本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種重組幽門(mén)螺桿菌蛋白疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：幽門(mén)螺桿菌(helicobacterpylori，hp)是一種螺旋狀、微需氧革蘭陰性桿菌，主要定植于人胃粘膜，已造成全球50％以上人口感染(leea.preventionofhelicobacterpyloriinfection.scand-j-gastroenterol.1996.suppl215:11-15.)。hp感染是慢性胃炎、消化性潰瘍及胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(malt)等疾病的重要致病因子，并與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，已被who列為ⅰ類(lèi)致癌因子。目前質(zhì)子泵抑制劑加兩種抗生素的三聯(lián)療法是全球推薦的hp根除治療一線(xiàn)方案，但是隨著抗生素在hp感染治療中的廣泛應(yīng)用，hp耐藥株的發(fā)生率不斷上升，以致hp根除的難度加大。由于hp在胃內(nèi)棲居部位的特殊性，以及現(xiàn)在藥物治療的不足，單純依靠藥物根除hp并不是一件易事，對(duì)hp感染所致的胃、十二指腸疾病的防治難度仍很大，必須尋找新的有效方法進(jìn)行防治。借鑒人類(lèi)與傳染病作斗爭(zhēng)的經(jīng)驗(yàn)，接種疫苗有望成為預(yù)防hp感染、大幅度降低hp相關(guān)性疾病發(fā)病率的最佳途徑。目前，hp疫苗取得了極大的進(jìn)展，我國(guó)已成功研制出一種hp疫苗并獲得新藥證書(shū)，國(guó)外也有多種hp疫苗已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。所有的研究都表明，hp疫苗需要添加粘膜免疫佐劑，才具有免疫保護(hù)效果。目前公認(rèn)的最強(qiáng)的粘膜免疫佐劑是霍亂腸毒素(ct)和大腸桿菌不耐熱腸毒素(lt)，但是ct和lt對(duì)人具有較強(qiáng)的毒性，限制了它們的應(yīng)用。在粘膜疫苗研究中，作為佐劑的lt無(wú)毒或減毒突變體研究較多[parkej,chang0jh,kimjs,etal.themucosaladjuvanticityoftwonontoxicmutantsofescherichiacoliheat-labileenterotoxinvarieswithimmunizationroutes.exp.mol.med.,2000,32(2):72-78]，其基本原理是對(duì)lt具有腸毒素毒性的a亞單位進(jìn)行氨基酸點(diǎn)突變，使lt不具有毒性或降低毒性，但是仍保留其很強(qiáng)的粘膜佐劑活性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：綜上所述，本發(fā)明目的在于提供一種重組幽門(mén)螺桿菌蛋白疫苗及其制備方法，將hp尿素酶a亞單位富含抗原表位的基因片段插入編碼lta亞單位的基因中，并替換其包含毒性部位的片段制成重組質(zhì)粒，進(jìn)行表達(dá)獲取重組融合蛋白多聚體作為疫苗抗原，本發(fā)明融合抗原與ltb蛋白五聚體結(jié)合形成六聚體結(jié)構(gòu)，既保留了lt的粘膜佐劑結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及活性，又去除了其毒性，通過(guò)粘膜途徑免疫可有效誘導(dǎo)機(jī)體粘膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性iga抗體，提供了一種用于預(yù)防和治療幽門(mén)螺桿菌感染的疫苗方式。本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種重組融合蛋白，所述重組融合蛋白是由重組lta1-urea1蛋白和ltb蛋白構(gòu)成，所述重組lta1-urea1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述ltb蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。進(jìn)一步地，所述重組融合蛋白是由重組lta1-urea1蛋白和ltb蛋白五聚體通過(guò)lta2亞單位連接構(gòu)成的六聚體結(jié)構(gòu)。一種編碼上述重組融合蛋白的基因，所述基因是由幽門(mén)螺桿菌(helicobacterpylori，hp)的尿素酶a亞單位中富含抗原表位的基因片段插入大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labileenterotoxin，lt)基因中并替換a亞單位毒性基因片段制成。進(jìn)一步地，所述編碼重組融合蛋白基因的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述編碼重組融合蛋白基因用于編碼重組lta1-urea1蛋白和ltb蛋白。一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包括表達(dá)載體和外源基因，所述外源基因如seqidno.3所示。所述表達(dá)載體可采用現(xiàn)有基因工程常用表達(dá)質(zhì)粒作為表達(dá)載體。進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體為pet-11c。