-核心-巖藻糖基化的部分afp序列的體外免疫測(cè)定方法。

21、本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)預(yù)處理(例如，使用還原劑)可以改善在此類免疫測(cè)定中獲得的信號(hào)，這表明本文提供的抗體和抗原結(jié)合片段識(shí)別的表位在此類預(yù)處理后更容易接近。

22、因此，在本文的第九方面中還提供了一種包括還原劑(例如，dtt)的預(yù)處理劑或預(yù)處理組合物。

23、在第十方面，本發(fā)明提供了一種部件的試劑盒，其包括本發(fā)明的第一方面的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段。在實(shí)施例中，試劑盒用于檢測(cè)和/或量化α-1,6-核心-巖藻糖基化的afp的免疫測(cè)定。在實(shí)施例中，試劑盒進(jìn)一步包括本發(fā)明的第九方面的預(yù)處理劑或組合物。