用于檢測生物分子的探針測定
1.相關(guān)申請的交叉引用
2.本技術(shù)要求于2019年5月24日提交的sg臨時申請?zhí)?0201904711x的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其內(nèi)容以全文引用的方式并入本文以用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
3.本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及基于核酸的檢測探針的用途。


背景技術(shù)：

4.使用實驗測定法檢測和鑒定樣品中的分子在實驗室中發(fā)揮著重要作用。生物分子相互作用，例如用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞受體聚集、感染過程中的宿主-細胞相互作用以及蛋白質(zhì)復(fù)合物內(nèi)的相互作用，參與到許多生物過程中。盡管具有生物學(xué)意義，但缺乏用于直接檢測此類多目標(biāo)活動的簡單分子工具箱。傳統(tǒng)的分析方法通常需要人工對應(yīng)物來捕獲相互作用的配偶配偶體，或大量的樣品處理以將生物分子與其原始環(huán)境分離，例如下拉測定(pull-down assays)和凝膠阻滯測定。dna電路是一種多功能且高度可編程的工具箱，其可用于動態(tài)事件例如生物分子相互作用的自主感知。然而，計算機電路設(shè)計(in silico circuit designs)的實驗實施受到電路泄漏問題的阻礙。因此，需要具有降低的電路泄漏率的基于探針的測定以用于檢測生物分子。


技術(shù)實現(xiàn)要素：

5.在一個方面，本公開涉及一種用于檢測一種或多種目的靶標(biāo)的存在的組合物，其中所述組合物包含以下組分：根據(jù)結(jié)構(gòu)i的第一發(fā)夾引發(fā)劑分子，其中所述結(jié)構(gòu)包含結(jié)構(gòu)域a、b1*、b2、b2*、e、e*、s和x*；其中相鄰結(jié)構(gòu)域彼此直接連接或通過連接子連接；其中結(jié)構(gòu)域x*與一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合或互補；其中結(jié)構(gòu)域b1*形成發(fā)夾環(huán)；其中結(jié)構(gòu)域b2*和b2具有相同的長度并且彼此互補；其中結(jié)構(gòu)域b2*和b2的長度至少為2個核苷酸；其中結(jié)構(gòu)域e和e*具有相同的長度，長度至少為2個核苷酸，并且彼此互補；其中結(jié)構(gòu)域a的長度至少為3個核苷酸；其中結(jié)構(gòu)域s是間隔子；和根據(jù)結(jié)構(gòu)ii的第二引發(fā)劑分子，其中所述結(jié)構(gòu)包含結(jié)構(gòu)域a*、c*、e*、s’和y*；其中結(jié)構(gòu)域y*與一種或多種目的靶標(biāo)互補或結(jié)合；其中結(jié)構(gòu)域a和a*彼此互補；其中結(jié)構(gòu)ii的結(jié)構(gòu)域e*長度至少為2個核苷酸并且在結(jié)合目的靶標(biāo)后與結(jié)構(gòu)i的結(jié)構(gòu)域e結(jié)合，其中結(jié)構(gòu)域c*能夠結(jié)合至信號產(chǎn)生分子/信號產(chǎn)生復(fù)合物；并且其中結(jié)構(gòu)域s’是間隔子，其中選擇結(jié)構(gòu)域s和s’的長度以允許結(jié)構(gòu)域b1*、b2*和c*在結(jié)合時彼此相鄰。
6.在另一方面，本公開涉及一種用于檢測樣品中的一種或多種目的靶標(biāo)的方法，所述方法包括提供被認為包含所述一種或多種目的靶標(biāo)的樣品并使用如本文公開的組合物檢測所述一種或多種目的靶標(biāo)，其中每種組合物對一個目的靶標(biāo)是特異性的。
7.在又一方面，本公開涉及一種用于檢測樣品中一種或多種目的靶標(biāo)的存在的方法，所述方法包括將一種或多種如本文公開的組合物添加到所述樣品中；允許所述一種或
多種組合物與被認為包含在所述樣品中的所述一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合；測量由所述組合物與所述目的靶標(biāo)結(jié)合產(chǎn)生的一種或多種信號；其中一種或多種信號的產(chǎn)生檢測到所述樣品中存在所述目的靶標(biāo)中的一種或多種。
8.在另一方面，本公開涉及一種鑒定疾病的方法，所述方法包括將一種或多種如本文公開的組合物添加到從懷疑患有所述疾病的受試者獲得的樣品中；允許所述一種或多種組合物與所述一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合；測量由所述組合物與所述目的靶標(biāo)結(jié)合產(chǎn)生的一種或多種信號；和鑒定所述疾病，其中一種或多種信號的存在指示所述樣品中存在所述目的靶標(biāo)中的一種或多種；并且其中所述目的靶標(biāo)中的一種或多種是疾病特異性的。
9.在另一方面，本公開涉及一種包含本文定義的組合物的試劑盒。
附圖說明
10.當(dāng)結(jié)合非限制性實施例和附圖考慮時，參考詳細說明將更好地理解本發(fā)明，其中：
11.圖1顯示了動態(tài)伸長的締合立足點的概念示意圖，以及圖中所示的每個結(jié)構(gòu)域的相互作用配偶體?，F(xiàn)有技術(shù)中已知的用于常規(guī)締合立足點設(shè)計的引發(fā)劑被修飾為包含發(fā)夾鎖，在該圖中被稱為發(fā)夾引發(fā)劑(hp-i1)。發(fā)夾鎖的特征在于存在額外的結(jié)構(gòu)域e和使用先前公開的結(jié)構(gòu)域b*的一部分(現(xiàn)在表示為結(jié)構(gòu)域b2*)作為夾子，以在沒有觸發(fā)事件的情況下保持發(fā)夾亞穩(wěn)定性。(步驟1)在兩個識別位點(表示為結(jié)構(gòu)域x和y)處的靶標(biāo)結(jié)合后，(步驟2)將兩個引發(fā)劑(分別表示為hp-i1和i2，或結(jié)構(gòu)i和ii)接近以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域a處的雜交。(步驟3)然后發(fā)夾鎖被i2(結(jié)構(gòu)ii)上的結(jié)構(gòu)域e*部分置換，然后(步驟4)解離結(jié)構(gòu)域b2*。初始狀態(tài)具有較短的締合區(qū)域(結(jié)構(gòu)域a)，泄漏率較低；而在靶標(biāo)結(jié)合時打開發(fā)夾鎖后的最終狀態(tài)被更長的締合區(qū)域(結(jié)構(gòu)域a+e)有效地穩(wěn)定，因為這種伸長機制產(chǎn)生更強的信號。
12.圖2顯示了針對不同構(gòu)型的發(fā)夾引發(fā)劑1(hp-i1；也稱為結(jié)構(gòu)i)設(shè)計獲得的福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)比率的比較結(jié)果。每個發(fā)夾設(shè)計的結(jié)構(gòu)域b2、e和a的長度分別顯示在圖表的左側(cè)。淺灰色條是指沒有添加靶標(biāo)(表示潛在的背景噪聲或泄漏)，而深灰色條是指添加了20nm靶標(biāo)(指示信號產(chǎn)生)。每個設(shè)計的信噪比(s/n)都被呈現(xiàn)為折線-散點圖。n.s.不顯著；*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。目的是實現(xiàn)最低可能的(背景)噪聲，同時實現(xiàn)最高可能的信號。因此，s/n值越高，信號相比噪聲越高。
13.圖3顯示了描繪不同發(fā)夾引發(fā)劑1(hp-i1)設(shè)計的信噪比(s/n)的曲線圖。繪制了一根截止線以突出顯示兩組s/n——例如通過hp3、hp7和hp9設(shè)計獲得高s/n，這些設(shè)計被入選用于進一步調(diào)查。該曲線圖顯示了不同發(fā)夾引發(fā)劑1設(shè)計對“信噪比”(s/n)的影響，從而如上所述，目的是實現(xiàn)最低可能的(背景)噪聲，同時實現(xiàn)最高可能的信號。因此，s/n值越高，信號相比噪聲越高。
14.圖4顯示了使用動態(tài)伸長的締合立足點概念的泄漏抑制的結(jié)果，其一般原理在圖1中例證。(a)顯示在不存在靶標(biāo)的情況下，當(dāng)各個引發(fā)劑用于分離式接近電路(spc)反應(yīng)時，電路泄漏的演變。與具有等同的有效締合長度的常規(guī)引發(fā)劑設(shè)計相比，發(fā)夾引發(fā)劑顯示出顯著抑制泄漏。(b)顯示發(fā)夾引發(fā)劑設(shè)計的信噪比(s/n)高于常規(guī)引發(fā)劑設(shè)計，無論締合區(qū)域的長度如何。
15.圖5顯示的數(shù)據(jù)說明了使用伸長締合立足點的動力學(xué)和熱力學(xué)。(a)將發(fā)夾引發(fā)劑設(shè)計(結(jié)構(gòu)域a
→
a+e)的性能與先前設(shè)計的單鏈引發(fā)劑設(shè)計(僅有結(jié)構(gòu)域a)和伸長后(結(jié)構(gòu)
域a+e)進行比較。與常規(guī)引發(fā)劑設(shè)計相比，發(fā)夾引發(fā)劑設(shè)計改善了分離式接近電路(spc)的動力學(xué)和熱力學(xué)，并且非常接近伸長締合域的性能，(b)有效締合長度是4
→
6個核苷酸(nt)，(c)是5
→
8個核苷酸，(d)是6
→
9個核苷酸。所有數(shù)據(jù)都顯示為平均值
±
s.d.(n＝3)。
16.圖6顯示了由分離式接近電路(spc)產(chǎn)生的分析性能的數(shù)據(jù)。(a)當(dāng)用0-10nm的分離觸發(fā)劑(split trigger，st)滴定時，a6-9發(fā)夾引發(fā)劑設(shè)計的分離式接近電路(spc)的動力學(xué)。(b)福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)比率線性依賴于a4-6、a5-8和a6-9設(shè)計的分離觸發(fā)劑(st)濃度。所有數(shù)據(jù)都顯示為平均值
±
s.d.(n＝3)。(c)顯示了針對所描繪的表中公開的發(fā)夾引發(fā)劑設(shè)計的每個締合域確定的檢測限(lod；以nm顯示)的概述。(c)中所示的該信息也被呈現(xiàn)為表1。
17.圖7顯示的數(shù)據(jù)說明了在25℃使用hp3設(shè)計在1x pbs(ph 7.4)中的不同mg
2+
濃度下評估的分離式接近電路(spc)的動力學(xué)。所有數(shù)據(jù)均顯示為平均值
±
s.d(n＝3)。隨著mg
2+
濃度的增加，信背(s/b)比顯著提高，并且5mm mg
2+
獲得最佳s/b比。本實驗中使用的最終緩沖液組合物是1x pbs(ph 7.4)和5mm mgcl2，用于20nm hp-i1、20nm i2、40nm hp1和20nm hp2。
18.圖8提供的示意圖顯示本文公開的基于dna的測定是基于模塊化設(shè)計，其由三個關(guān)鍵步驟組成：1)靶標(biāo)識別、2)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和3)信號產(chǎn)生。作為讀出信號的一個實例，使用雜交鏈反應(yīng)，其通過包含兩個發(fā)夾單體(hp1和hp2)來指示，用于放大信號。在本實例中，四種寡核苷酸(或綴合物)探針混合并直接添加到樣品中，以在存在靶標(biāo)的情況下產(chǎn)生熒光信號(fret)。
19.圖9顯示了與可以使用本文公開的組合物檢測的其他類別的生物分子的實例有關(guān)的數(shù)據(jù)。這表明本技術(shù)中公開的主題的普遍應(yīng)用。(a)顯示了當(dāng)不同的引發(fā)劑組合與不同的病毒鏈分別反應(yīng)30分鐘時獲得的福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)比率的熱圖。(b)顯示了在分析以下七(7)個g6pd模型時獲得的fret比率結(jié)果：canton、riverside、union、mahidol、mediterranean(med)、a+和kaiping。“nc”是指陰性對照設(shè)置，其中沒有將目標(biāo)鏈添加到反應(yīng)中。*p《0.05；**p《0.01(單尾學(xué)生t檢驗)。(c)顯示的數(shù)據(jù)表明電路區(qū)分了let-7家族成員的微小rna，其中存在對let-7a的高選擇性，而探針是為了let-7a而被設(shè)計的。**是指p《0.01(n＝3)；***是指p《0.005(n＝3)。(d)顯示的數(shù)據(jù)表明電路檢測到her2:her3異源二聚體(亮點)，它們是存在于乳腺癌細胞(au565)上的細胞表面蛋白受體。該圖像是在孵育30分鐘后使用共聚焦顯微鏡獲得的。在任何相關(guān)的地方，所有數(shù)據(jù)都顯示為平均值
±
s.d.(n＝3)。
