本發(fā)明屬于分子生物學技術領域,具體涉及一種檢測基因片段缺失的試劑盒及其檢測方法。

背景技術：

20世紀90年代初出現(xiàn)了等溫核酸體外擴增(isothermalamplification)技術的報道。等溫核酸體外擴增技術是在恒定溫度下，通過dna解螺旋酶使dna雙鏈解螺旋，并促使特異性dna片段擴增，以達到核酸體外擴增的效果。因等溫核酸體外擴增不需要高溫變性、退火和延伸的環(huán)節(jié)，核酸擴增變得更加便捷，也擺脫了對核酸擴增儀的依賴。等溫核酸體外擴增技術有多種形式,包括鏈置換擴增(stranddisplacementamplification，sda)、轉錄介導擴增(transcription–mediatedamplification，tma)、環(huán)介導擴增(loop–mediatedamplification，lamp)、滾環(huán)擴增(rolling–circleamplification，rca)和依賴解旋酶擴增(helicase–dependentamplification，hda)等。

在過去的10年中，一項新型的恒溫試驗即重組酶聚合酶檢測系統(tǒng)(recombinasepolymeraseamplification，rpa)開始受到大規(guī)模的青睞，被廣泛用于病原菌的檢測。它是目前最接近常溫的核酸擴增技術。rpa技術的原理為：在25-42℃范圍內(nèi)的等溫條件下，重組酶與引物dna緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板dna上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈dna結合蛋白(single–strandeddnabindingprotein，ssb)的作用下，使模板dna解鏈，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互補鏈。rpa不僅可以用于dna的擴增，也可以用于rna的擴增。在dna的擴增中，可用于細菌，寄生蟲以及病毒的擴增。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明擬提供一種可定性定量檢測、檢出限低、檢測靈敏度高的檢測基因片段缺失的試劑盒及其檢測方法。

本發(fā)明解決技術問題的技術方案為：提供一種檢測基因片段缺失的試劑盒。該試劑盒組成包括：檢測目的基因片段擴增產(chǎn)物的探針，目的基因片段擴增引物，反應酶系和緩沖液體系。

其中，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的檢測目的基因片段擴增產(chǎn)物的探針長度為35～45bp。

其中，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的檢測目的基因片段擴增產(chǎn)物的探針由兩個子探針經(jīng)四氫呋喃連接而成；所述連接的方式為：四氫呋喃通過磷酸二酯鍵把第一個子探針3’端與第二個子探針5’端的堿基連接起來。

其中，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的檢測目的基因片段擴增產(chǎn)物的探針還包括熒光素基團和熒光淬滅基團；進一步的，所述熒光素基團和熒光淬滅基團位于四氫呋喃兩端的t堿基上。進一步的，所述的熒光素基團和熒光淬滅基團通過羧基與t堿基上的羥基發(fā)生酯化反應，形成共價鍵而連接。

其中，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的檢測目的基因片段擴增產(chǎn)物的探針熒光素基團和熒光淬滅基團間相距2～10個堿基。

其中，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的熒光素基團為6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein)、四氯-6-羧基熒光素(tetrachloro-6-carboxyfluorescein)、六氯熒光素(hexachlorofluorescein)、羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein)或羅丹明類熒光素(carboxy-6-rhodamine)中的至少一種。

其中，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的熒光淬滅基團為黑孔淬滅基團1(簡稱bhq-1，[(4-(2-nitro-4-methylphenyl)-azo)-yl-((2-methoxy-5-methyl-phenyl)-azo)]--aniline)、黑孔淬滅基團2(簡稱bhq-2，([(4-(1-nitro-phenyl)-azo)-yl-((2,5-dimethoxy-phenyl)-azo)]-aniline)或4—(4’—二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(4-[[4-(dimethylamino)-phenyl]-azo]-benzoicacid)eclipse(4-[[2-chloro-4-nitro-phenyl]-azo]-aniline)中的至少一種。

進一步的，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的檢測目的基因片段擴增產(chǎn)物的探針3’端采用c3-spacer修飾。

其中，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的目的基因片段擴增引物核苷酸長度為35～50bp。

其中，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的目的基因片段擴增引物序列與探針序列在目的基因片段上不產(chǎn)生重疊，至少相距3bp以上。

其中，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的目的基因片段擴增引物擴增目標序列長度為100～200bp。

其中，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的反應酶系包括：150ng/ulreca重組酶蛋白，90ng/ulssb單鏈結合蛋白，50ng/ulklenow聚合酶和50u核酸外切酶ⅲ。

