本發(fā)明屬于免疫治療，尤其涉及一種多價的溶酶體靶向嵌合體及其在蛋白降解和免疫治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、免疫檢查點(diǎn)阻斷治療是腫瘤免疫治療的主要手段，已有多種抗體藥物在臨床上應(yīng)用，但是現(xiàn)有的免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的實(shí)際臨床響應(yīng)率較低，需要開發(fā)高效且安全的免疫檢查點(diǎn)阻斷藥物。

2、近年研究表明，pdl1除了具有免疫檢查點(diǎn)的功能外，其跨膜結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)部分還會廣泛參與到腫瘤細(xì)胞的生長、增殖以及轉(zhuǎn)移等相關(guān)信號通路中，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，因此單單通過抗體等手段阻斷pdl1的免疫檢查點(diǎn)功能，僅能在一定程度上實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫治療的目標(biāo)。目前有幾種下調(diào)腫瘤細(xì)胞表面pdl1表達(dá)水平的策略，例如基于pdl1表達(dá)的信號通路，通過引入一些小分子抑制劑來減少pdl1的表達(dá)，但這種策略僅能干擾其中一條表達(dá)通路，腫瘤細(xì)胞可能通過其他代償性通路來增加pdl1的表達(dá)，導(dǎo)致難以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的pdl1下調(diào)效果。除了干擾pdl1表達(dá)的策略，還可以通過沉默pdl1相關(guān)基因來實(shí)現(xiàn)pdl1的下調(diào)，比如使用sirna或者基因編輯工具crispr等等來實(shí)現(xiàn)pdl1基因的沉默，但是這種涉及基因編輯的策略在實(shí)操上，仍然面臨遞送效率低等問題，導(dǎo)致其不能被廣泛應(yīng)用。

3、近年來，隨著新興技術(shù)的發(fā)展，蛋白降解靶向嵌合體(protac)結(jié)構(gòu)獲得廣泛關(guān)注。protac分子的兩端分別識別靶標(biāo)蛋白和e3泛素連接酶，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)蛋白和e3泛素連接酶的連接，通過一系列生物學(xué)過程，靶標(biāo)蛋白上被標(biāo)記上泛素標(biāo)簽，從而被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體識別，進(jìn)一步被蛋白酶體降解。由于泛素化過程主要發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，這種策略對于膜蛋白的降解效果有限。

4、針對于膜蛋白的降解，美國化學(xué)家carolyn?bertozzi教授在2020年首創(chuàng)性開發(fā)一種溶酶體靶向嵌合體(lytac)技術(shù)，其一端通過抗體靶向目標(biāo)蛋白，另一端通過寡糖肽基團(tuán)靶向陽離子非依賴性甘露糖6-磷酸受體(ci-m6pr)。這種溶酶體靶向嵌合體可與靶標(biāo)膜蛋白和溶酶體穿梭受體連接形成三元復(fù)合物，并通過ci-m6pr的溶酶體穿梭活動進(jìn)一步地介導(dǎo)靶標(biāo)膜蛋白至溶酶體中發(fā)生徹底降解，從而達(dá)到下調(diào)細(xì)胞膜上靶標(biāo)蛋白水平的效果。

5、另外，現(xiàn)有技術(shù)主要聚焦于新型分子工具的開發(fā)和在細(xì)胞層面的應(yīng)用，在生物體層面和實(shí)際應(yīng)用中尚未實(shí)踐和推廣，現(xiàn)有技術(shù)的難點(diǎn)在于工藝難度大、生物體內(nèi)穩(wěn)定性和安全性隱患、生產(chǎn)成本高、降解效率不穩(wěn)定等方面。

6、目前現(xiàn)有技術(shù)中，lytac分子的使用會受到連接穩(wěn)定性、結(jié)合效率等的限制，影響降解效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種多價的溶酶體靶向嵌合體(lytac)，其中含有靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)和靶向溶酶體穿梭受體的配體結(jié)構(gòu)，且一個靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)連接不止一個配體結(jié)構(gòu)，這種多價的蛋白降解劑在體內(nèi)穩(wěn)定性更好，降解效率更高。

2、本發(fā)明的第一個目的是提供一種多價的溶酶體靶向嵌合體，包括以下任一種結(jié)構(gòu)：通過連接分子連接的靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)和溶酶體穿梭受體識別結(jié)構(gòu)，且所述溶酶體穿梭受體識別結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)的摩爾比n>1。

3、進(jìn)一步地，所述1<n≤15。

4、進(jìn)一步地，所述溶酶體穿梭受體識別結(jié)構(gòu)或靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)通過柔性鏈段或直接與連接分子連接。

5、進(jìn)一步地，所述連接分子為在腫瘤微環(huán)境中不可降解的分子。

6、進(jìn)一步地，所述連接分子含有以下結(jié)構(gòu)中的至少一種：酰胺鍵、三唑環(huán)、硫醚鍵、二硫鍵。

7、進(jìn)一步地，所述連接分子含有如下結(jié)構(gòu)中的至少一種：

8、

9、進(jìn)一步地，所述靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)包括pdl1抗體、her2抗體、血小板源性生長因子抗體、蛋白酪氨酸激酶7抗體、間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子抗體、g蛋白偶聯(lián)受體65抗體、cd47抗體、cd71抗體、egfr抗體、abcg2抗體等。

10、進(jìn)一步地，所述靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)選自市售或自制的單克隆或多克隆抗體。

11、進(jìn)一步地，所述溶酶體穿梭受體識別結(jié)構(gòu)包括ci-m6pr核酸適體、asgpr核酸適體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(cd71)核酸適體、多聚寡核苷酸中的一種或幾種。

12、優(yōu)選地，所述ci-m6pr核酸適體選自如下序列中的一種或幾種：

13、5’-gggcgcgtagatgacgagcagtcctaacatcgtttaggac-3’