20.圖10顯示了使用本文公開的組合物產(chǎn)生信號的一個實例。繼圖1所示的最后一個構(gòu)建體之后，當(dāng)hp-i1和i2接近時，現(xiàn)在呈現(xiàn)出完整的觸發(fā)鏈(由結(jié)構(gòu)域c*和b*表示)。然后使用完整的觸發(fā)鏈通過下游dna雜交反應(yīng)產(chǎn)生讀出信號。在這個實例中，它以級聯(lián)方式觸發(fā)兩個亞穩(wěn)態(tài)發(fā)夾(例如hp1和hp2)的打開，以通過稱為雜交鏈反應(yīng)的過程形成一條長的、擴增的dna鏈，并在這個實例中產(chǎn)生福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)信號作為讀出信號，表明存在目的靶標(biāo)并結(jié)合至目的靶標(biāo)。
具體實施方式
21.本文討論了一種基于分離式接近電路(spc)概念設(shè)計的分子。分離式接近電路是
一種多功能且高度可編程的工具箱，其可用于自主感知靶分子(如核酸、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物)或動態(tài)事件(如生物分子相互作用)。此類電路可以使用核酸產(chǎn)生，例如但不限于dna和rna。人們認為開發(fā)分離式接近電路可以提高結(jié)合動力學(xué)而不會引起額外的電路泄漏。如本文所用，術(shù)語“電路泄漏”是指在不存在一種或多種目的靶標(biāo)的情況下由dna鏈之間的隨機雜交產(chǎn)生的背景信號。
22.締合立足點是一個靈活的概念，其中立足點和分支遷移域在分開的dna鏈上解開，然后可以在稍后被激活以響應(yīng)于特定的雜交事件進行重新組裝。它建立在遠程立足點的概念之上，其中以立足點介導(dǎo)的鏈置換可以跨非相鄰結(jié)構(gòu)域進行，盡管對動力學(xué)不利。傳統(tǒng)的締合立足點涉及在添加特定輸入后在分開的單鏈dna鏈上發(fā)現(xiàn)的完整觸發(fā)域的動態(tài)重組。通常，限速步驟是短結(jié)合區(qū)的雜交。由于期望信號和不期望的泄漏反應(yīng)(引起背景噪聲)都可以由單個參數(shù)(即締合域的長度)確定，因此此類系統(tǒng)存在固有限制，其中更長的締合域必然導(dǎo)致更強的信號產(chǎn)生和更高的背景噪聲。如本文所用，術(shù)語“立足點”是指將反應(yīng)物dna分子共定位并引發(fā)鏈置換反應(yīng)的短單鏈核酸片段。術(shù)語“締合立足點”是指一種形式的立足點設(shè)計，其中活性電路域位于分開的核酸鏈上，并通過激活事件(例如靶標(biāo)結(jié)合)進入相鄰位置。
23.本文公開了使用先前報道的分離式接近電路(spc)基于改進型締合立足點的概念的分子和組合物。改進型締合立足點的特點是當(dāng)由特定靶標(biāo)觸發(fā)時締合區(qū)域的動態(tài)伸長，從而協(xié)調(diào)期望反應(yīng)率和泄漏率之間的權(quán)衡(圖1)。舉例來說，這種動態(tài)伸長是通過在引發(fā)劑1(i1)中添加發(fā)夾鎖設(shè)計來實現(xiàn)的，所述發(fā)夾鎖設(shè)計包括額外的結(jié)構(gòu)域e(對應(yīng)于伸長的程度)和先前公開的立足點結(jié)構(gòu)域b*的一部分(在本文中表示為結(jié)構(gòu)域b2*)作為保持發(fā)夾亞穩(wěn)定性的夾子(參見ang等人,nucleic acids research,2016,第44卷,第14e121期)。ang等人公布的分離式接近電路(spc)是基于傳統(tǒng)的締合立足點設(shè)計，當(dāng)締合長度增加時，所述設(shè)計會在增加的信號產(chǎn)生和增加的電路泄漏之間進行權(quán)衡。因此，ang等人(2016)報道的舊設(shè)計也涉及線性引發(fā)劑，而不是本文公開的發(fā)夾引發(fā)劑，所述舊設(shè)計的電路動力學(xué)和信噪比緩慢，這限制了其實際應(yīng)用。本公開中引入的發(fā)夾引發(fā)劑設(shè)計能夠在由發(fā)夾鎖介導(dǎo)的伸長之后使用更長的締合域，這將電路動力學(xué)加速了四倍以上(使用基于本公開的設(shè)計)并將信噪比增加了高達10倍。
24.自由溶液中暴露締合區(qū)域的初始長度對應(yīng)于結(jié)構(gòu)域a的長度。在靶標(biāo)結(jié)合后，根據(jù)分離式接近電路設(shè)計使兩條引發(fā)劑的鏈緊密接近。這通過與結(jié)構(gòu)域a和e結(jié)合促進了i1上發(fā)夾鎖的打開，其有效地成為了新的、伸長的締合區(qū)域。結(jié)構(gòu)域b2*夾子自發(fā)解離以暴露剩余的立足點結(jié)構(gòu)域b1*。最終組件保留了先前公開的觸發(fā)域(c*b*)，盡管在i1的3’端有一個結(jié)構(gòu)域e*突出端，由于更長的締合區(qū)(它是結(jié)構(gòu)域a和e的組合長度)，所述結(jié)構(gòu)域e*突出端使st-i1-i2組件具有提高的穩(wěn)定性。
25.因此，在一個實例中，公開了一種用于檢測一種或多種目的靶標(biāo)的存在的組合物。在一個實例中，組合物包含根據(jù)結(jié)構(gòu)i的第一發(fā)夾引發(fā)劑分子：
[0026][0027]
其中所述結(jié)構(gòu)包含結(jié)構(gòu)域a、b1*、b2、b2*、e、e*、s和x*。為清楚起見，用星號表示的結(jié)構(gòu)域表示結(jié)合到具有相同名稱但沒有星號的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。例如，如圖1所示，結(jié)構(gòu)域a和結(jié)構(gòu)域a*相互結(jié)合；結(jié)構(gòu)域x結(jié)合到結(jié)構(gòu)域x*，并且結(jié)構(gòu)域y結(jié)合到結(jié)構(gòu)域y*。在一個實例中，相鄰結(jié)構(gòu)域彼此直接連接或通過連接子連接；結(jié)構(gòu)域x*與一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合或互補；結(jié)構(gòu)域b1*形成發(fā)夾環(huán)；結(jié)構(gòu)域b2*和b2具有相同的長度并且彼此互補，結(jié)構(gòu)域b2*和b2的長度至少為2個核苷酸；結(jié)構(gòu)域e和e*具有相同的長度并且彼此互補；結(jié)構(gòu)域e和e*的長度至少為2個核苷酸；結(jié)構(gòu)域a的長度至少為3個核苷酸；結(jié)構(gòu)域s是可變長度的間隔子，其中選擇間隔子長度以允許第二引發(fā)劑分子的結(jié)構(gòu)域x*和結(jié)構(gòu)域y*與一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域b1*、b2*和c*將彼此相鄰。例如，在靶標(biāo)結(jié)合時就是這種情況。也就是說，靶標(biāo)結(jié)合用于使結(jié)構(gòu)域b1*、b2*和c*彼此相鄰。
[0028]
本文還公開了根據(jù)結(jié)構(gòu)ii的第二引發(fā)劑分子，
[0029][0030]
其中所述結(jié)構(gòu)包含結(jié)構(gòu)域a*、c*、e*、s’和y*。在一個實例中，結(jié)構(gòu)域y*與結(jié)構(gòu)域x
相鄰或下游的一種或多種目的靶標(biāo)互補或結(jié)合，其中結(jié)構(gòu)域x位于目的靶標(biāo)上；結(jié)構(gòu)域a和a*彼此互補；結(jié)構(gòu)域e*如本文所定義；結(jié)構(gòu)域c*被構(gòu)造成與信號產(chǎn)生分子/信號產(chǎn)生復(fù)合物結(jié)合；并且其中結(jié)構(gòu)域s’如本文所定義。
[0031]
在另一個實例中，所述組合物包含以下組分：根據(jù)結(jié)構(gòu)i的第一發(fā)夾引發(fā)劑分子，其中所述結(jié)構(gòu)包含結(jié)構(gòu)域a、b1*、b2、b2*、e、e*、s和x*；其中相鄰結(jié)構(gòu)域彼此直接連接或通過連接子連接；其中結(jié)構(gòu)域x*與一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合或互補；其中結(jié)構(gòu)域b1*形成發(fā)夾環(huán)；其中結(jié)構(gòu)域b2*和b2具有相同的長度并且彼此互補；其中結(jié)構(gòu)域b2*和b2的長度至少為2個核苷酸；其中結(jié)構(gòu)域e和e*具有相同的長度并且彼此互補；其中結(jié)構(gòu)域e和e*的長度至少為2個核苷酸；其中結(jié)構(gòu)域a的長度至少為4個核苷酸；其中結(jié)構(gòu)域s是可變長度的間隔子，其中選擇間隔子長度以允許第二引發(fā)劑分子的結(jié)構(gòu)域x*和結(jié)構(gòu)域y*與一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合；和根據(jù)結(jié)構(gòu)ii的第二引發(fā)劑分子，其中所述結(jié)構(gòu)包含結(jié)構(gòu)域a*、c*、e*、s和y*；其中結(jié)構(gòu)域y*與結(jié)構(gòu)域x相鄰或下游的一種或多種目的靶標(biāo)互補或結(jié)合，其中結(jié)構(gòu)域x位于目的靶標(biāo)上；其中結(jié)構(gòu)域a和a*彼此互補；其中結(jié)構(gòu)域e*如本文所定義，其中結(jié)構(gòu)域c*被構(gòu)造成結(jié)合至信號產(chǎn)生分子/信號產(chǎn)生復(fù)合物；并且其中結(jié)構(gòu)域s如本文所定義。
[0032]
在又一個實例中，所述組合物包含以下組分：根據(jù)結(jié)構(gòu)i的第一發(fā)夾引發(fā)劑分子，其中所述結(jié)構(gòu)包含結(jié)構(gòu)域a、b1*、b2、b2*、e、e*、s和x*；其中相鄰結(jié)構(gòu)域彼此直接連接或通過連接子連接；其中結(jié)構(gòu)域x*與一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合或互補；其中結(jié)構(gòu)域b1*形成發(fā)夾環(huán)；其中結(jié)構(gòu)域b2*和b2具有相同的長度并且彼此互補；其中結(jié)構(gòu)域b2*和b2的長度至少為2個核苷酸；其中結(jié)構(gòu)域e和e*具有相同的長度，長度至少為2個核苷酸，并且彼此互補；其中結(jié)構(gòu)域a的長度至少為3個核苷酸；其中結(jié)構(gòu)域s是間隔子；和根據(jù)結(jié)構(gòu)ii的第二引發(fā)劑分子，其中所述結(jié)構(gòu)包含結(jié)構(gòu)域a*、c*、e*、s’和y*；其中結(jié)構(gòu)域y*與一種或多種目的靶標(biāo)互補或結(jié)合；其中結(jié)構(gòu)域a和a*彼此互補；其中結(jié)構(gòu)ii的結(jié)構(gòu)域e*長度至少為2個核苷酸并且在結(jié)合目的靶標(biāo)后與結(jié)構(gòu)i的結(jié)構(gòu)域e結(jié)合，其中結(jié)構(gòu)域c*能夠結(jié)合至信號產(chǎn)生分子/信號產(chǎn)生復(fù)合物；并且其中結(jié)構(gòu)域s’是間隔子，其中選擇結(jié)構(gòu)域s和s’的長度以允許結(jié)構(gòu)域b1*、b2*和c*在結(jié)合時彼此相鄰。
[0033]
此類引發(fā)劑分子可包含二級結(jié)構(gòu)，例如但不限于莖環(huán)、螺旋、雙鏈體結(jié)構(gòu)、發(fā)夾環(huán)等。在一個實例中，引發(fā)劑分子可包含雙鏈體結(jié)構(gòu)和發(fā)夾環(huán)。在另一個實例中，本文公開的引發(fā)劑分子具有線性結(jié)構(gòu)。
[0034]
本文公開的結(jié)構(gòu)與一種或多種目的靶標(biāo)的結(jié)合依賴于靶標(biāo)識別域x*和y*(也稱為靶標(biāo)結(jié)合域)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，結(jié)構(gòu)i和ii彼此緊密接近的結(jié)合閉合電路并產(chǎn)生信號。在這種情況下，術(shù)語“接近度”是指結(jié)構(gòu)i和ii之間的距離。術(shù)語“緊密接近”表示結(jié)構(gòu)i和ii之間允許彼此結(jié)合的距離。如果沒有給出結(jié)構(gòu)i和ii彼此的結(jié)合以及與目的靶標(biāo)的結(jié)合，則認為這些結(jié)構(gòu)彼此沒有緊密接近。
[0035]