一種制備上述重組融合蛋白的方法，包括以下步驟：步驟a，將大腸桿菌不耐熱腸毒素基因中a亞單位基因編碼核苷酸序列100-585bp去除以形成基礎(chǔ)基因，并將幽門(mén)螺桿菌尿素酶a亞單位基因片段插入所述基礎(chǔ)基因獲得了lt-urea1融合基因序列；步驟b，將所述lt-urea1融合基因序列與質(zhì)粒表達(dá)載體pet-11c連接，獲得重組質(zhì)粒pet-11c/lt-urea1；步驟c，將所述組質(zhì)粒pet-11c/lt-urea1轉(zhuǎn)入宿主菌進(jìn)行表達(dá)獲取重組融合蛋白。一種重組幽門(mén)螺桿菌蛋白疫苗，所述疫苗的活性成分包括上述重組融合蛋白。d-半乳糖填料(thermo，20372)僅能與ltb五聚體結(jié)合，不能與lta1-urea1蛋白結(jié)合。如果lta1-urea1蛋白與ltb蛋白五聚體解離，則純化產(chǎn)物中就不含有l(wèi)ta1-urea1蛋白。而采用d-半乳糖填料純化獲得的產(chǎn)物，電泳可見(jiàn)lta1-urea1蛋白條帶。這一結(jié)果，間接證實(shí)了lta1-urea1蛋白和ltb蛋白五聚體結(jié)合形成六聚體。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明一種重組幽門(mén)螺桿菌蛋白疫苗及其制備方法，將候選抗原尿素酶a亞單位中富含抗原表位的片段插入lt的a亞單位片段中并替換其毒性部位作為疫苗抗原，通過(guò)lta2片段與ltb蛋白五聚體連接，既保留了lt的粘膜佐劑結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及活性，又去除了其毒性，通過(guò)粘膜途徑免疫可有效誘導(dǎo)機(jī)體粘膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性iga抗體，無(wú)需添加佐劑即可獲得較高的免疫效果，提供了一種用于預(yù)防和治療治療幽門(mén)螺桿菌感染的疫苗方式，具有重要的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。附圖說(shuō)明此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的限定。在附圖中：圖1為本發(fā)明重組質(zhì)粒pet-11c/lt-urea1的構(gòu)建示意圖；圖2為本發(fā)明重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果；圖3為本發(fā)明sds-page觀察目的蛋白表達(dá)鑒定結(jié)果；圖4為本發(fā)明蛋白純化鑒定結(jié)果；圖5為對(duì)比例重組質(zhì)粒pet-22b/urea-1構(gòu)建示意圖；圖6為對(duì)比例urea-1蛋白表達(dá)鑒定結(jié)果；圖7為對(duì)比例urea-1蛋白純化鑒定結(jié)果；圖8為唾液特異性iga檢測(cè)結(jié)果；圖9為血清特異性igg檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的示意性實(shí)施方式及其說(shuō)明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1合成基因：以genbank公布的大腸桿菌不耐熱腸毒素基因(genbank:ab011677.1)核酸序列為模板進(jìn)行改造，具體設(shè)計(jì)如下：編碼lt的基因全長(zhǎng)1148bp，包括：lta信號(hào)肽(18個(gè)氨基酸)基因、編碼lta(240個(gè)氨基酸)的基因、編碼ltb信號(hào)肽(21個(gè)氨基酸)基因及編碼ltb(103個(gè)氨基酸)的基因。在編碼lta的基因末尾與編碼ltb信號(hào)肽基因開(kāi)頭處有一個(gè)移碼閱讀框，因而編碼整個(gè)lt的基因是一個(gè)連續(xù)的dna序列。其完整基因核苷酸序列如seqidno.4所示。經(jīng)生物信息學(xué)分析及結(jié)構(gòu)分析，去除lta亞單位基因編碼核苷酸序列100-585bp，將幽門(mén)螺桿菌尿素酶a亞單位基因片段urea1插入其中以替換去除的lta亞單位基因編碼核苷酸序列100-585bp，并在5’端引入ndei酶切位點(diǎn)，3’端引入bamhi酶切位點(diǎn)，形成編碼重組融合蛋白的融合基因lt-urea1，其核苷酸序列如seqidno.3所示。所述幽門(mén)螺桿菌尿素酶a亞單位基因片段urea1核苷酸序列如seqidno.5所示。合成基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實(shí)施例2重組質(zhì)粒pet-11c/lt-urea1的構(gòu)建，如圖1所示：表達(dá)載體采用pet-11c，購(gòu)于novagen公司。該表達(dá)載體攜帶氨芐抗性基因，是化學(xué)物質(zhì)iptg誘導(dǎo)控制的模式，表達(dá)水平高。未誘導(dǎo)前iaciq編碼阻遏蛋白，該蛋白可同操縱子中的操縱基因相結(jié)合，從而控制相鄰結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄作用；當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，阻遏蛋白因受誘導(dǎo)物的作用，其構(gòu)形發(fā)生變化，從而失去同操縱基因的親和性而解脫下來(lái)，聚合酶便可對(duì)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而進(jìn)行表達(dá)。