其中，上述檢測基因片段缺失的試劑盒中，所述的緩沖液體系包括：200mmol/l醋酸鎂，5％聚乙二醇，5mmol/l二硫蘇糖醇，3～5mmol/latp,2～5u磷酸肌酸激酶和300umdntp。

本發(fā)明檢測基因片段缺失的試劑盒的原理為：待檢測目的基因存在1個堿基缺失或多個堿基缺失的突變型情況，或堿基不缺失的野生型基因的情況時，重組酶特異識別同源基因序列，幫助dna模版解鏈和促使模版與探針之間發(fā)生鏈置換反應。

如果探針與突變型dna模版堿基完全匹配，dna模版與探針之間發(fā)生鏈置換反應，即堿基對完全匹配之后，核酸外切酶切割探針上的四氫呋喃位點，使探針分成兩個部分，使得熒光素與淬滅基團分離開，相對熒光強度增大。反之，探針與野生型dna模版堿基不匹配，探針相對熒光強度保持不變。重組酶鏈置換反應和核酸外切酶反應時需要消耗能量，本發(fā)明試劑盒緩沖液的主要成分是atp和磷酸激酶，atp在磷酸肌酸激酶催化下可以利用磷酸肌酸實現(xiàn)再生，為重組鏈置換反應和核酸外切酶反應提供能量。

本發(fā)明還提供一種采用上述試劑盒檢測基因片段缺失的方法，包括以下步驟：

a、提取目的基因；

b、目的基因中加入目的基因片段擴增引物，檢測目的基因片段擴增產(chǎn)物的探針，重組酶和緩沖液，于37～42℃下進行擴增反應10～20min。

本發(fā)明還提供了一種檢測犬細小病毒vp2的試劑盒，其組成包括：

(1)檢測目的基因片段擴增產(chǎn)物的探針：acttatggtccttt(f)aactg-h-at(q)taaataatgtgcc[c3-spacer]；

h為四氫呋喃，f為熒光素基團fam，q為熒光淬滅基團bhq；

(2)目的基因片段擴增引物：

犬細小病毒vp2上游引物：agatccaattggaggtaaaacaggaattaactata；

犬細小病毒vp2下游引物:attctttatcccaaatttgaccatttggataaact；

(3)反應酶系：150ng/ulreca重組酶蛋白，90ng/ulssb單鏈結合蛋白，50ng/ulklenow聚合酶和50u核酸外切酶ⅲ；

(4)緩沖液體系：200mmol/l醋酸鎂，5％聚乙二醇，5mmol/l二硫蘇糖醇，3～5mmol/latp,2～5u磷酸肌酸激酶和300umdntp。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供一種檢測基因片段缺失的試劑盒及檢測方法，該試劑盒既可以用來定性檢測，也可以采用標準品梯度稀釋的方法，建立標準擴增曲線，然后待檢樣本的擴增曲線與標準擴增曲線對比，進行定量檢測，檢測方法方便快捷，10min內(nèi)即可完成。本發(fā)明試劑盒可用于病毒、細菌和真菌等定性定量檢測，最低檢出限為1個拷貝數(shù)，檢測適用性廣，準確度高，適宜推廣使用。

附圖說明

圖1不同長度探針的熒光定量pcr擴增曲線；

圖2不同標記位置探針的熒光定量pcr擴增曲線；

圖3四組探針試劑在反應前后的熒光亮度值；

圖4探針定量分析實驗結果；

圖5探針特異性分析實驗結果；

圖6犬唾液、糞便和血清樣本中犬細小病毒熒光定量pcr擴增曲線。

具體實施方式

下面以犬細小病毒為例，通過采用本發(fā)明檢測基因片段缺失的試劑盒，建立一套檢測犬細小病毒基因缺失的快速篩查方法，但不表示將本發(fā)明的保護范圍限制在實施例所述范圍內(nèi)。

實施例1不同長度的檢測目的基因片段擴增產(chǎn)物的探針篩選實驗

材料與方法：

四川成都寶興寵物醫(yī)院，雜交犬，雄性，4個月，經(jīng)臨床診斷感染犬細小病毒，dna試劑盒提取，采用tianampvirusdna/rnakit試劑盒，按照說明書進行操作。

引物與探針設計：

引物與探針設計：根據(jù)ncbigenbank數(shù)據(jù)庫查詢?nèi)毿〔《緑p2基因序列(編號：ay742953.1)序列設計引物和探針，其中，犬細小病毒vp2基因序列為seqidno.1所示。引物和探針均由sangon合成生物科技有限公司(中國上海)合成。

犬細小病毒vp2上游引物：agatccaattggaggtaaaacaggaattaactata(seqidno.2)