應(yīng)當(dāng)理解，如本文所公開的，電路的閉合，即引發(fā)劑分子與目的靶標(biāo)的結(jié)合，指示此類靶標(biāo)的存在。因此，在一個實例中，一種或多種目的靶標(biāo)的存在指示疾病的存在。在另一個實例中，一種或多種目的靶標(biāo)的存在可以指示疾病的不存在。此外，當(dāng)以定量方式使用時，由引發(fā)劑分子與目的靶標(biāo)結(jié)合產(chǎn)生的信號可以指示或直接轉(zhuǎn)化為目的靶標(biāo)濃度的增加或降低。這可以與例如基線測量進行比較(例如，在比較全局表達或代謝變化時)，或者在另一個實例中，可以用于比較無病或健康受試者中目的靶標(biāo)的濃度與帶病受試者中的相同目
的靶標(biāo)的濃度。
[0036]
因此，本文還公開了一種檢測/鑒定疾病存在的方法。在另一個實例中，公開了一種鑒定疾病的方法，所述方法包括將一種或多種如本文公開的組合物添加到從懷疑患有所述疾病的受試者獲得的樣品中；允許所述一種或多種組合物與懷疑在所述樣品中包含的一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合；測量由所述組合物與所述目的靶標(biāo)結(jié)合產(chǎn)生的一種或多種信號；和鑒定所述疾病，其中一種或多種信號的存在指示所述樣品中存在所述目的靶標(biāo)中的一種或多種；并且其中所述目的靶標(biāo)中的一種或多種是疾病特異性的。
[0037]
在一些實例中，靶標(biāo)識別或結(jié)合域x*和y*可以通過例如本文所公開的間隔序列s或s’連接至剩余結(jié)構(gòu)。在目的靶標(biāo)如此龐大以至于靶標(biāo)識別域x*和y*的結(jié)合會導(dǎo)致例如空間位阻的情形下就是這種情況。或者，例如，在某些情況下，目的靶標(biāo)上的結(jié)構(gòu)域x*和y*的結(jié)合位點相距甚遠，以至于一旦與目的靶標(biāo)結(jié)合，結(jié)構(gòu)i和ii就無法彼此結(jié)合。在這些情況下，間隔序列s的使用可以克服直接由空間位阻或結(jié)構(gòu)i和ii之間的距離導(dǎo)致的問題或限制，一旦與目的靶標(biāo)結(jié)合，就使本文公開的結(jié)構(gòu)具有靈活性以實現(xiàn)彼此結(jié)合和結(jié)合目的靶標(biāo)的雙重功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，選擇間隔序列s和s’以允許結(jié)構(gòu)域b1*、b2*和c*彼此相鄰，這通過結(jié)構(gòu)域a和e的激活被促進。因此，在一個實例中，結(jié)構(gòu)i和ii中的間隔序列是相同的。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)i和ii中存在的間隔序列彼此不同。在一個實例中，間隔序列s和s’是對稱的。在另一個實例中，間隔序列s和s’不對稱。
[0038]
在一個實例中，結(jié)構(gòu)域s和s’各自是間隔子。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域s和s’是可變長度的。在另一個實例中，選擇間隔子長度(其是結(jié)構(gòu)域s和/或結(jié)構(gòu)域s’的長度)以允許第二引發(fā)劑分子的結(jié)構(gòu)域x*和結(jié)構(gòu)域y*與一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合。換句話說，結(jié)構(gòu)域s和s’的長度將被選擇為允許結(jié)構(gòu)域b1*、b2*和c*彼此相鄰，這通過結(jié)構(gòu)域a和e的激活被促進(也就是說，以促進結(jié)構(gòu)域a和e分別結(jié)合至結(jié)構(gòu)域a*和e*)。這意味著，為了滿足這個要求，在一些實施方案中，結(jié)構(gòu)域s和s’的長度可以不同。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域s的長度在1到50nm之間。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域s’的長度在1到50nm之間。在一個實例中，間隔子長度范圍為1nm(大致相當(dāng)于3個胸腺嘧啶間隔子)至10nm(大致相當(dāng)于30個胸腺嘧啶間隔子)。
[0039]
間隔序列的功能在于使引發(fā)劑(結(jié)構(gòu)i和ii)能夠在空間上相互到達。因此，例如，更大的靶分子(即包含靶結(jié)合位點結(jié)構(gòu)域x和結(jié)構(gòu)域y的分子)可以利用更長的間隔子長度來產(chǎn)生信號。值得注意的是，結(jié)構(gòu)域之間的序列稱為連接子，但結(jié)構(gòu)域a和x*之間的序列以及結(jié)構(gòu)域a*和y*之間的序列稱為間隔子，而不是連接子。
[0040]
在一個實例中，本文公開的間隔序列可部分或完全包含核酸分子。因此，在一個實例中，間隔序列包含胸腺嘧啶。在另一個實例中，本文公開的間隔序列不包含核酸分子。在此類實例中，間隔序列可包含聚乙二醇(peg)和其他烴鏈。此類烴鏈的實例可以是但不限于3-碳間隔子、己二醇、三甘醇、8-環(huán)氧乙烷和18原子六-乙二醇。
[0041]
這種間隔序列也可用于構(gòu)成結(jié)構(gòu)i和ii的其他結(jié)構(gòu)域之間。如前所述，每個結(jié)構(gòu)域之間的序列稱為連接子。根據(jù)間隔序列的功能，如上所述，連接子同樣可用于克服一旦與目的靶標(biāo)結(jié)合后結(jié)構(gòu)i和ii之間的空間位阻或距離直接導(dǎo)致的問題或限制。在一個實例中，這些連接序列彼此不互補，也不與本文公開的結(jié)構(gòu)內(nèi)的任何其他序列互補。這可能導(dǎo)致引發(fā)劑(例如結(jié)構(gòu)i和ii)的過度穩(wěn)定，進而導(dǎo)致即使在沒有靶標(biāo)的情況下也會產(chǎn)生信號。
[0042]
因此，在一個實例中，結(jié)構(gòu)i和ii中的相鄰結(jié)構(gòu)域通過連接子彼此連接。在另一個
實例中，結(jié)構(gòu)i和ii中的相鄰結(jié)構(gòu)域直接彼此連接，這意味著相鄰結(jié)構(gòu)域之間不存在連接子。
[0043]
還注意到對于間隔序列和連接序列，它們的確切序列(或者它是否甚至是自然界中的核酸)是無關(guān)緊要的。確切的長度在本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的限度內(nèi)也不是重要的。也就是說，間隔子和/或連接子的長度相對于靶標(biāo)尺寸不應(yīng)過長，否則兩個引發(fā)劑彼此相遇的速率可能會不利地降低(就動力學(xué)而言)。因此，在一個實例中，總間隔子長度(即結(jié)構(gòu)域s和s’加在一起)可以至少與靶標(biāo)分子的估計大小一樣長。另一方面，在一些實例中，具有長達1nm(或長達3個胸腺嘧啶)的短連接序列可以有助于放松擁擠的環(huán)境并改善電路熱力學(xué)。在三向接合點、即三條dna鏈相遇的點處尤其如此。
[0044]
如本文所公開的，根據(jù)結(jié)構(gòu)i的第一發(fā)夾引發(fā)劑分子包含發(fā)夾環(huán)和夾子結(jié)構(gòu)域，如圖1所示。這些發(fā)夾環(huán)和夾子結(jié)構(gòu)域包含結(jié)構(gòu)域e、e*、b2、b2*和b1*。也就是說，本領(lǐng)域中已知的用于締合立足點設(shè)計的引發(fā)劑1被修飾為包含發(fā)夾鎖。此外，以先前公開的結(jié)構(gòu)域b*為基礎(chǔ)的夾子結(jié)構(gòu)域(現(xiàn)在在本文中表示為結(jié)構(gòu)域b2*)通過摻入額外的結(jié)構(gòu)域e進行了延伸，以便在沒有觸發(fā)事件的情況下保持發(fā)夾亞穩(wěn)定性。該觸發(fā)事件是指本文公開的組合物與一種或多種目的靶標(biāo)的結(jié)合。
[0045]
如本文中所指，結(jié)構(gòu)域e和e*均指代伸長域，其表示締合區(qū)域在靶標(biāo)觸發(fā)時延伸的長度。結(jié)構(gòu)域b2和b2*是指取自完整立足點結(jié)構(gòu)域b*的一部分的夾子結(jié)構(gòu)域。它是形成發(fā)夾鎖(i1)的莖的一部分的結(jié)構(gòu)域，以在沒有靶標(biāo)觸發(fā)的情況下保持其亞穩(wěn)定性。結(jié)構(gòu)域b1是指將部分立足點結(jié)構(gòu)域b分配為結(jié)構(gòu)域b2*后的剩余序列。在靶標(biāo)觸發(fā)時，發(fā)夾引發(fā)劑(hp-i1；也稱為結(jié)構(gòu)i)打開，并且結(jié)構(gòu)域b1*和b2*以其完整的單鏈形式或其原始結(jié)構(gòu)域b*形式暴露。本文公開的結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)系也在隨本文一起提供的圖1中示出。另外，需要注意的是，本文中使用的星號表示各個結(jié)構(gòu)域是彼此互補的結(jié)構(gòu)域(也稱為從5’到3’方向以線性形式觀察時彼此反向互補的序列)，而不是具有獨立功能的新結(jié)構(gòu)域。
[0046]
在一個實例中，結(jié)構(gòu)域b1*形成發(fā)夾環(huán)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，結(jié)構(gòu)域b1*的長度取決于結(jié)構(gòu)域b1*的長度是否足夠長以形成必需的發(fā)夾環(huán)。因此，在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域b1*至少有3個核苷酸長。另一方面，大發(fā)夾環(huán)的形成可能會影響發(fā)夾環(huán)/立足點結(jié)構(gòu)域(即結(jié)構(gòu)域b1*)的穩(wěn)定性。因此，在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域b1*的長度在3個核苷酸到10個核苷酸之間。作為解釋，例如，結(jié)構(gòu)域b1*可以有效地為結(jié)構(gòu)域b*的長度減去結(jié)構(gòu)域b2*的長度。因此，結(jié)構(gòu)域b1*的最大長度為結(jié)構(gòu)域b*的最大長度減去2(本文中定義為結(jié)構(gòu)域b2*的最小長度)。根據(jù)本領(lǐng)域目前的理解，立足點長度的上限是12個核苷酸。因此，在一個實例中，結(jié)構(gòu)域b1*的長度最高達10個核苷酸。
[0047]
如上所述，結(jié)構(gòu)域b2*與結(jié)構(gòu)域b2一起形成夾子結(jié)構(gòu)域，其功能是在沒有觸發(fā)事件的情況下防止發(fā)夾環(huán)過早打開。因此，在一個實例中，結(jié)構(gòu)域b2*和b2具有相同的長度并且彼此互補。由于結(jié)構(gòu)域b2和b2*的功能是在沒有觸發(fā)事件的情況下防止發(fā)夾環(huán)過早打開，因此當(dāng)結(jié)構(gòu)域b2和b2*之間的結(jié)合(互補或其他方式)足夠強以防止發(fā)夾環(huán)過早打開，但又足夠弱以允許在存在觸發(fā)事件的情況下打開發(fā)夾環(huán)時，結(jié)構(gòu)域b2和b2*的長度被認為是足夠的。因此，在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域b2*和b2的長度至少為2個核苷酸。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域b2*的長度在2到6個核苷酸之間。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域b2*(因此結(jié)構(gòu)域b2)為2、3、4、5或6個核苷酸長。在又一個實例中，結(jié)構(gòu)域b2*的長度為2或3個核苷酸。
[0048]
如本文所用，術(shù)語“部分結(jié)合”或“部分互補于”是指兩個或更多個結(jié)合配偶體彼此結(jié)合或互補的能力。這可以在一定程度上滿足要求，例如，兩個序列彼此充分連接以允許結(jié)合序列的進一步下游功能。兩個結(jié)合配偶體之間的結(jié)合(例如在結(jié)合配偶體是核酸序列的情況下)可以是完全互補的(意味著結(jié)合序列中不存在錯配的核苷酸)或部分互補的(意味著結(jié)合序列中存在一些錯配)。在一個實例中，部分互補序列可以指與相應(yīng)互補序列相比在其序列中具有多達5個錯配(1、2、3、4或5)的序列。在另一個實例中，錯配的數(shù)量可以顯示為完整序列的百分比。例如，序列中存在的錯配量可以表達為任何給定序列的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或高達25％。本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮參考序列是否是部分互補序列時將理解并能夠確定任何給定序列可以包含多少錯配(基于例如序列長度)。
[0049]
術(shù)語“核酸序列”和“核苷酸”在本公開中可以并且被互換使用，因為這兩個術(shù)語均指給定空間內(nèi)的大量核酸。
[0050]