在該質(zhì)粒ndei位點(diǎn)后插入含有l(wèi)ta信號(hào)肽的重組目的基因及含有l(wèi)tb信號(hào)肽的ltb基因，pet-11c能在宿主菌中共表達(dá)重組目的蛋白lta1-urea1及l(fā)tb蛋白，利用lta及l(fā)tb信號(hào)肽，分別將目的蛋白lta1-urea1蛋白和ltb蛋白分泌至胞周質(zhì)組裝成lta1-urea1+5ltb的六聚體而發(fā)揮相應(yīng)的靶向和佐劑作用。編碼蛋白lta1-urea1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，編碼ltb蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。將合成基因序列，上游引入ndei、下游引入bamhi酶切位點(diǎn)，雙酶切后連接經(jīng)同樣酶雙酶切的pet-11c，酶切反應(yīng)體系配制如表1所示：表1重組質(zhì)粒構(gòu)建酶切反應(yīng)體系將上述反應(yīng)物混勻，酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察，酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。轉(zhuǎn)化e.coli/dh5a感受態(tài)，氨芐抗性lb平板37℃培養(yǎng)，調(diào)取單菌落用氨芐抗性液體lb培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定，質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，融合基因序列與預(yù)計(jì)完全一致。實(shí)施例3目的蛋白表達(dá)、純化及鑒定：宿主菌采用e.coli/bl21(de3)，購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司?；蛐停篺-omptgaldcmlonhsdsb(rb-mb-)λ(de3[lacilacuv5-t7gene1ind1sam7nin5])。該菌株用于以t7rna聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主。t7噬菌體rna聚合酶基因的表達(dá)受控于λ噬菌體de3區(qū)的lacuv5啟動(dòng)子，該區(qū)整合于bl21的染色體上。該菌適合于非毒性蛋白的表達(dá)。(1)轉(zhuǎn)化取重組質(zhì)粒pet-11c/lt-urea1轉(zhuǎn)化e.coli/bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞(tiangen，code：cb105)，按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，氨芐抗性lb平板篩選陽(yáng)性重組子。(2)重組工程菌鑒定挑取氨芐抗性篩選平板上的單個(gè)菌落，接種10ml氨芐抗性lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，用ndei和bamhi做雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示，見(jiàn)5.6kb表達(dá)載體片段和996bplt-urea1基因片段，lane1：pet-11c/lt-urea1經(jīng)ndei和bamhi雙酶產(chǎn)物，lane2：核酸marker(takara，dl5000)。(3)表達(dá)鑒定(a)取鑒定正確的菌液，加入氨芐抗性lb培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)；然后加入miptg，16℃誘導(dǎo)表達(dá)。(b)細(xì)菌破碎：將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液取出，離心處理，棄上清，加入pbs重懸，冰水浴超聲破菌。取樣涂片革蘭染色鏡檢，見(jiàn)破菌完全后，取上清離心處理，分離上清和沉淀。(c)sds-page觀察目的蛋白表達(dá)情況：分別取破菌未離心樣品(全菌)、離心后上清及沉淀樣品，調(diào)整至適合的濃度，以lt及未誘導(dǎo)全菌樣品作對(duì)照，用5×sds-page上樣buffer處理后，各15μl上樣，進(jìn)行15％sds-page電泳觀察結(jié)果，如圖3所示。lane1：16誘導(dǎo)前全菌，lane2：16誘導(dǎo)后全菌，lane3：16誘導(dǎo)后超聲上清，lane4：蛋白marker(thermo，26616)，lane5：16誘導(dǎo)后超聲沉淀。見(jiàn)21.1kd重組lta1-urea1表達(dá)及11.7kdltb表達(dá)，如圖中箭頭所指。(4)目的蛋白純化鑒定(a)取d-半乳糖填料(thermo，20372)1ml，按說(shuō)明書(shū)操作，用pbs洗滌，將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體超聲破菌上清10ml加入層析柱中，室溫結(jié)合1h。(b)用pbs洗滌，用含300mmd-半乳糖的pbs洗脫，分管收集。(c)sds-page觀察目的蛋白表達(dá)情況：取15μl樣品上樣，進(jìn)行15％sds-page電泳觀察結(jié)果，如圖4所示，lane1：蛋白marker(thermo，26616)，lane2-5：純化樣品，見(jiàn)21.1kdlta1-urea1及11.7kdltb條帶。