14、(seq?id?no.1)；

15、5’-ggggaggcgattcggtgtgtcctccagaagatatttccga-3’

16、(seq?id?no.2)；

17、5’-cgggcacggatggagtcgttgcaggggcccttccccttgg-3’

18、(seq?id?no.3)；

19、5’-ccgaccgtgaccagacaaacgtttgagtaggcgcccgaca-3’(seq?id?no.4)；

20、所述asgpr核酸適體為如下序列：

21、5’-uugauugcgugucaaucauggcguaguaaaagacaaguagcu?acgaggucauguguauguuggggauuaggaccugauugaguucagc?ccacauac-3’(seq?id?no.5)。

22、進(jìn)一步地，所述多價的溶酶體靶向嵌合體的結(jié)構(gòu)包括但不限于如下所示結(jié)構(gòu)中的任一種：

23、

24、其中，x為靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)，r1、r2為柔性鏈段，y為溶酶體穿梭受體識別結(jié)構(gòu)。

25、其中，r1和r2獨(dú)立地選自peg、碳鏈或堿基鏈。

26、本發(fā)明的第二個目的是提供上述多價的溶酶體靶向嵌合體在制備蛋白降解劑或制備免疫治療藥物中的應(yīng)用。

27、進(jìn)一步地，所述免疫治療藥物可制備成免疫檢查點(diǎn)阻斷藥物等，用于抗腫瘤。

28、本發(fā)明的有益效果：

29、1)本發(fā)明的溶酶體靶向嵌合體具有多價效應(yīng)，使靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)與多個溶酶體穿梭受體識別結(jié)構(gòu)相連后，結(jié)合溶酶體穿梭受體的效率更高，從而提高靶標(biāo)蛋白的降解效率。

30、2)通過共價偶聯(lián)反應(yīng)制備本發(fā)明的多價溶酶體靶向嵌合體，合成方法簡單，反應(yīng)效率高，利于純化操作，整體制備成本低。

31、3)本發(fā)明的多價溶酶體靶向嵌合體在體內(nèi)的穩(wěn)定性好，無不利于生理活動的反應(yīng)發(fā)生，且由于識別效率高，能更好地富集到腫瘤部位，提高使用安全性。

32、4)本發(fā)明的多價溶酶體靶向嵌合體能夠在靶標(biāo)部位持續(xù)作用，實(shí)現(xiàn)低劑量高療效的有益效果。除了實(shí)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)阻斷的結(jié)果，還可通過高效誘導(dǎo)細(xì)胞表面pdl1的降解導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，釋放腫瘤抗原，刺激免疫細(xì)胞增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，綜合了免疫原性死亡-抗原呈遞和免疫細(xì)胞激活-免疫檢查點(diǎn)阻斷效應(yīng)的連續(xù)反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)連貫的抗腫瘤免疫反應(yīng)，放大療效。

技術(shù)特征：

1.一種多價的溶酶體靶向嵌合體，其特征在于，所述多價的溶酶體靶向嵌合體包括如下所述的結(jié)構(gòu)：通過連接分子連接的靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)和溶酶體穿梭受體識別結(jié)構(gòu)，且所述溶酶體穿梭受體識別結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)的摩爾比n>1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多價的溶酶體靶向嵌合體，其特征在于：所述1<n≤15。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多價的溶酶體靶向嵌合體，其特征在于：所述連接分子為在腫瘤微環(huán)境中不可降解的分子。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多價的溶酶體靶向嵌合體，其特征在于：所述溶酶體穿梭受體識別結(jié)構(gòu)或靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)通過柔性鏈段或直接與連接分子連接。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多價的溶酶體靶向嵌合體，其特征在于：所述柔性鏈段選自聚乙二醇、碳鏈、堿基鏈中的一種或多種。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多價的溶酶體靶向嵌合體，其特征在于，所述連接分子含有以下結(jié)構(gòu)中的至少一種：酰胺鍵、三唑環(huán)、硫醚鍵、二硫鍵。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多價的溶酶體靶向嵌合體，其特征在于，所述連接分子含有如下結(jié)構(gòu)中的至少一種：

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多價的溶酶體靶向嵌合體，其特征在于：所述靶標(biāo)蛋白識別結(jié)構(gòu)包括pdl1抗體、her2抗體、血小板源性生長因子抗體、蛋白酪氨酸激酶7抗體、間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子抗體、g蛋白偶聯(lián)受體65抗體、cd47抗體、cd71抗體、egfr抗體、abcg2抗體。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多價的溶酶體靶向嵌合體，其特征在于：所述溶酶體穿梭受體識別結(jié)構(gòu)包括ci-m6pr核酸適體、asgpr核酸適體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體核酸適體、多聚寡核苷酸中的一種或幾種。

10.權(quán)利要求1-9任一項所述的多價的溶酶體靶向嵌合體在制備蛋白降解劑或制備免疫治療藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種多價的溶酶體靶向嵌合體及其在蛋白降解和免疫治療中的應(yīng)用，屬于免疫治療技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的多價溶酶體靶向嵌合體，能高效識別和結(jié)合靶標(biāo)蛋白與溶酶體穿梭受體，引起靶標(biāo)蛋白經(jīng)過溶酶體途徑的降解。且該溶酶體靶向嵌合體能夠在靶標(biāo)部位持續(xù)作用，實(shí)現(xiàn)低劑量高療效的有益效果，能有效阻斷PDL1/PD1信號軸，并引起腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡，誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)，兼具誘導(dǎo)腫瘤凋亡和免疫檢查點(diǎn)阻斷的多重作用效果。

技術(shù)研發(fā)人員：劉莊,李雨晴,楊宇
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘇州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2