如本文所公開的第一發(fā)夾引發(fā)劑分子進一步包含額外的伸長域e，其功能是在靶標(biāo)結(jié)合時延伸締合域的有效長度。
[0051]
在一實例中，結(jié)構(gòu)域e和e*彼此互補。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域e和e*具有相同的長度。在又一個實例中，結(jié)構(gòu)域e和e*具有相同長度并且彼此互補。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域e和e*的長度至少為2個核苷酸。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域e*或e的長度在2到8個核苷酸之間。在又一個實例中，結(jié)構(gòu)域e*或e的長度為2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸或8個核苷酸。
[0052]
根據(jù)結(jié)構(gòu)域e*的位置，表示為e*的相同序列可以出現(xiàn)多次。這是因為，在發(fā)夾引發(fā)劑分子與靶序列結(jié)合后，結(jié)構(gòu)ii的結(jié)構(gòu)域e*取代結(jié)構(gòu)i的結(jié)構(gòu)域e*。這在圖1中進行了說明。因此，在一個實例中，結(jié)構(gòu)ii的結(jié)構(gòu)域e*長度至少為2個核苷酸并且在結(jié)合目的靶標(biāo)時與結(jié)構(gòu)i的結(jié)構(gòu)域e結(jié)合。
[0053]
如本文所公開的，結(jié)構(gòu)i和ii還分別包含締合域a或a*。該締合域a(發(fā)現(xiàn)于結(jié)構(gòu)i上)與結(jié)構(gòu)ii上的對應(yīng)結(jié)構(gòu)域a*結(jié)合。由于結(jié)構(gòu)域a和a*之間需要結(jié)合，因此在一個實例中，這些結(jié)構(gòu)域部分或完全彼此互補。在一個實例中，結(jié)構(gòu)域a和a*彼此互補。
[0054]
當(dāng)結(jié)構(gòu)域a的長度達到6個核苷酸時，先前已經(jīng)報道了電路泄漏的增加。因此，為了減少在較長締合長度下發(fā)生的泄漏量，測試了結(jié)構(gòu)域a的各種長度，如例如圖2所示。將締合長度從4個核苷酸(hp4)增加到5個核苷酸(hp5)可以進一步增加泄漏。因此，在一個實例中，使用較短的締合長度，導(dǎo)致較低的背景泄漏。較長的締合長度被理解為增加信號和泄漏。然而，當(dāng)夾子長度增加1個核苷酸(hp6)時，福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)信號增加，而泄漏顯著減少，從而得到相當(dāng)?shù)男旁氡?s/n)。
[0055]
因此，在一個實例中，結(jié)構(gòu)域a的長度至少為3個核苷酸。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域a的長度在3到10個核苷酸之間。在又一個實例中，結(jié)構(gòu)域a的長度為3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域a和結(jié)構(gòu)域a*具有相同的長度。因此，在一個實例中，結(jié)構(gòu)域a*的長度至少為3個核苷酸。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域a*的長度在3至10個核苷酸之間。在又一個實例中，結(jié)構(gòu)域a*長度為3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。
[0056]
為了能夠定量或定性本文公開的組合物與一種或多種目的靶標(biāo)的結(jié)合，本文公開的組合物可以例如通過允許信號分子或信號產(chǎn)生復(fù)合物的結(jié)合而進一步包含一種或多種用于產(chǎn)生信號的結(jié)構(gòu)。因此，本文公開的組合物進一步包含一種或多種信號產(chǎn)生分子/信號
產(chǎn)生復(fù)合物。為此，根據(jù)結(jié)構(gòu)ii的引發(fā)劑分子包含結(jié)構(gòu)域c*，其進而被結(jié)構(gòu)化或能夠結(jié)合至信號產(chǎn)生分子/信號產(chǎn)生復(fù)合物。這允許產(chǎn)生稍后可以測量并且可以從中推斷出信息的信號。根據(jù)所使用的信號產(chǎn)生分子/信號產(chǎn)生復(fù)合物的類型，結(jié)構(gòu)域c將是合適的類型。也就是說，例如，如果綴合抗體用于信號產(chǎn)生，那么結(jié)構(gòu)域c*可以是但不限于抗原或抗體結(jié)合片段。因此，結(jié)構(gòu)域c*的長度也取決于所用信號的概念或類型。
[0057]
關(guān)于核酸靶標(biāo)，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，本文公開的要求保護的方法可用于檢測除本文舉例說明的核酸靶標(biāo)之外的其他核酸靶標(biāo)(dna和rna)是合理的，因為靶標(biāo)識別通過watson-crick堿基配對被促進。這個概念很好理解，并且可以根據(jù)實驗者的需要設(shè)計目的靶標(biāo)所需的互補序列。
[0058]
本文所提到的蛋白質(zhì)檢測是通過識別部分(即結(jié)構(gòu)域x*和y*)與目的蛋白質(zhì)的結(jié)合來實現(xiàn)的?？赡艿淖R別部分包括但不限于適體(如通過凝血酶檢測舉例說明的)和抗體(如通過登革熱抗原和il-6舉例說明的)，它們與本公開中描述的dna探針綴合。進一步的實例如本公開的表2所示。相反，如果目的靶標(biāo)是抗體(也是一種類型的蛋白質(zhì))，則對該靶標(biāo)類別(例如二級抗體或抗原)具有結(jié)合親和力的識別部分，可以與dna探針綴合以促進本文所述的檢測機制。一旦識別部分能夠與靶標(biāo)結(jié)合，如本文所公開的檢測機制就能夠發(fā)生。也就是說，結(jié)合事件導(dǎo)致引發(fā)劑探針(hp-i1和i2)物理接近，然后觸發(fā)讀出信號的產(chǎn)生。有理由相信，任何抗體都對其(特異性)目的靶標(biāo)具有結(jié)合親和力，因此本文所述的檢測機制可以繼續(xù)進行。
[0059]
本文公開的組分和方法能夠檢測對小分子具有結(jié)合親和力的蛋白質(zhì)，如本文例如表3所示。此外，所述組分和方法能夠以競爭性結(jié)合形式檢測小分子。例如，鏈霉親和素是與生物素(一種小分子)相互作用的蛋白質(zhì)。小分子與dna探針綴合并允許與鏈霉親和素蛋白結(jié)合。可以將內(nèi)源性小分子添加到反應(yīng)中以競爭與蛋白質(zhì)的結(jié)合并取代當(dāng)前結(jié)合的用dna探針修飾的小分子。
[0060]
作為本文中針對單一蛋白質(zhì)靶標(biāo)顯示的實例之一的擴展，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以合理推斷本文公開的組分和方法也適用于蛋白質(zhì)復(fù)合物，即兩種相互作用的蛋白質(zhì)或具有修飾區(qū)域(例如但不限于磷酸化)的蛋白質(zhì)。在一個實例中，兩個結(jié)合事件用于本文公開的方法和組分。因此，每個dna探針都可以與每個蛋白質(zhì)或修飾區(qū)域的識別部分(在抗體、適體或小分子中)綴合。在蛋白質(zhì)復(fù)合物形式中，然后使這對dna探針物理接近以觸發(fā)本文所述的機制。
[0061]
在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域c*至少是結(jié)構(gòu)域b1*的長度?？赡艹霈F(xiàn)這種情況的一個實例是所使用的讀出是雜交鏈反應(yīng)(hcr)的情形，如例如圖10所示。在一個實例中，當(dāng)使用雜交鏈反應(yīng)時，結(jié)構(gòu)域c*可以根據(jù)長度來定義，由此結(jié)構(gòu)域c*的限制可以是它至少與結(jié)構(gòu)域b1*一樣長。這一要求來自之前使用雜交鏈反應(yīng)作為讀出方法的工作中獲得的見解(ang等人,chem.commun.2016,52,4219)。該出版物側(cè)重于hcr設(shè)計，即討論了hp1和hp2的設(shè)計，沒有涉及i1(或當(dāng)前的hp-i1，在本文中公開為結(jié)構(gòu)i)和i2(在本文中公開為結(jié)構(gòu)ii)，或本技術(shù)所要求的締合立足點概念。在參考出版物中，討論了hcr中所涉及的結(jié)構(gòu)域的長度和cg內(nèi)容的設(shè)計。在本公開中，公開了將靶標(biāo)結(jié)合事件轉(zhuǎn)換成激活形式以觸發(fā)任何形式的相容讀出信號的設(shè)計引發(fā)劑探針，由此可以使用hcr產(chǎn)生讀出信號之一。
[0062]
本文公開的組合物還可包括使用一種或多種分子來產(chǎn)生信號。舉例來說，本文公
開的組合物還可包含一對核酸發(fā)夾，所述核酸發(fā)夾包含第一發(fā)夾報告子和第二發(fā)夾報告子(分別為結(jié)構(gòu)i和ii)。這些發(fā)夾報告分子與組合物的“打開”形式結(jié)合，即這些結(jié)構(gòu)與目的靶標(biāo)結(jié)合以及彼此結(jié)合的狀態(tài)或形式，從而釋放由結(jié)構(gòu)域b1*制成的發(fā)夾基序，從而產(chǎn)生信號。
[0063]
本公開的目的靶標(biāo)可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員希望檢測的任何靶標(biāo)。這些靶標(biāo)可能存在于溶液中，也可能存在于固體樣品上。在一個實例中，樣品是固體樣品。在另一個實例中，樣品是液體樣品。在另一個實例中，靶標(biāo)可以錨定或嵌入固體表面。在這些情況下，本文公開的方法和組分將與樣品結(jié)合，條件是有足夠的靶標(biāo)表面從固體表面突出。此類實例包括但不限于固定細胞、包埋細胞和成像中使用的細胞或組織。
[0064]
為此，靶標(biāo)識別或結(jié)合域x*和y*各自至少部分地與一種或多種目的靶標(biāo)互補。在一些實例中，結(jié)構(gòu)域x*和y*與一種或多種目的靶標(biāo)完全互補。在一個實例中，結(jié)構(gòu)域y*與結(jié)構(gòu)域x相鄰或下游的一種或多種目的靶標(biāo)互補或結(jié)合。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域y*與結(jié)構(gòu)域x相鄰或上游的一種或多種目的靶標(biāo)互補或結(jié)合。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域x*與一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合或互補。在另一個實例中，本文公開的組合物與一種或多種目的靶標(biāo)的結(jié)合不需要酶。
[0065]
為了約定俗成，結(jié)構(gòu)域x*和y*在目的靶標(biāo)上的結(jié)合位點分別稱為結(jié)構(gòu)域x和y。
[0066]
鑒于本文公開的結(jié)構(gòu)i和ii的“接近性”的上述定義，這不需要靶標(biāo)結(jié)合位點x和y必須彼此相鄰，以便使結(jié)構(gòu)i和ii能夠彼此結(jié)合。本文描述了結(jié)構(gòu)域x和y彼此相鄰、處于下游或上游或彼此相關(guān)。在一些實例中，結(jié)構(gòu)域x和y可以彼此相鄰。然而，這并不意味著將結(jié)構(gòu)域x和y在目的靶標(biāo)上的物理位置限制為彼此物理上相鄰。例如，如果目的靶標(biāo)是雙鏈dna，那么結(jié)構(gòu)域x可以在5’鏈上，并且結(jié)構(gòu)域y可以在3’鏈上。這與靶標(biāo)dna是否作為雙鏈dna分子存在，或者雙鏈dna是否作為變性分子存在(意味著5’鏈和3’鏈不彼此結(jié)合)無關(guān)。術(shù)語“相鄰”的范圍還涵蓋以下情況：目的靶標(biāo)的二級或三級結(jié)構(gòu)使目的靶標(biāo)上的結(jié)構(gòu)域x和y彼此接近，因此如果序列的靶標(biāo)以線性序列(也稱為一級結(jié)構(gòu))的形式呈現(xiàn)，則結(jié)構(gòu)域x和y不會被認為彼此接近或靠近。換句話說，在一個實例中，當(dāng)被視為線性序列時，靶序列上的結(jié)構(gòu)域x和y在蛋白質(zhì)上可以相距很遠。然而，蛋白質(zhì)的折疊導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域x和y彼此足夠接近，而不是本文公開的結(jié)構(gòu)i和ii能夠彼此結(jié)合并且分別結(jié)合結(jié)構(gòu)域x和y。
[0067]