對(duì)比例urea-1蛋白的制備，所述urea-1蛋白的氨基酸序列如seqidno.6所示：1、pet-22b/urea-1重組質(zhì)粒獲得采用幽門(mén)螺桿菌尿素酶a亞單位基因片段urea1編碼urea1，所述幽門(mén)螺桿菌尿素酶a亞單位基因片段urea1核苷酸序列如seqidno.5所示，上游引入ndei、下游引入xhoi酶切位點(diǎn)，插入pet-22b(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒，pet-22b(+)購(gòu)自novagen(69744-3)。重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)構(gòu)示意圖如圖5所示。2、urea-1的蛋白表達(dá)(1)表達(dá)取pet-22b/urea-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化e.coli/bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞(tiangen，code：cb105)，按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，氨芐抗性lb平板篩選陽(yáng)性重組子。挑取氨芐抗性篩選平板上的單個(gè)菌落，接種10ml氨芐抗性lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，用ndei和bamhi做雙酶切鑒定。取鑒定正確的菌液，接種氨芐抗性的lb培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)。加入iptg，37℃誘導(dǎo)表達(dá)。3、urea-1的蛋白鑒定(1)細(xì)菌破碎將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液取出，離心處理，棄上清，加入a液重懸(a液：50mmpb(ph7.4)+300mmnacl+50mmimidazole)，冰水浴超聲破菌。取樣涂片革蘭染色鏡檢，見(jiàn)破菌完全后，離心處理，分離上清和沉淀。(2)純化用鎳離子親和柱純化破菌上清(histraptmff，ge)，a液：50mmpb(ph7.4)+300mmnacl+50mmimidazole，b液：50mmpb(ph7.4)+300mmnacl+200mmimidazole。分管收集純化樣品。(3)sds-page觀察目的蛋白表達(dá)情況分別取破菌未離心樣品(全菌)、離心后上清及沉淀樣品，調(diào)整至適合的濃度，以lt及未誘導(dǎo)全菌樣品作對(duì)照，用5×sds-page上樣buffer處理后，各15μl上樣，進(jìn)行15％sds-page電泳觀察結(jié)果，urea-1表達(dá)如圖6所示，lane1：誘導(dǎo)前全菌，lane2：誘導(dǎo)后超聲沉淀，lane3：誘導(dǎo)后超聲上清，lane4：誘導(dǎo)后全菌，見(jiàn)蛋白表達(dá)(箭頭所示)。urea-1純化和如圖7所示，lane1-4：urea-1純化樣品，lane5：蛋白marker(thermo，26616)，純化獲得12.6kd蛋白。免疫性能測(cè)試：(一)、免疫原性檢測(cè)以純化實(shí)施例1制備的重組蛋為免疫原，分別通過(guò)注射(50μg)和灌胃(200μg)方式免疫小鼠，檢測(cè)血清、唾液特異性抗體，以鑒定重組蛋白的免疫原性。1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：balb/c小鼠，6～8周齡，雌性，spf級(jí)，60只，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。2、動(dòng)物分組，如表1所示：表1實(shí)施例制備的重組融合蛋白a1和對(duì)比例制備的urea-1蛋白免疫原性檢測(cè)動(dòng)物分組分組動(dòng)物數(shù)(只)抗原及免疫劑量免疫方式1組10a150μg/只注射2組10a1200μg/只灌胃3組10urea-150μg/只注射4組10urea-1200μg/只灌胃5組10pbs注射6組10pbs灌胃注：本發(fā)明制備的重組融合蛋白命名為a1。3、免疫方案動(dòng)物分別于0、7、14天免疫，共3次。4、特異性抗體檢測(cè)免疫后21天，采集血液和唾液標(biāo)本，elisa檢測(cè)抗原特異性血清igg及唾液siga。每個(gè)樣品做雙重復(fù)。(1)酶標(biāo)板包被取urea-1蛋白，用包被液(碳酸鹽緩沖液，ph9.6)稀釋為4μg/ml，100μl/孔包被酶標(biāo)板，封閉后4℃保存?zhèn)溆谩?2)標(biāo)本稀釋?zhuān)阂钥贵w稀釋液按1：1000稀釋血清；1：5稀釋唾液。(3)加樣：按100μl/孔向酶標(biāo)板加入稀釋后的待檢測(cè)樣品，37℃放置60min，pbst洗滌4次，拍干。(4)抗體稀釋?zhuān)阂钥贵w稀釋液按1：10000分別稀釋辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠igg及辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠iga。(5)加二抗：按100μl/孔向酶標(biāo)板加入抗體，37℃放置40min，pbst洗滌4次，拍干；(6)顯色：向各孔加入100μl顯色液，37℃顯色10min，50μl/孔加入2mh2so4終止反應(yīng)。