本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種與煙草β胡蘿卜素基因qbcar緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、煙草是一種葉用經(jīng)濟(jì)作物，煙葉中含有多種化學(xué)元素，目前已鑒定的化學(xué)成分達(dá)3000種以上，但隨著氣相色譜(gc)、液相色譜(lc)、氣相色譜-質(zhì)譜(gc-ms)、液相色譜-質(zhì)譜(lc-ms)、紅外光譜(ir)、核磁共振(nmr)及高分辨率質(zhì)譜等現(xiàn)代分離分析儀器在煙草研究中的應(yīng)用，將使曾經(jīng)被掩蓋的微量成分被揭示出來，進(jìn)而使煙葉化學(xué)成分?jǐn)?shù)量急劇增加。作為卷煙工業(yè)基礎(chǔ)的煙葉原料，其品質(zhì)的好壞直接影響卷煙成品質(zhì)量。而煙葉品質(zhì)是其葉片內(nèi)多種化學(xué)成分綜合作用的結(jié)果，因此，煙葉化學(xué)成分是煙葉品質(zhì)鑒定的重要指標(biāo)，也是外觀質(zhì)量和內(nèi)在質(zhì)量在外觀特征和煙氣特征上的表現(xiàn)。

2、迄今，針對煙葉化學(xué)成分的研究主要集中在煙葉化學(xué)成分的鑒定及主要化學(xué)成分與評吸質(zhì)量、外觀質(zhì)量、物理特性和安全性等方面的密切關(guān)聯(lián)，而針對煙葉化學(xué)成分的遺傳分析及基因/qtl定位研究很少。julio等(e.julio,b.denoyes-rothan,j.-l.verrier,f.dorlhac?de?borne,detection?of?qtls?linked?to?leaf?and?smoke?properties?innicotiana?tabacum?based?on?a?study?of?114recombinant?inbred?lines.molbreeding,2006,doi?10.1007/s11032-006-9019-0)是最早利用aflp、issr、ssap和scar標(biāo)記在分子水平上開展煙葉化學(xué)成分基因/qtl定位研究的，其對總植物堿、煙堿(尼古丁)、降煙堿、假木賊堿、檸檬酸和蘋果酸等6種煙葉化學(xué)成分進(jìn)行了初步基因/qtl分析。但該基因/qtl定位分析的結(jié)果卻是不完整且不準(zhǔn)確的，主要原因為：首先，julio等(2006)用于基因/qtl定位分析的煙草遺傳連鎖圖譜質(zhì)量較低，僅由184個標(biāo)記構(gòu)建了18個連鎖群，尚未達(dá)到煙草的24條染色體(連鎖群)完整要求；其次，其僅獲得了與上述6種煙葉化學(xué)成分連鎖的單側(cè)標(biāo)記，未能獲得與目標(biāo)基因/qtl(6種煙葉化學(xué)成分)連鎖的兩側(cè)標(biāo)記進(jìn)行有效定位；最后，獲得的單側(cè)連鎖標(biāo)記與目標(biāo)基因/qtl間的遺傳距離較大，導(dǎo)致基因/qtl定位結(jié)果的準(zhǔn)確性不高。緊接著，肖炳光等(肖炳光，盧秀萍，焦芳嬋，李永平，孫玉合，郭兆奎，烤煙幾種化學(xué)成分的qtl初步分析.作物學(xué)報，2008，34(10)：1762-1769.)利用11個issr標(biāo)記和158個rapd標(biāo)記構(gòu)建獲得含有27條連鎖群的低質(zhì)量煙草遺傳連鎖圖譜，對總糖、煙堿和氧化鉀等3個煙葉化學(xué)成分進(jìn)行基因/qtl分析。隨后，蔡長春等(蔡長春，柴利廣，王毅，徐芳森，張俊杰，林國平，白肋煙分子標(biāo)記遺傳圖譜的構(gòu)建及部分性狀的遺傳剖析.作物學(xué)報，2009，35(9)：1646-1654.)、李麗華等(李麗華，陳美霞，周東新，陳順輝，陶愛芬，李延坤，馬紅勃，祁建民，郭玉春，煙草六個重要性狀的qtl定位.作物學(xué)報，2011，37(9)：1577-1584.)和劉穎超等(劉穎超，方敦煌，徐海明，童治軍，肖炳光，煙草生物堿性狀的qtl定位.作物學(xué)報，2024，50(1)：42-54)分別利用aflp和srap標(biāo)記，issr和srap標(biāo)記及snp標(biāo)記構(gòu)建的較少標(biāo)記數(shù)量低質(zhì)量煙草遺傳連鎖圖譜，對煙堿(尼古丁)、總氮、總糖、總氯、總鉀、總植物堿、降煙堿、假木賊堿和新煙草堿等9個煙葉化學(xué)成分進(jìn)行了基因/qtl分析，但定位分析結(jié)果的準(zhǔn)確性仍較低。