如本文所用，術(shù)語“靶序列”和“目的靶標(biāo)”是同義詞，是指待使用本文公開的方法和組合物檢測的靶分子的一部分。此類靶標(biāo)可以是但不限于dna、rna、單核苷酸多態(tài)性(snp)、微小rna(mirna)、基因組dna、病毒dna、蛋白質(zhì)、翻譯后修飾的蛋白質(zhì)、細胞表面受體、代謝物、脂質(zhì)、碳水化合物和小分子。在另一個實例中，目的靶標(biāo)是但不限于dna、單核苷酸多態(tài)性(snp)、微小rna(mirna)、rna、單一蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物、小分子、蛋白質(zhì)-小分子及其組合。因此，在一個實例中，目的靶標(biāo)是rna。rna靶標(biāo)的實例是但不限于mir-21、mir-let-7a、mir-9、mir-29和sars-cov-2或其他冠狀病毒。在另一個實例中，目的靶標(biāo)是單一蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)靶標(biāo)的實例是但不限于凝血酶、白細胞介素6(il-6)和登革熱ns1。在另一個實例中，目的靶標(biāo)是蛋白質(zhì)-小分子，例如鏈霉親和素-生物素。在另一個實例中，目的靶標(biāo)是蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)復(fù)合物的實例是但不限于her2/2復(fù)合物、her2/3復(fù)合物以及her2/2和her2-3復(fù)合物。
[0068]
本文公開的組合物還可用于檢測例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、小分子-蛋白質(zhì)相
互作用或全細胞，如表2所示。
[0069]
如上所述，為了能夠與所述靶標(biāo)結(jié)合，結(jié)構(gòu)域x*和y*必須是能夠與所述靶標(biāo)結(jié)合的分子。換句話說，本領(lǐng)域技術(shù)人員在識別出目的靶標(biāo)之后，將能夠基于目的靶標(biāo)的特征產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域x*和y*。因此，在一個實例中，結(jié)構(gòu)域x*和y*是但不限于核酸序列、蛋白質(zhì)序列(包括其翻譯后修飾形式)、抗體、抗原和小分子。
[0070]
本文公開的組合物，即第一發(fā)夾引發(fā)劑分子和第二引發(fā)劑分子及其任何變體，可包含核酸序列。也就是說，各個分子中公開的結(jié)構(gòu)域可以包含核酸序列。在一個實例中，這里公開的結(jié)構(gòu)域是核酸序列。在另一個實例中，除結(jié)構(gòu)域x*和y*之外的所有結(jié)構(gòu)域都是核酸序列。換句話說，在一個實例中，結(jié)構(gòu)域x*和y*不是核酸序列。在這些情況下，本文公開的其余結(jié)構(gòu)可包含核酸序列或由核酸序列組成。
[0071]
在另一個實例中，公開的組合物可包含以下結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域a*的長度在3至10個核苷酸之間；其中結(jié)構(gòu)域b1*的長度至少為3個核苷酸；其中結(jié)構(gòu)域b2*的長度在2至6個核苷酸之間；其中結(jié)構(gòu)域c*至少是結(jié)構(gòu)域b1*的長度；其中結(jié)構(gòu)域d*的長度在6至12個核苷酸之間；并且其中結(jié)構(gòu)域e*的長度在2至8個核苷酸之間。在另一個實例中，本文公開的組合物包含以下結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域a*的長度在3至10個核苷酸之間；其中結(jié)構(gòu)域b1*的長度至少為3個核苷酸；其中結(jié)構(gòu)域b2*的長度在2至6個核苷酸之間；其中結(jié)構(gòu)域c*至少是結(jié)構(gòu)域b1*的長度；其中結(jié)構(gòu)域d*的長度在6至12個核苷酸之間；其中結(jié)構(gòu)域e*的長度在2至8個核苷酸之間；并且其中結(jié)構(gòu)域s的長度在1-50nm之間。
[0072]
本文還公開了一種用于檢測樣品中一種或多種目的靶標(biāo)的存在的方法，所述方法包括：將至少一種如本文定義的第一發(fā)夾引發(fā)劑分子和至少一種如本文定義的第二引發(fā)劑分子添加到被認為包含一種或多種目的靶標(biāo)的樣品中(靶標(biāo)識別步驟)；使第一發(fā)夾引發(fā)劑分子和第二引發(fā)劑分子結(jié)合到目的靶標(biāo)上，這使第二引發(fā)劑分子與第一發(fā)夾引發(fā)劑分子接近，從而使第一發(fā)夾引發(fā)劑分子進入激活形式以呈現(xiàn)三向信號產(chǎn)生接合點，從而允許結(jié)構(gòu)域b1*和b2*結(jié)合(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟)；添加至少一種如本文定義的信號產(chǎn)生分子/信號產(chǎn)生復(fù)合物(例如，第一報告分子和第二報告分子，其可分別具有根據(jù)結(jié)構(gòu)iii和iv的結(jié)構(gòu))，由此在與三向信號產(chǎn)生接合點結(jié)合后，至少信號產(chǎn)生分子/信號產(chǎn)生復(fù)合物的結(jié)合產(chǎn)生信號；并且其中信號的存在表明樣品中存在一種或多種目的靶標(biāo)。如本文所用，激活形式的術(shù)語“激活”是指結(jié)構(gòu)域b1*和b2*的釋放，使得這些結(jié)構(gòu)域可用于下游雜交反應(yīng)。參見例如圖1，其中滅活形式在第二張圖中由包含b1*和b2*的發(fā)夾結(jié)構(gòu)表示，并且激活形式在第三張圖中由結(jié)構(gòu)域b*和c*顯示。
[0073]
上面概述的實例說明了使用信號產(chǎn)生復(fù)合物的一種情況，所述復(fù)合物使用一對報告分子(也稱為“報告子”)。這些報告分子的功能是檢測本文公開的組合物與目的靶標(biāo)的結(jié)合，從而產(chǎn)生可被定量或定性的信號(也稱為讀出信號)。為此，產(chǎn)生的信號可以是任何類型的可測量信號，最常見的實例是光信號。通過使用例如但不限于熒光分子、熒光團、生色團、酶、蛋白質(zhì)、染料、色素、綴合抗體、小分子和無機納米材料、納米顆粒等，可以直接或間接地產(chǎn)生此類光信號。如本文所用，術(shù)語“直接”和“間接”描述報告分子的結(jié)合類型。直接結(jié)合表示報告分子與本文公開的組合物直接結(jié)合。間接結(jié)合表示報告分子通過中間體與要求保護的組合物結(jié)合。可用于檢測所產(chǎn)生的信號的可視化原理是但不限于福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)、發(fā)光、熒光、光學(xué)測量、光譜分析及其組合?；谒x擇的可視化原理，本領(lǐng)域技術(shù)
人員將能夠確定要使用的適當(dāng)染料、綴合物或反應(yīng)物以可視化所產(chǎn)生的信號。
[0074]
以使用金納米顆粒(也稱為aunp)舉例說明，在其非觸發(fā)形式中，hp1和hp2具有自由的單鏈末端(分別為結(jié)構(gòu)域b和d*)。自由末端與aunp結(jié)合并穩(wěn)定顆粒。反應(yīng)溶液因此保持紅色。當(dāng)hp1和hp2通過雜交鏈反應(yīng)(hcr)長成一條長dna鏈時，自由末端的可用性會急劇下降。當(dāng)受到更高鹽濃度的激發(fā)時，金納米顆粒會聚集，然后在反應(yīng)中導(dǎo)致顏色變化為紫色/灰色。
[0075]
如本文所用，術(shù)語“信號產(chǎn)生分子”和“信號產(chǎn)生復(fù)合物”是指能夠產(chǎn)生信號輸出的物質(zhì)，例如，用于評估測定或?qū)嶒灲Y(jié)果的目的。該讀出可以是一種或多種信號產(chǎn)生分子與給定靶標(biāo)反應(yīng)的反應(yīng)，和/或信號產(chǎn)生復(fù)合物與給定靶標(biāo)反應(yīng)的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠根據(jù)待放大的靶標(biāo)或信號的類型選擇和利用合適的信號產(chǎn)生分子和/或信號產(chǎn)生復(fù)合物。信號產(chǎn)生分子或信號產(chǎn)生復(fù)合物的非限制性實例是核酸序列、蛋白質(zhì)、抗體、小分子、其組合等，以及組合或系統(tǒng)，例如抗體/辣根過氧化物酶檢測系統(tǒng)等。在一個實例中，雜交鏈反應(yīng)(hcr)被用作信號產(chǎn)生復(fù)合物，也就是說hcr被用于產(chǎn)生讀出信號。在另一個實例中，福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)用于產(chǎn)生和定量讀出信號。
[0076]
如本文所用，術(shù)語“檢測部分”是指存在于信號產(chǎn)生分子上并且能夠在信號產(chǎn)生分子與靶標(biāo)結(jié)合后產(chǎn)生信號或讀出的部分。檢測部分的非限制性實例是熒光團、生色團、小分子、蛋白質(zhì)、無機納米材料及其組合。在另一個實例中，檢測部分可以包含一對分子，例如熒光團-猝滅劑對。當(dāng)存在時，可以沿著本文公開的任何一種報告分子的任何位置發(fā)現(xiàn)檢測部分，只要它滿足其能夠檢測被觸發(fā)的構(gòu)建體的目的。此外，報告分子可以包含一種或多種檢測部分。在一個實例中，可以在結(jié)構(gòu)域b、c和d之間發(fā)現(xiàn)檢測部分。在另一個實例中，可以在結(jié)構(gòu)域d*的自由末端或沿著任何其他結(jié)構(gòu)域，例如結(jié)構(gòu)域c’發(fā)現(xiàn)檢測部分。在一個實例中，報告分子包含2個檢測部分。本文還包括其中報告分子不包含任何檢測部分的實例。在此類實例中，信號產(chǎn)生分子的結(jié)合是使用其他方式完成的，例如但不限于靶分子本身的結(jié)構(gòu)或任何其他特征的變化。
[0077]
在一個實例中，本文公開的組合物還包含一種或多種報告分子。在一個實例中，如本文所公開的報告分子用于信號產(chǎn)生和/或放大。在另一個實例中，本文公開的組合物包含一對報告分子。在又一個實例中，報告分子是第一發(fā)夾報告子和第二發(fā)夾報告子。發(fā)夾報告子的結(jié)構(gòu)的實例可以在本文公開的hp1和hp2中找到。在另一個實例中，報告分子是分別包含根據(jù)結(jié)構(gòu)iii和iv的核酸發(fā)夾：
[0078][0079]
在這個實例中，第一發(fā)夾報告子包含結(jié)構(gòu)域b、c、d和c*。在一個實例中，結(jié)構(gòu)域b是長度在6至12個核苷酸之間的5’核酸突出端。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域d是長度在6至12個核苷酸之間的發(fā)夾環(huán)。在一個實例中，第一發(fā)夾報告子包含第一檢測部分；任選地在結(jié)構(gòu)域c’和d之間。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)iii的結(jié)構(gòu)域c*如本文所定義。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域b是長度在6到12個核苷酸之間的5’核酸突出端，結(jié)構(gòu)域d是長度在6到12個核苷酸之間的發(fā)夾環(huán)，并且結(jié)構(gòu)域c*如本文所定義。
[0080]
在另一個實例中，第二發(fā)夾報告子包含結(jié)構(gòu)域d*、c、b3*和c*’。在一個實例中，結(jié)構(gòu)域b3*是與結(jié)構(gòu)域b長度相同的發(fā)夾環(huán)。在一個實例中，結(jié)構(gòu)域b3*至少部分地與結(jié)構(gòu)域b互補。這是因為一旦在觸發(fā)狀態(tài)下與發(fā)夾引發(fā)劑分子結(jié)合，第一和第二發(fā)夾報告分子就會展開并與發(fā)夾引發(fā)劑分子結(jié)合，如例如圖10所示。
[0081]
在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域d*是與結(jié)構(gòu)域d長度相同的核酸突出端。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域d*的長度在6至12個核苷酸之間。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域c’和c*’具有相同的長度，并且能夠相互結(jié)合。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域b3*和d各自形成發(fā)夾環(huán)。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域d和d*彼此互補。在一個實例中，結(jié)構(gòu)域c’和c*’彼此互補。在另一個實例中，第二發(fā)夾報告子包含第二檢測部分；任選地在結(jié)構(gòu)域d*的自由末端或沿著結(jié)構(gòu)域c’。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域b3*是與結(jié)構(gòu)域b長度相同的發(fā)夾環(huán)，其中結(jié)構(gòu)域b3*與結(jié)構(gòu)域b至少部分互補，結(jié)構(gòu)域d*是與結(jié)構(gòu)域d長度相同的核酸突出端，結(jié)構(gòu)域c’和c*’長度相同并且能夠彼此結(jié)合，并且結(jié)構(gòu)域b3*和d各自形成發(fā)夾環(huán)。