犬細小病毒vp2下游引物:attctttatcccaaatttgaccatttggataaact(seqidno.3)

探針1為在基礎核苷酸序列1(seqidno.4ctttaactgattaaataatgtgcc)的基礎上：在第9-10個堿基間插入四氫呋喃h，并在第8個堿基t上連接熒光素基團fam，第16個堿基上連接熒光淬滅基團bhq，3’端采用c3-spacer封閉得到的序列，如下所示：

探針1：ctttaact(f)g-h-attaaat(q)aatgtgcc[c3-spacer]

探針2為在基礎核苷酸序列2(seqidno.5tggtcctttaactgattaaataatgtgcc)基礎上：在第14-15個堿基間插入四氫呋喃h，并在第13個堿基t上連接熒光素基團fam，第21個堿基上連接熒光淬滅基團bhq，3’端采用c3-spacer封閉得到的序列，如下所示：

探針2：tggtcctttaact(f)g-h-attaaat(q)aatgtgcc[c3-spacer]

探針3為在基礎核苷酸序列3(seqidno.6acttatggtcctttaactgattaaataatgtgcc)基礎上：在第19-20個堿基間插入四氫呋喃h，并在第18個堿基t上連接熒光素基團fam，第26個堿基上連接熒光淬滅基團bhq，3’端采用c3-spacer封閉得到的序列，如下所示：

探針3：acttatggtcctttaact(f)g-h-attaaat(q)aatgtgcc[c3-spacer]

探針4為在基礎核苷酸序列4(seqidno.7ttaatacttatggtcctttaactgattaaataatgtgcc)基礎上：在第24-25個堿基間插入四氫呋喃h，并在第23個堿基t上連接熒光素基團fam，第31個堿基上連接熒光淬滅基團bhq，3’端采用c3-spacer封閉得到的序列，如下所示：

探針4：ttaatacttatggtcctttaact(f)g-h-attaaat(q)aatgtgcc[c3-spacer]

探針5為在基礎核苷酸序列5(seqidno.8tatatacttatggtcctttaactgattaaataatgtgcc)基礎上：在第24-25個堿基間插入四氫呋喃h，并在第23個堿基t上連接熒光素基團fam，第31個堿基上連接熒光淬滅基團bhq，3’端采用c3-spacer封閉得到的序列，如下所示：

探針5：tatatacttatggtcctttaact(f)g-h-attaaat(q)aatgtgcc[c3-spacer]

探針1長度為25bp，探針2長度為30bp，探針3長度為35bp，探針4長度為40bp，探針5長度為45bp。

bio-radcfx96熒光定量pcr儀，重組酶聚合酶體系組成：150ng/ulreca重組酶蛋白，90ng/ulssb單鏈結合蛋白，50ng/ulklenow聚合酶，緩沖液體系組成：200mmol/l醋酸鎂，5％聚乙二醇，5mmol/l二硫蘇糖醇，3mmol/latp,2u磷酸肌酸激酶，300umdntp，上下游引物各加2.5ul，終濃度0.5um，dna模板2ul，探針1ul，加水至體積20ul。熒光定量pcr儀參數(shù)設置：37℃10分鐘。

定量pcr檢測結果如圖1所示，由結果可知，探針1和探針2沒有產(chǎn)生擴增信號，探針3、探針4和探針5均產(chǎn)生了擴增曲線。重組酶reca結合探針后，與同源dna模版序列發(fā)生鏈置換反應，在空間上需要占一定長度的位置，這個空間距離大概為35bp的堿基序列，因此，探針長度至少為35bp。因此，探針1和探針2長度過低，沒有產(chǎn)生擴增信號。當探針長度為35-45bp時，都能產(chǎn)生擴增曲線，但是探針長度越長，探針序列本身產(chǎn)生二聚體和徑環(huán)結構的概率越高，因此，探針長度以35-45bp為宜。

實施例2探針熒光素與淬滅基團的位置篩選實驗

材料與方法：

同實施例1。

引物與探針設計：根據(jù)ncbigenbank數(shù)據(jù)庫查詢?nèi)毿〔《緑p2基因序列(編號：ay742953.1)序列設計引物和探針。引物和探針均由sangon合成生物科技有限公司(中國上海)合成。

犬細小病毒vp2上游引物：agatccaattggaggtaaaacaggaattaactata(seqidno.2)

犬細小病毒vp2下游引物:attctttatcccaaatttgaccatttggataaact(seqidno.3)