3、而針對煙草β胡蘿卜素的qtl定位分析研究，迄今尚未見報道。故此，對煙草β胡蘿卜素性狀遺傳研究與定位分析的空白，嚴(yán)重地制約了利用與煙草β胡蘿卜素基因qbcar緊密連鎖標(biāo)記開展高含量β胡蘿卜素?zé)煵菪缕贩N的選育進(jìn)程。

4、鑒于此，本發(fā)明首先以優(yōu)質(zhì)烤煙品種y3(烤后煙葉中具有高含量的煙草β胡蘿卜素，含基因qbcar)和主栽烤煙品種k326(烤后煙葉中不含煙草β胡蘿卜素)為親本，通過雜交、連續(xù)套袋自交，構(gòu)建一個含有269份株系的煙草重組自交系(rils_f8:9)為作圖群體；其次，利用本實驗室基于優(yōu)質(zhì)烤煙品種y3基因組信息開發(fā)的大規(guī)模ssr分子標(biāo)記對269個rils_f8:9株系進(jìn)行基因型分析，構(gòu)建獲得1張高質(zhì)量煙草ssr分子遺傳連鎖圖譜，該圖譜含有2059個ssr標(biāo)記且較均勻分布于煙草24條連鎖群上，覆蓋全基因組長度為1759.74cm；再次，待煙草成熟采烤后，利用高效液相色譜(hplc)法對烘烤后的c3f級別中部煙葉進(jìn)行β胡蘿卜素含量檢測；最后，利用數(shù)量性狀連鎖分析(qtl)法并結(jié)合rils_f8:9的基因型數(shù)據(jù)(遺傳連鎖圖譜)和表型數(shù)據(jù)(煙草β胡蘿卜素含量值)，在煙草全基因組范圍內(nèi)篩選獲得與β胡蘿卜素基因qbcar緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記，既有效填補(bǔ)了國內(nèi)外關(guān)于煙草β胡蘿卜素性狀qtl定位分析的空白，又獲得與煙草β胡蘿卜素基因qbcar緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記，是精準(zhǔn)、高效利用分子標(biāo)記輔助選擇(mas)培育高β胡蘿卜素含量烤煙新品種的重要途徑。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明正是為了解決煙草β胡蘿卜素性狀qtl定位分析的空白，提供一種與煙草β胡蘿卜素基因qbcar緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記及應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一目的在于提供一種與煙草β胡蘿卜素基因qbcar緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記；第二目的在于將上述共顯性ssr標(biāo)記應(yīng)用于檢測煙草基因組dna中是否存在煙草β胡蘿卜素基因qbcar及待測植株中的煙草β胡蘿卜素的基因型狀態(tài)。

3、本發(fā)明的創(chuàng)新點：本發(fā)明首次針對煙草β胡蘿卜素基因qbcar進(jìn)行遺傳與定位分析。本發(fā)明人的研究表明，煙草β胡蘿卜素屬于典型的數(shù)量性狀，且受烤煙品種y3基因組內(nèi)第2條染色體的qtl控制，該基因/qtl被暫命名為qbcar。

4、本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)。

5、一種與煙草β胡蘿卜素基因qbcar緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記，本發(fā)明所述的與煙草β胡蘿卜素基因qbcar緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記的編號為tmy80084和tmy81298，其pcr擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列分別為seq?id?no.1和seq?id?no.2、seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。

6、seq?id?no.1：

7、aatgaagggcaatgcaagacatagttgaatgtatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatagtaaatttaacattttccccttctttaattagcagtcgtgttagttagttgagccactcacgtagtcaattgaaagactagttgattgatacttagtcatttatatttacatatggaagatgaaaatttgttccttcaagattggaggtcaggcatttgtctgccctaaactccc。

8、seq?id?no.2：

9、aatgaagggcaatgcaagacatagttgaatgtatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatagtaaatttaacattttccccttctttaattagcagtcgtgttagttagttgagccactcacgtagtcaattgaaagactagttgattgatacttagtcatttatatttacatatggaagatgaaaatttgttccttcaagattggaggtcaggcatttgtctgccctaaactccc。

10、seq?id?no.3：

11、gaagagcccaaatgtcgaagaaaccgaaccataccgatgcaagccgaagtgtgcccactagcatcaaccaccatcctaacagctccatcgctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctcacacacacacacacacacacacacacacagagttactttttctgttttctccctctgttttcatttttcaaccactaaatagtaaggggccgataaacatgcccattgaccc。