[0082]
因此，在一個實例中，第一發(fā)夾報告子包含結(jié)構(gòu)域b、c、d和c*；結(jié)構(gòu)域b是長度在6到12個核苷酸之間的5’核酸突出端；結(jié)構(gòu)域d是長度在6到12個核苷酸之間的發(fā)夾環(huán)；第二發(fā)夾報告子包含結(jié)構(gòu)域d*、c’、b3*和c*’；結(jié)構(gòu)域b3*是與結(jié)構(gòu)域b長度相同的發(fā)夾環(huán)，其中結(jié)構(gòu)域b3*至少部分地與結(jié)構(gòu)域b互補；結(jié)構(gòu)域d*是與結(jié)構(gòu)域d長度相同的核酸突出端；結(jié)構(gòu)域c’和c*’長度相同并且能夠彼此結(jié)合；并且結(jié)構(gòu)域b3*和d各自形成發(fā)夾環(huán)。
[0083]
關(guān)于報告分子的結(jié)構(gòu)，例如，結(jié)構(gòu)域b*和d*是立足點，其在本領(lǐng)域中被接受為具有6至12個核苷酸范圍內(nèi)的長度。發(fā)明人之前通過模擬和實驗驗證(數(shù)據(jù)未顯示)發(fā)現(xiàn)莖長度或結(jié)構(gòu)域c*至少與立足點長度一樣長，以穩(wěn)定發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
[0084]
在一個實例中，本文公開的組合物包含如但不限于seq id no:1到77中定義的一種或多種核酸序列。在另一個實例中，包含如seq id no:28到45中所定義但不限于它們的一種或多種核酸序列。在另一個實例中，組合物包含以下對中的任何一個或多個：seq id no.28和29，seq id no.30和31，seq id no.32和33，seq id no.34和35，seq id no.36和37，seq id no.38和39，seq id no.40和41，seq id no.42和43，和seq id no.44和45。在另一個實例中，組合物包含以下對中的任何一個或多個：seq id no.28和29，seq id no.42和43，和seq id no.44和45。
[0085]
此外，信號產(chǎn)生分子/信號產(chǎn)生復(fù)合物的非限制性實例可在以下部分中找到。
[0086]
對于使用福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)讀出的雜交鏈反應(yīng)(hcr)：
[0087]
hp1:hp2:
[0088]
需要注意的是，熒光團的位置(由上圖中的星號表示)不是固定的，并且可以在沿著整個序列的任何地方發(fā)生變化，只要星號彼此之間的相對位置產(chǎn)生可讀的信噪比即可。
[0089]
對于使用hrp模擬脫氧核酶的hcr：
[0090]
hp1:hp2:
[0091]
折疊成具有hrp模擬催化功能的二級結(jié)構(gòu)的示例性dna序列被分裂成兩個實體并
附加在hp1的結(jié)構(gòu)域b和c*或hp2的結(jié)構(gòu)域d*和c*的末端。激活后，分裂的序列重新組合形成完整的脫氧核酶，其催化讀出信號的形成。
[0092]
對于使用分裂酶基序的hcr：
[0093][0094]
催化酶，例如β-半乳糖苷酶，可以分裂成兩個實體，它們僅在信號激活時重組。在這種情況下，分裂的β-半乳糖苷酶可以綴合到發(fā)夾單體上以產(chǎn)生這種效果。
[0095]
對于熒光團-猝滅劑(f-q)讀出：
[0096]
f-q復(fù)合物:
[0097]
需要注意的是，這里描述的熒光團用星號表示，猝滅劑用圓圈表示，它們可以在兩條鏈之間交換。它們的位置可以在沿著結(jié)構(gòu)域c的任何位置發(fā)生改變，只要它們彼此相鄰。
[0098]
對于x-探針讀出：
[0099][0100]
xq-pc:xf-p:x探針-f:x探針-q:
[0101]
x-探針可以被使用，其中x探針-f和x探針-q是通用的序列，并且xq-pc和xf-p鏈的序列可以相應(yīng)地改變。不管使用哪種靶序列/探針序列，這都允許標(biāo)記的寡核苷酸可以重復(fù)使用，代表探針設(shè)計優(yōu)化過程中的成本節(jié)約和周轉(zhuǎn)時間減少。
[0102]
雙鏈和/或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非限制性實例
[0103][0104]
在本文所公開的示例性方法中使用的組分鏈的比率可以變化。例如，可以使用1:1到2:1之間的hp1:hp2的比率，其依賴于預(yù)定的靶標(biāo)。舉例來說，當(dāng)檢測核酸靶標(biāo)時，hp-i1和i2之比可以是1:1。在其他實例中，針對其他靶標(biāo)類別的hp-i1和i2的相對比率依賴于識別部分x*和y*的相對結(jié)合親和力。識別部分x*和y*的相對結(jié)合親和力將根據(jù)特定靶標(biāo)而不同(例如，可以使用檢測蛋白質(zhì)靶標(biāo)時推薦用于商業(yè)抗體的相對稀釋比)。[hp1/hp2]與[hp-i1/i2]的比率被取作一組，也就是說讀出鏈與引發(fā)劑鏈的比率，該比率在1:1(通常使用)至5:1(可用于改善測定動力學(xué))的范圍內(nèi)。絕對濃度可以從亞納摩爾到微摩爾范圍使用。在一個實例中，使用比率為1:1:1:1的所有4種組分，得到顯式濃度為20nm。對于在該實例中所示的實驗結(jié)果，已經(jīng)使用1:1:2:1(結(jié)構(gòu)i-iv，按順序)的比率，得到顯式濃度為20nm hp-i1、20nm i2、40nm hp1和20nm hp2。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，這些濃度和比率可以根據(jù)本文公開的方法的預(yù)期靶標(biāo)所規(guī)定的要求而優(yōu)化。
[0105]
在一個實例中，如本文所公開的組合物包含4個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，2個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，2個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在另一個實例中，如本文所公開的組合物包含4個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，2個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，2個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，4個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，4個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6
個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含8個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含4個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，8個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約2nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約2nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約2nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含5個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，3個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約2nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含4個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，2個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，12個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，2個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含4個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域a，9個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b1，2個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域b2，11個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域c，6個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域d，2個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸長度的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含9個核苷酸的結(jié)構(gòu)域b1和12個核苷酸的結(jié)構(gòu)域c。在又一個實例中，如本文所公開的組合物包含9個核苷酸的結(jié)構(gòu)域b、12個核苷酸的結(jié)構(gòu)域c和6個核苷酸的結(jié)構(gòu)域d。在另一個實例中，如本文所公開的組合物包含3個核苷酸的結(jié)構(gòu)域a，7個核苷酸的結(jié)構(gòu)域b1，2個核苷酸的結(jié)構(gòu)域b2，
12個核苷酸的結(jié)構(gòu)域c，9個核苷酸的結(jié)構(gòu)域d，3個核苷酸的結(jié)構(gòu)域e和15個核苷酸的結(jié)構(gòu)域s(長度大致約5nm)。
[0106]
鑒于本文的公開內(nèi)容，如果本文公開的結(jié)構(gòu)所需的其他序列未明確提及(例如，定義了序列k但未定義序列k*)，則本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，星號結(jié)構(gòu)域是對應(yīng)的非星號結(jié)構(gòu)域的反向互補版本(從5’到3’方向看)，與對應(yīng)的非星號結(jié)構(gòu)域的結(jié)合是互補的，無需明確提及。在一個實例中，星號結(jié)構(gòu)域的長度與非星號對應(yīng)項的長度相同。本指南的一個例外是結(jié)構(gòu)域x*，因為結(jié)構(gòu)域x和結(jié)構(gòu)域x*的長度可能不同。這是因為結(jié)構(gòu)域x*的長度取決于目的靶標(biāo)上的結(jié)合位點，也就是結(jié)構(gòu)域x。也就是說，結(jié)構(gòu)域x*的長度可以比結(jié)構(gòu)域x的長度短，這也適用于結(jié)構(gòu)域y和y*，其中結(jié)構(gòu)域y*的長度可以比結(jié)構(gòu)域y的長度短，如上文對于結(jié)構(gòu)域x所示的。
[0107]
在一個實例中，如本文所定義的一種或多種組合物的每一組分同時或依次添加。在另一個實例中，本文公開的組合物的所有組分可以與包含一種或多種目的靶標(biāo)的樣品一起全部同時添加，從而導(dǎo)致所謂的“一鍋反應(yīng)”。因此，在另一個實例中，如本文所公開的方法在單個反應(yīng)容器中進行。
[0108]
伸長締合立足點概念利用發(fā)夾鎖在觸發(fā)時將締合區(qū)域長度從初始的較短長度動態(tài)調(diào)整為最終的較長長度。因此，這種設(shè)計能夠通過具有更長的締合區(qū)域來改善動力學(xué)和熱力學(xué)，而無需權(quán)衡會導(dǎo)致更高的電路泄漏率。進行了詳細研究以了解此修改后的設(shè)計中每個附加結(jié)構(gòu)域的貢獻，最終形成了一套設(shè)計指南。使用具有4
→
6個核苷酸、5
→
8個核苷酸和6
→