(7)結(jié)果記錄：測(cè)定450nm各孔吸光度值，保存數(shù)據(jù)。測(cè)定結(jié)果如圖8和圖9所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(t檢驗(yàn))，a1蛋白免疫組與urea1蛋白免疫組及pbs組比較，a1蛋白免疫組唾液抗原特異性siga水平顯著升高(p<0.01)，血清抗原特異性igg水平也顯著升高(p<0.01)。urea1蛋白免疫組與pbs組比較，唾液抗原特異性siga及血清抗原特異性igg水平均無(wú)顯著性差異(p>0.05)?？诜庖遖1蛋白有利于唾液抗原特異性siga水平升高(2組與1組比較，p<0.01)，注射免疫a1蛋白有利于血清抗原特異性igg水平升高(1組與2組比較，p<0.01)。以上所述的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>成都億妙生物科技有限公司<120>一種重組幽門(mén)螺桿菌蛋白疫苗及其制備方法<130>1<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>203<212>prt<213>重組lta1-urea1蛋白的氨基酸序列<400>1metlysasnilethrpheilephepheileleuleualaserproleu151015tyralaasnglyasplysleutyrargalaaspserargproproasp202530gluprotrplysleuthrprolysgluleuasplysleumetleuhis354045tyralaglygluleualaarglysarglysglulysglyilelysleu505560asntyrvalglualavalalaleuileseralahisilemetgluglu65707580alaargalaglylyslysthralaalagluleumetglngluglyarg859095thrleuleulysproaspaspvalmetaspglyvalalasermetile100105110hisgluvalglyileglualametpheproaspglythrlysleuval115120125thrvalhisthrproileglualaasnglyleugluprotrpilehis130135140hisalaproglnglycysglyasnserserargthrilethraspasp145150155160thrcysasnglugluthrglnasnleuserthriletyrleuarglys165170175tyrglnserlysvallysargglnilepheserasptyrglnserasp180185190ileasplyshisasnargileargaspgluleu195200<210>2<211>124<212>prt<213>ltb蛋白的氨基酸序列<400>2metasnlysvallyscystyrvalleuphethralaleuleuserser151015leucysalatyrglyalaproglnserilethrgluleucysserglu202530tyrargasnthrglniletyrthrileasnasplysileleusertyr354045thrglusermetalaglylysargglumetvalileilethrphelys505560serglyalathrpheglnvalgluvalproglyserglnhisileasp65707580serglnlyslysalailegluargmetlysaspthrleuargilethr859095tyrleuthrgluthrlysileasplysleucysvaltrpasnasnlys100105110thrproasnserilealaalailesermetgluasn115120<210>3<211>987<212>dna<213>編碼重組融合蛋白基因的核苷酸序列<400>3catatgaaaaatataactttcattttttttattttattagcatcgccattatatgcaaat60ggcgacaaattataccgtgctgactctagacccccagatgaaccatggaaactcacccca120aaagagttagataagttgatgctccactacgctggagaattagctaggaaacgcaaagaa180aaaggcattaagcttaactatgtggaagcggtagctttgattagtgcccatattatggaa240gaagcgagagctggtaaaaagactgcggctgaattgatgcaagaagggcgcactctttta300aaaccggatgatgtgatggatggtgtggcaagcatgatccatgaagtgggtattgaagcg360atgtttcctgatgggaccaaactcgtaaccgtgcatacccctattgaggctaatggtctc420gagccctggattcatcatgcaccacaaggttgtggaaattcatcaagaacaattacagat480gatacttgtaatgaggagacccagaatctgagcacaatatatctcaggaaatatcaatca540aaagttaagaggcagatattttcagactatcagtcagatattgacaaacataacagaatt600cgggatgaattataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgttactatcctctctatg660tgcatacggagctccccagtctattacagaactatgttcggaatatcgcaacacacaaat720atatacgataaatgacaagatactatcatatacggaatcgatggcaggtaaaagagaaat780ggttatcattacatttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaaca840tatagactcccaaaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatct900gaccgagaccaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgc960ggcaatcagtatggaaaactaggatcc987<210>4<211>1148<212>dna<213>大腸桿菌不耐熱腸毒素完整基因序列<400>4atgaaaaatataactttcattttttttattttattagcatcgccattatatgcaaatggc60gacaaattataccgtgctgactctagacccccagatgaaataaaacgttccggaggtctt120atgcccagagggcataatgagtacttcgatagaggaactcaaatgaatattaatctttat180gatcacgcgagaggaacacaaaccggctttgtcagatatgatgacggatatgtttccact240tctcttagtttgagaagtgctcacttagcaggacagtctatattatcaggatattccact300tactatatatatgttatagcgacagcaccaaatatgtttaatgttaatgatgtattaggc360gtatacagccctcacccatatgaacaggaggtttctgcgttaggtggaataccatattct420cagatatatggatggtatcgtgttaattttggtgtaattgatgaacgattacatcgtaac480agggaatatagagaccggtattacagaaatctgaatatagctccggcagaggatggttac540agattagcaggtttcccaccggatcaccaagcttggagagaagaaccctggattcatcat600gcaccacaaggttgtggaaattcatcaagaacaattacagatgatacttgtaatgaggag660acccagaatctgagcacaatatatctcaggaaatatcaatcaaaagttaagaggcagata720ttttcagactatcagtcagaggttgacatatataacagaattcgggatgaattatgaata780aagtaaaatgttatgttttatttacggcgttactatcctctctatgtgcatacggagctc840cccagtctattacagaactatgttcggaatatcgcaacacacaaatatatacgataaatg900acaagatactatcatatacggaatcgatggcaggtaaaagagaaatggttatcattacat960ttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagactcccaaa1020aaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgagaccaaaa1080ttgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatcagtatgg1140aaaactag1148<210>5<211>342<212>dna<213>幽門(mén)螺桿菌尿素酶a亞單位基因片段核苷酸序列<400>5catatgaaactcaccccaaaagagttagataagttgatgctccactacgctggagaatta60gctaggaaacgcaaagaaaaaggcattaagcttaactatgtggaagcggtagctttgatt120agtgcccatattatggaagaagcgagagctggtaaaaagactgcggctgaattgatgcaa180gaagggcgcactcttttaaaaccggatgatgtgatggatggtgtggcaagcatgatccat240gaagtgggtattgaagcgatgtttcctgatgggaccaaactcgtaaccgtgcatacccct300attgaggctaatggtctcgagcaccaccaccaccaccactga342<210>6<211>112<212>prt<213>urea-1蛋白的氨基酸序列<400>6metlysleuthrprolysgluleuasplysleumetleuhistyrala151015glygluleualaarglysarglysglulysglyilelysleuasntyr202530valglualavalalaleuileseralahisilemetgluglualaarg354045alaglylyslysthralaalagluleumetglngluglyargthrleu505560leulysproaspaspvalmetaspglyvalalasermetilehisglu65707580valglyileglualametpheproaspglythrlysleuvalthrval859095histhrproileglualaasnglyleugluhishishishishishis100105110當(dāng)前第1頁(yè)12