12、seq?id?no.4：

13、gggtcaatgggcatgtttatcggccccttactatttagtggttgaaaaatgaaaacagagggagaaaacagaaaaagtaactctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagcgatggagctgttaggatggtggttgatgctagtgggcacacttcggcttgcatcggtatggttcggtttcttcgacatttgggctcttc。

14、本發(fā)明所述共顯性標(biāo)記tmy80084和tmy81298位于目的基因qbcar兩側(cè)。

15、本發(fā)明所述的分子標(biāo)記所對應(yīng)的2個位點的引物序列分別為：

16、擴(kuò)增tmy80084的引物序列為：

17、tmy80084f：5’-aatgaagggcaatgcaagac-3’(seq?id?no.5)，

18、tmy80084r：5’-gggagtttagggcagacaaa-3’(seq?id?no.6)；

19、擴(kuò)增tmy81298的引物序列為：

20、tmy81298f：5’-gaagagcccaaatgtcgaag-3’(seq?id?no.7)，

21、tmy81298r：5’-gggtcaatgggcatgtttat-3’(seq?id?no.8)。

22、上述的與煙草β胡蘿卜素基因qbcar緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記的應(yīng)用在于檢測煙草基因組dna中是否存在煙草β胡蘿卜素基因qbcar及待測植株中的煙草β胡蘿卜素的基因型狀態(tài)。

23、本發(fā)明上述的應(yīng)用，該應(yīng)用的方法為，以tmy80084和tmy81298序列的引物分別擴(kuò)增待檢測煙草基因組dna，檢測pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

24、本發(fā)明pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中同時含有如seq?id?no.1和seq?id?no.3所示序列則表明該待測煙草植株存在高含量煙草β胡蘿卜素的純合等位基因，基因型為bcarbcar。

25、本發(fā)明pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中同時含有如seq?id?no.2和seq?id?no.4所示序列則為待測煙草植株無煙草β胡蘿卜素含量的純合等位基因，基因型為bcarbcar。

26、本發(fā)明pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中同時含有如seq?id?no.1和seq?id?no.4所示序列，或同時含有如seq?id?no.2和seq?id?no.3所示序列則為待測煙草植株存在中等含量煙草β胡蘿卜素的雜合等位基因，基因型為bcarbcar。

27、為了簡捷高效選擇具有高β胡蘿卜素含量潛力的煙草品種，本發(fā)明有針對性地選擇含煙草β胡蘿卜素基因qbcar的后代材料，可用于煙草β胡蘿卜素基因qbcar的輔助選擇，以提高分子標(biāo)記輔助選擇的效率及高含量β胡蘿卜素?zé)煵萜贩N選育的效率。利用本發(fā)明提供的2個與煙草β胡蘿卜素基因qbcar緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記，不僅可用于定性檢測任何生育期的煙草基因組dna中是否存在煙草β胡蘿卜素基因qbcar，還可以清晰、精準(zhǔn)鑒別待測植株中的煙草β胡蘿卜素的基因型狀態(tài)(即，具有最高含量值且穩(wěn)定遺傳的純合基因型bcarbcar、具有中等含量值且遺傳不能穩(wěn)定的雜合基因型bcarbcar、無含量值且穩(wěn)定遺傳的純合基因型bcarbcar)，進(jìn)而既提高了具有高β胡蘿卜素含量烤煙新品種選育的科學(xué)性、可預(yù)測性，又加速了育種進(jìn)程。

28、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

29、1、填補(bǔ)了國內(nèi)外關(guān)于煙草β胡蘿卜素基因qbcar遺傳與定位研究的空白。

30、2、清晰、精準(zhǔn)檢測煙草β胡蘿卜素的基因型狀態(tài)

31、提供了用于檢測煙草β胡蘿卜素基因qbcar的分子標(biāo)記，既可精準(zhǔn)確定待測煙草中是否含有煙草β胡蘿卜素，又可清晰的鑒別出待測煙草植株中的β胡蘿卜素的基因型狀態(tài)。

32、3、檢測方法高效、穩(wěn)定、可靠，且操作簡捷和低成本

33、與現(xiàn)有的采用低通量、高成本、耗時費(fèi)力的hplc法檢測成熟且烘烤后的煙草β胡蘿卜素含量相比，本發(fā)明所述的共顯性ssr標(biāo)記具有高效、穩(wěn)定、可靠、簡捷和低成本的特點。

34、4、不限檢測時機(jī)

35、本方法可在煙草生長的任何時期進(jìn)行檢測，尤其是在煙草幼苗期的檢測，可極大的縮短了實驗周期，進(jìn)而加速了選育高β胡蘿卜素含量的烤煙新品種進(jìn)程。

36、下面結(jié)合附圖和具體實施方式本發(fā)明做進(jìn)一步解釋。