9個核苷酸的伸長締合長度的三個發(fā)夾鎖定引發(fā)劑設(shè)計來表征該設(shè)計對平衡信號(熱力學(xué))和整體電路動力學(xué)的影響。結(jié)果表明，動態(tài)伸長的締合立足點設(shè)計將平衡信號提高了許多倍，其動力學(xué)接近每個最終締合長度可能的上限，而發(fā)夾鎖可有效抑制電路泄漏。這轉(zhuǎn)化為提高了實際性能，同時降低了檢測限并提高了檢測速度。
[0109]
本文還公開了一種用于檢測樣品中的一種或多種目的靶標(biāo)的方法，所述方法包括提供被認為包含所述一種或多種目的靶標(biāo)的樣品并使用如本文公開的組合物檢測所述一種或多種目的靶標(biāo)，其中每種組合物對一個目的靶標(biāo)是特異性的。在另一個實例中，本文公開的組合物可以對一個以上目的靶標(biāo)具有特異性。在又一個實例中，組合物可以同時與一個以上目的靶標(biāo)結(jié)合。在另一個實例中，如本文所定義的第一發(fā)夾引發(fā)劑分子和第二引發(fā)劑分子與至少一個目的靶標(biāo)結(jié)合。
[0110]
在另一個實例中，公開了一種用于檢測樣品中一種或多種目的靶標(biāo)的存在的方法，所述方法包括將一種或多種如本文公開的組合物添加到所述樣品中；允許所述一種或多種組合物與被認為包含在所述樣品中的所述一種或多種目的靶標(biāo)結(jié)合；測量由所述組合物與所述目的靶標(biāo)結(jié)合產(chǎn)生的一種或多種信號；其中一種或多種信號的產(chǎn)生檢測到所述樣品中存在所述目的靶標(biāo)中的一種或多種。
[0111]
本文中還說明了本文公開的方法在單個溫度下(即等溫法中)進行，這和本領(lǐng)域已知的需要多個溫度的方法相反。在一個實例中，如本文所公開的方法在單個溫度下進行。在另一個實例中，進行本文公開的方法的溫度是所得復(fù)合物(即包含目的靶標(biāo)、第一發(fā)夾引發(fā)劑分子和第二引發(fā)劑分子的復(fù)合物)保持穩(wěn)定的溫度。在另一個實例中，本文公開的方法在室溫下進行。在另一個實例中，所述方法在單個溫度下進行，在該溫度下，與目的靶標(biāo)結(jié)合的組合物是穩(wěn)定的。也就是說，本文公開的方法可以在高達60℃的溫度下進行。超出60℃的
實驗設(shè)置需要更長的結(jié)構(gòu)域長度，以確保復(fù)雜的穩(wěn)定性。
[0112]
潛在的解釋是，在一些實例中，所述方法由dna雜交驅(qū)動?；诖?，可以說dna復(fù)合物將保持穩(wěn)定至60℃，這是在聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)中使用的常見退火溫度，pcr是一種也已知基于dna雜交的方法。dna雜交的穩(wěn)定性由其熔融溫度表示，熔融溫度又由例如所用引物的長度決定。引物長度通常是但不限于18至22個核苷酸，而負責(zé)驅(qū)動信號產(chǎn)生步驟的結(jié)構(gòu)域b*和c*的組合長度大于18個核苷酸，以用于本文公開的最短設(shè)計實例。其他結(jié)構(gòu)域a和e(伸長締合長度)或e和b2*(hp-i1(也稱為結(jié)構(gòu)i)中的發(fā)夾鎖的莖)相對較短。然而，它們以高局部濃度存在，即，在前者(即結(jié)構(gòu)域a和e)的情況下，靶標(biāo)使hp-i1和i2(分別是結(jié)構(gòu)i和ii)緊密接近，以及在后者(即結(jié)構(gòu)域e和b2*)的情況下，靶標(biāo)使hp-i1和i2處于發(fā)夾結(jié)構(gòu)內(nèi)。它們的結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)域a和e的情況下采用高濃度雙鏈體或在結(jié)構(gòu)域e和b2*的情況下處于發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，所述結(jié)構(gòu)在高達60℃的溫度下保持完整，即便是對于模擬中使用的4個核苷酸的最短實例長度。這里，4個核苷酸的最短長度是指對于4個核苷酸的總長度來說，結(jié)構(gòu)域e和b2*各自的長度為2個核苷酸。
[0113]
本文公開的方法是對認為包含一種或多種目的靶標(biāo)的樣品進行的。這些樣品可以是但不限于生物樣品和非生物樣品。生物樣品的非限制性實例是但不限于來自生物或以前的生物的任何數(shù)量的物質(zhì)。此類生物包括但不限于人、小鼠、猴子、大鼠、兔子和其他動物。這些物質(zhì)包括但不限于血液、血清、血漿、尿液、細胞、器官、組織、患病組織、骨骼、骨髓、淋巴、淋巴結(jié)、內(nèi)皮細胞、血管組織和皮膚。非生物樣品的非限制性樣品包括但不限于藥物樣品、液體樣品和不是從生物或以前的生物中獲得的樣品。在另一個實例中，樣品還可以包含細菌、病毒、真菌等。
[0114]
本文還公開了本文公開的組合物或方法在藥物篩選和/或藥物發(fā)現(xiàn)中的用途。這將是在非生物樣品上使用本文所述的組合物的一個實例。在此類實例中，如本文所公開的方法可用于測量藥物和目的靶標(biāo)之間的相互作用。作為使用細胞表面標(biāo)記作為靶標(biāo)的一個實例，引發(fā)劑探針之一可以綴合到抗體或小分子候選藥物上，而另一個引發(fā)劑探針可以綴合到對目的靶標(biāo)具有特異性的抗體上，例如細胞表面受體蛋白。當(dāng)候選藥物與目的靶標(biāo)結(jié)合時，通過本文所述方法的機制產(chǎn)生信號。作為使用溶液相的另一個實例，一些藥物發(fā)現(xiàn)平臺或方法涉及細胞因子(它們是蛋白質(zhì)靶標(biāo))的測量，細胞與藥物接觸時會分泌這些細胞因子。本文公開的方法可用于藥物發(fā)現(xiàn)中以實時定量細胞的細胞因子分泌水平，作為與一種或多種藥物接觸的效果。
[0115]
本文還公開了一種包含本文定義的組合物的試劑盒。該試劑盒將根據(jù)本文公開的方法使用。因此，在一個實例中，試劑盒至少包含如本文公開的結(jié)構(gòu)i、ii、第一報告分子和第二報告分子。在另一個實例中，這些組分是分開保存的。在另一個實例中，本文公開的試劑盒包含第一發(fā)夾引發(fā)劑分子和第二引發(fā)劑分子，其中引發(fā)劑分子被進一步修飾以適合綴合。在另一個實例中，試劑盒任選地包含i)用于進行親和綴合的試劑，或ii)用于與選自但不限于dna、抗體和蛋白質(zhì)的分子進行共價綴合的試劑。
[0116]
在一個實例中，在如本文所述的試劑盒中，組合物的每一組分以凍干粉末的形式或作為濃縮儲備溶液單獨提供。組分以何種形式提供取決于各種考慮因素，主要的考慮因素是組分的穩(wěn)定性。例如，為了更容易處理和減少對冷鏈的依賴，dna和rna可以作為凍干粉末提供，然后在使用前用水或合適的緩沖液復(fù)原。
[0117]
為了獲得本文公開的組合物，建立了用于締合立足點的穩(wěn)定伸長的設(shè)計指南，并且確定了被修飾的結(jié)構(gòu)域的不同配置如何影響所提議設(shè)計的整體性能。三組發(fā)夾引發(fā)劑涉及不同程度的締合長度伸長，有效地分別為結(jié)構(gòu)域a和e或結(jié)構(gòu)域a*和e*的總和。(4
→
6個核苷酸，5
→
8個核苷酸和6
→
9個核苷酸)從設(shè)計框架中入圍。已經(jīng)使用4
→
6個核苷酸、5
→
8個核苷酸和6
→
9個核苷酸(結(jié)構(gòu)域a的長度
→
結(jié)構(gòu)域和e的組合長度)的實例確定了這些發(fā)夾引發(fā)劑設(shè)計在提高電路性能而沒有招致大量電路泄漏的懲罰方面的直接實驗證據(jù)(參見圖4到6)。基于反應(yīng)速度、達到的平衡狀態(tài)和檢測限來評估電路性能。
[0118]
用于設(shè)計動態(tài)伸長的締合立足點的考慮因素
[0119]
在設(shè)計動態(tài)伸長的締合立足點時需要克服的困難是在發(fā)夾修飾的引發(fā)劑1(hp-i1)上具有結(jié)構(gòu)域配置的良好平衡。hp-i1與傳統(tǒng)i1設(shè)計的不同之處在于i)額外的伸長域e和ii)源自部分立足點結(jié)構(gòu)域b的結(jié)構(gòu)域b2*夾子。與任何電路設(shè)計一樣，首要考慮的是確保電路不會大量泄漏。在這種情況下，泄漏條件取決于發(fā)夾鎖(由結(jié)構(gòu)域b2*和e定義的“關(guān)閉”狀態(tài))是否能夠在沒有觸發(fā)事件的情況下保護伸長域e免于暴露自身(由結(jié)構(gòu)域a和e定義的“打開”狀態(tài))。
[0120]
圖2比較了hp-i1中結(jié)構(gòu)域a、e和b2*的不同組合，其中結(jié)構(gòu)域a和e各具有相等的4個核苷酸長度。在一個實例中，從4個核苷酸的締合長度開始，添加了相等長度的結(jié)構(gòu)域e，這也是穩(wěn)定發(fā)夾環(huán)設(shè)計的最小長度。這種泄漏被觀察到(hp1)并且直到結(jié)構(gòu)域e的2個核苷酸被去除并被結(jié)構(gòu)域b2*形式的2個核苷酸夾子替換(hp3)后才消退(hp2)。
[0121]
需要注意的是，以上段落指的是發(fā)夾莖(不是環(huán))，它包含4個核苷酸。hp-i1(例如結(jié)構(gòu)i)上發(fā)夾莖的長度是結(jié)構(gòu)域b2*和e的組合長度，它與結(jié)構(gòu)域b1*(發(fā)夾環(huán))的長度無關(guān)。這也與本文公開的結(jié)構(gòu)域b2*和e的限定范圍一致，其中兩個結(jié)構(gòu)域中的每一個必須至少有2個核苷酸長，使其總共有4個核苷酸長，這在本實例中用于穩(wěn)定發(fā)夾的莖。
[0122]
在這種情況下，夾子充當(dāng)緩沖域，以避免將結(jié)構(gòu)域e作為締合步驟的分支遷移域(有利于“打開”狀態(tài))和整個發(fā)夾莖(有利于“關(guān)閉”狀態(tài))的矛盾情況，這被證明對電路泄漏有害(如設(shè)計hp1所示)。立足點結(jié)構(gòu)域b的一部分被用作夾子結(jié)構(gòu)域，以避免在締合時在c*b*觸發(fā)域之間引入額外的間隙(圖1)。在夾子結(jié)構(gòu)域就位后，嘗試通過在設(shè)計hp4中將伸長域e增加1個核苷酸來增強平衡信號，但由于泄漏隨著時間的推移而增加，這反而導(dǎo)致“信噪比”(s/n)降低。
[0123]
當(dāng)至少在研究的反應(yīng)條件下并使用特定的序列集，締合域a的長度達到6個核苷酸時，先前已經(jīng)報道了電路泄漏的增加。研究在存在發(fā)夾鎖作為競爭性雜交反應(yīng)的一種形式下，是否有可能減少在較長締合長度下發(fā)生的泄漏量。將締合長度從4個核苷酸(hp4)增加到5個核苷酸(hp5)預(yù)期會進一步加劇泄漏。然而，當(dāng)伴隨著夾子長度增加1個核苷酸(hp6)時，福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)信號增強，而泄漏顯著減少，從而提供相當(dāng)?shù)男旁氡?s/n)作為4個核苷酸締合長度(hp3)的泄漏最少的設(shè)計。
[0124]
然后質(zhì)疑是否可以通過重新設(shè)計序列或增加夾子長度(以進一步抑制泄漏)來進一步提高信噪比(s/n)。伸長域e從ggc(hp6)變?yōu)間tg(hp7)，這被認為削弱了有利于“關(guān)閉”和“打開”狀態(tài)的反應(yīng)。有趣的是，這種修改導(dǎo)致福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)信號的凈增加和電路泄漏的減少，表明結(jié)構(gòu)域e的序列設(shè)計作為分支遷移域比作為發(fā)夾莖的一部分發(fā)揮了更突出的作用。當(dāng)夾子長度(即分別為結(jié)構(gòu)域b2和b2*)增加1個核苷酸至4個核苷酸(hp8)
時，信號和泄漏都顯著下降。這表明，過長的發(fā)夾莖長度會阻礙締合反應(yīng)，尤其是由于夾子長度過長而對“打開”狀態(tài)沒有促進作用。因此，在一個實例中，對于本文所示的實例，夾子長度(由結(jié)構(gòu)域b2*和b2定義)保持在2至3個核苷酸。在另一個實例中，結(jié)構(gòu)域b2和b2*的長度在2至6個核苷酸之間，或者是2、3、4、5或6個核苷酸。
[0125]
有了對影響hp-i1設(shè)計的因素的這種理解，就有可能為6個核苷酸的初始締合長度(hp9)設(shè)計一個伸長的締合立足點，否則這將是最具挑戰(zhàn)性的設(shè)計要求。所做的觀察可以總結(jié)為以下設(shè)計指南：
[0126]
在一個實例中，夾子結(jié)構(gòu)域b2*可用于穩(wěn)定的“關(guān)閉”狀態(tài)。在另一個實例中，夾子結(jié)構(gòu)域b2*的長度是2到6個核苷酸。
[0127]
在另一個實例中，伸長域e的長度在2和8個核苷酸之間。在另一個實例中，伸長域e的長度為2、3、4、5、6、7或8個核苷酸。
[0128]
本文公開的設(shè)計之一，例如hp3(表示為a4-6，其代表4個核苷酸的初始締合長度伸長至6個核苷酸的最終有效長度)、hp7(a5-8)和hp9(a6-9)入圍，以便在接下來的章節(jié)中對傳統(tǒng)的締合立足點和動態(tài)伸長的締合立足點設(shè)計之間進行更徹底的比較研究(圖3)。
[0129]
改進對電路泄漏的控制
[0130]
提議的伸長締合立足點的前提是調(diào)和期望反應(yīng)率和泄漏率之間的權(quán)衡。因此，只有當(dāng)電路可以從具有更長締合區(qū)域的改進反應(yīng)率中受益而不會導(dǎo)致顯著的泄漏和隨之而來的背景噪聲時，它才會被認為是一個適用的概念。為了測試這些標(biāo)準(zhǔn)，比較了hp-i1和傳統(tǒng)i1設(shè)計之間的泄漏程度及其對信噪比(s/n)的影響，其中hp-i1中締合長度等于最終的伸長締合長度。
[0131]
當(dāng)使用8個核苷酸和9個核苷酸的長締合長度時發(fā)生了顯著的泄漏，使用動態(tài)伸長的締合立足點概念大大抑制了這種泄漏(圖4a)。這轉(zhuǎn)化為電路信噪比(s/n)的明顯改善(圖4b)。由于穩(wěn)定但慢得多的泄漏反應(yīng)，伸長的締合立足點系統(tǒng)的信噪比在60分鐘后隨時間逐漸降低。此外，應(yīng)該記住，使用伸長的締合立足點可以快速(在60分鐘內(nèi))獲得平衡信號?？紤]到恒定的信號和以泄漏形式緩慢演變的噪聲，信噪比將在信號平衡點之后在數(shù)學(xué)上下降。換句話說，本文公開的結(jié)構(gòu)利用更長的締合區(qū)域來改善信號產(chǎn)生，而不會導(dǎo)致顯著的泄漏。
[0132]
使用伸長締合立足點改進動力學(xué)和熱力學(xué)
[0133]
接下來，研究了伸長的締合立足點是否受益于改進的動力學(xué)和熱力學(xué)，正如根據(jù)最終更長的締合立足點長度所假設(shè)的那樣。也就是說，hp-i1打開后的額外動力學(xué)步驟不應(yīng)對整體電路性能產(chǎn)生負面影響。在伸長締合立足點設(shè)計(結(jié)構(gòu)域a
→
a和e)中存在分離觸發(fā)劑(st)的情況下，福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)信號的演變與具有初始(僅結(jié)構(gòu)域a)和最終(結(jié)構(gòu)域a和e)締合長度的傳統(tǒng)締合立足點設(shè)計進行了比較(圖5a)。
[0134]
在獲得的平衡信號量和反應(yīng)動力學(xué)方面，伸長的締合立足點設(shè)計優(yōu)于具有初始締合長度的傳統(tǒng)設(shè)計(圖5b-d)。其平衡信號接近最終的伸長締合長度設(shè)計所達到的信號，這在預(yù)期范圍內(nèi)，因為最終的st-i1-i2組件在兩種設(shè)計中幾乎相同(hp-i1中的結(jié)構(gòu)域e*突出端除外)。電路動力學(xué)比更長的締合長度設(shè)計慢，這是可以理解的，因為額外的發(fā)夾鎖意味著額外的動力學(xué)，并且通常在這種伸長的締合立足點設(shè)計中涉及競爭步驟。換句話說，與線性引發(fā)劑設(shè)計中的初始較短締合區(qū)域相比，發(fā)夾引發(fā)劑設(shè)計改進了信號產(chǎn)生，現(xiàn)在其性能
接近線性引發(fā)劑設(shè)計中較長締合區(qū)域的性能，但不會導(dǎo)致電路泄漏。
[0135]
改進分析性能
[0136]
使用動態(tài)伸長的締合域分析分離式接近電路(spc)的分析性能，以評估其優(yōu)越的動力學(xué)和熱力學(xué)是否可以轉(zhuǎn)化為實際應(yīng)用。由改進的分離式接近電路產(chǎn)生的福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)信號取決于滴定的分離觸發(fā)劑(st)的濃度(圖6a)。對于大約0.2至10nm的濃度范圍觀察到線性劑量關(guān)系(圖6b)。該動態(tài)范圍與之前關(guān)于雜交鏈反應(yīng)(hcr)的工作一致，其讀出信號用于本文的實驗。發(fā)夾引發(fā)劑產(chǎn)生與目標(biāo)濃度直接相關(guān)的可量化信號。
[0137]
通過在反應(yīng)一小時后評估4-6個核苷酸的三種締合長度的兩種設(shè)計中的檢測限(lod)，將改進的分離式接近電路設(shè)計的性能與本領(lǐng)域已知的基于較短的初始締合長度的設(shè)計(參見ang等人，2016年)進行比較(表2)。值得注意的是，由于大量泄漏，與較長的最終締合長度進行比較沒有意義。改進的分離式接近電路中的檢測限平均比本領(lǐng)域已知的分離式接近電路提高了一個數(shù)量級(參見ang等人，2016)。進一步注意到，檢測限隨著hp-i1設(shè)計的締合長度的增加而提高，而這原本被認為對傳統(tǒng)設(shè)計不利，因為泄漏程度隨締合長度增加而增加。通過優(yōu)化分離式接近電路(spc)反應(yīng)物的濃度，可以進一步提高檢測限。在這里，發(fā)夾引發(fā)劑設(shè)計提高了測定靈敏度，這是根據(jù)檢測限來衡量的。
[0138]
這種改進的性能歸因于不同因素的組合，例如，增加的電路動力學(xué)導(dǎo)致產(chǎn)生數(shù)量顯著更多的福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)信號，這超過了明顯更慢的泄漏反應(yīng)的影響。在明顯更短的時間范圍內(nèi)獲得平衡信號的一個警告是分析要保持簡短(例如，在一小時內(nèi))；否則由改進的動力學(xué)和熱力學(xué)引起的信噪比的提高很快就會被電路泄漏的逐漸增加所侵蝕。在短時間范圍內(nèi)執(zhí)行的能力被認為是本公開的范圍內(nèi)考慮的應(yīng)用的有利特征。換句話說，發(fā)夾引發(fā)劑在更短的時間內(nèi)產(chǎn)生了更強的信號，以改進靶標(biāo)檢測。
[0139]
表1.使用本領(lǐng)域已知的引發(fā)劑1(i1)(參見ang等人，2016)和發(fā)夾引發(fā)劑1(hp-i1)設(shè)計在t＝60分鐘時實現(xiàn)的檢測限(lod)的比較。初始的較短締合域長度用于表征i1系統(tǒng)。
[0140][0141]
nt-核苷酸
[0142]
本文中說明性描述的本發(fā)明可以在缺少本文未具體公開的任何一種或多種要素、一種或多種限制的情況下適當(dāng)?shù)貙嵤?。因此，例如，術(shù)語“包含”、“包括”、“含有”等應(yīng)當(dāng)被廣泛地閱讀而不受限制。另外，本文中使用的術(shù)語和表達已被用作描述的術(shù)語而不構(gòu)成限制，并且在這些術(shù)語和表達的使用中無意排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但應(yīng)認識到在所要求保護的本發(fā)明的范圍內(nèi)可以進行各種修改。因此，應(yīng)理解盡管已經(jīng)通過優(yōu)選的實施方案和任選的特征具體公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采取本文所公開的在其中實現(xiàn)的本發(fā)明的修改和變化，并且此類修改和變化被視為處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0143]
如本技術(shù)中所用，除非上下文另外明確指示，否則單數(shù)形式“一”和“所述”包括復(fù)
數(shù)個引用對象。例如，術(shù)語“遺傳標(biāo)記”包括多個遺傳標(biāo)記，包括其混合物和組合。
[0144]
如本文所用，在制劑組分的濃度的上下文中的術(shù)語“約”典型地表示所述值的+/-5％，更典型地所述值的+/-4％，更典型地所述值的+/-3％，更典型地所述值的+/-2％，甚至更典型地所述值的+/-1％，且甚至更典型地所述值的+/-0.5％。
[0145]
在本公開全文中，某些實施方案可以范圍格式公開。應(yīng)了解，范圍格式的描述僅僅是為了方便和簡潔，且不應(yīng)當(dāng)被解釋為對于所公開范圍的范疇的固定限制。因此，范圍的描述應(yīng)被視為已經(jīng)具體地公開了所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的單獨數(shù)值。舉例來說，例如從1到6的范圍的描述應(yīng)被視為已經(jīng)具體地公開了子范圍，例如從1到3、從1到4、從1到5、從2到4、從2到6、從3到6等，以及該范圍內(nèi)的單獨數(shù)值，例如1、2、3、4、5和6。無論范圍的寬度如何，這都適用。
[0146]
某些實施方案也可以在本文中被廣泛地和一般性地描述。屬于通用公開范圍內(nèi)的更窄種類和亞屬分組中的每一個也形成本公開的部分。這包括實施方案的一般描述，附帶條件或負面限制是從該屬中去除任何主題，無論是否在本文中具體敘述了切除的材料。
[0147]
本發(fā)明已經(jīng)在本文中廣泛地和一般地進行了描述。屬于一般公開內(nèi)容內(nèi)的每個較窄的物種和亞屬分組也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的一般描述，附帶條件或負面限制是從該屬中去除任何主題，無論是否在本文中具體敘述了切除的材料。
[0148]
其他實施方案處在以下權(quán)利要求書和非限制性實施例內(nèi)。此外，當(dāng)根據(jù)馬庫什組(markush group)描述本發(fā)明的特征或方面時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明因而也根據(jù)馬庫什組的任何個別成員或成員子群而被描述。
[0149]
實驗部分
[0150]
除非另有說明，否則本研究中使用的所有dna和rna寡核苷酸均購自integrated dna technologies(idt)，并由idt進行hplc純化。核酸序列展示于表3。凍干的dna在1x tris-edta緩沖液(1x te，ph 8.0)中復(fù)原，得到約100μm儲備液并在4℃下儲存長達一年，但cy3/cy5修飾的dna儲存在-20℃并避光。凍干的dna在無核酸酶的水中復(fù)原，得到約100μm儲備液等分試樣并儲存在-80℃。以下化學(xué)品按原樣使用：氯化鈉(nacl，≥99.5％)和氯化鎂(mgcl2，≥98％)購自sigma aldrich。10x磷酸鹽緩沖鹽水(pbs，ph 7.4)和1x tris-etda(te，ph 8.0)購自1st base。在整個實驗過程中使用電阻》18.2mp/cm的milli-q水。
[0151]
nupack模擬
[0152]
nupack網(wǎng)頁服務(wù)器用于核酸結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)的設(shè)計和分析。在25℃下對n個相互作用的dna物種進行nupack分析，以形成n條鏈的最大復(fù)合物尺寸。值得注意的是，這種設(shè)置并不能充分代表在其中可能形成更高階dna復(fù)合物的溶液中的實際相互作用，尤其是當(dāng)涉及hcr時。然而，這種簡單的分析足以捕獲初始電路事件和背景噪聲形成。na
+
和mg
2+
的濃度被設(shè)置為在各自的實驗中使用的相同值。
[0153]
分離式接近電路組分的制備
[0154]
雜交鏈反應(yīng)(hcr)發(fā)夾是在實驗即將開始前制備的。將1μm用cy5標(biāo)記的發(fā)夾1(hp1)和用cy3標(biāo)記的發(fā)夾2(hp2)在反應(yīng)緩沖液中分別加熱至95℃維持5分鐘，并在冰上快速冷卻至少15分鐘。
[0155]
反應(yīng)緩沖液的基本成分是1x pbs(ph 7.4)，并且可以補充其他鹽，例如1-10mm mgcl2。也可以使用其他緩沖液，例如tris、hepes和生理鹽水-檸檬酸鈉。此后，將電路組分
混合至例如20nm hp-i1、20nm i2、40nm hp1和20nm hp2的典型的最終反應(yīng)濃度。在這種情況下，所用組分的比例為1:1:2:1(結(jié)構(gòu)i:結(jié)構(gòu)ii:結(jié)構(gòu)iii:結(jié)構(gòu)iv)。
[0156]
hcr-fret讀出的熒光測量
[0157]
所有反應(yīng)均在室溫下在384孔黑色板中進行，反應(yīng)體積為20μl。
[0158]
福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(fret)讀出在酶標(biāo)儀上測量或在共聚焦顯微鏡下成像。z位置和增益使用軟件工具針對每組dna讀出濃度進行優(yōu)化，并在整個分析過程中保持恒定。
[0159]
[0160]
[0161]
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[0163]
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[0177]
[0178]
[0179][0180]
序列
[0181]
表3提供了在本文公開的實驗中使用的dna序列的列表。從先前的分離式接近電路
(spc)設(shè)計獲得序列，而使用具有序列約束的nupack網(wǎng)頁服務(wù)器部分設(shè)計額外的結(jié)構(gòu)域。
[0182]
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[0187]