探針6為在基礎核苷酸序列3(seqidno.6acttatggtcctttaactgattaaataatgtgcc)基礎上：在第8-9個堿基間插入四氫呋喃h，并在第6個堿基t上連接熒光素基團fam，第9個堿基上連接熒光淬滅基團bhq，3’端采用c3-spacer封閉得到的序列，如下所示：

探針6：acttat(f)gg-h-t(q)cctttaactgcattaaataatgtgcc[c3-spacer]

探針7為在基礎核苷酸序列3(seqidno.6acttatggtcctttaactgattaaataatgtgcc)的基礎上：在第15-16個堿基間插入四氫呋喃h，并在第14個堿基t上連接熒光素基團fam，第17個堿基上連接熒光淬滅基團bhq，3’端采用c3-spacer封閉得到的序列，如下所示：

探針7：acttatggtccttt(f)a-h-ct(q)gcattaaataatgtgcc[c3-spacer]

探針8為在基礎核苷酸序列3(seqidno.6acttatggtcctttaactgattaaataatgtgcc)的基礎上：在第19-20個堿基間插入四氫呋喃h，并在第14個堿基t上連接熒光素基團fam，第21個堿基上連接熒光淬滅基團bhq，3’端采用c3-spacer封閉得到的序列，如下所示：

探針8：acttatggtccttt(f)aactg-h-at(q)taaataatgtgcc[c3-spacer]

探針9為在基礎核苷酸序列3(seqidno.6acttatggtcctttaactgattaaataatgtgcc)的基礎上：在第19-20個堿基間插入四氫呋喃h，并在第12個堿基t上連接熒光素基團fam，第22個堿基上連接熒光淬滅基團bhq，3’端采用c3-spacer封閉得到的序列，如下所示：

探針9：acttatggtcct(f)ttaactg-h-att(q)aaataatgtgcc[c3-spacer]

關于探針的說明

h是四氫呋喃(tetrahydrofuran)，f是熒光基團fam，q是熒光淬滅基團bhq，3’端c3-spacer封閉。

探針6中熒光素與熒光淬滅基團相距2個堿基距離(四氫呋喃占據(jù)1個堿基的位置)，探針7中熒光素與熒光淬滅基團相距4個堿基距離，探針8中熒光素與熒光淬滅基團相距9個堿基距離，探針9中熒光素與熒光淬滅基團相距10個堿基距離。

熒光定量pcr方法同實施例1。對4組探針試劑在反應前后進行熒光攝像，對比反應前后的熒光亮度值，熒光攝像設備采用奧林巴斯bx53熒光顯微鏡。

實驗結果

定量pcr檢測結果如圖2所示，探針6，探針7，探針8和探針9都產(chǎn)生擴增曲線。

反應前后試劑熒光值變化結果如圖3所示，探針6試劑組反應前熒光亮度30，反應后熒光亮度140；探針7試劑組反應前熒光亮度26，反應后熒光亮度112；探針8試劑組反應前熒光亮度25，反應后熒光亮度93；探針9試劑組反應前熒光亮度22，反應后熒光亮度98。

探針中的熒光素與熒光淬滅基團標記在t堿基上，熒光素與熒光淬滅基團之間距離2個堿基，距離4個堿基，距離9個堿基，距離10個堿基都能產(chǎn)生明顯的擴增曲線，反應前后熒光亮度變化明顯。

探針中熒光素與熒光淬滅基團相距2個至10個堿基，都能產(chǎn)生擴增曲線，這樣能夠依據(jù)待檢測基因序列中t堿基分布特點，靈活的在探針中標記熒光素與熒光淬滅基團的位置。

實施例3探針對樣本的定量分析實驗

材料與方法

材料來源同實施例1，提取后的犬細小病毒dna樣本，采用梯度稀釋方法分成8個不同濃度的樣本，模版濃度分別為①10⁷拷貝,②10⁶拷貝，③10⁵拷貝，④10⁴拷貝，⑤10³拷貝，⑥10²拷貝，⑦10拷貝，⑧1拷貝。

引物與探針設計：根據(jù)ncbigenbank數(shù)據(jù)庫查詢?nèi)毿〔《緑p2基因序列(編號：ay742953.1)序列設計引物和探針，引物和探針均由sangon合成生物科技有限公司(中國上海)合成。

犬細小病毒vp2上游引物：agatccaattggaggtaaaacaggaattaactata(seqidno.2)

犬細小病毒vp2下游引物：attctttatcccaaatttgaccatttggataaact(seqidno.3)

探針采用探針8：acttatggtccttt(f)aactg-h-at(q)taaataatgtgcc[c3-spacer]

探針說明：h是四氫呋喃(tetrahydrofuran)，f是熒光基團fam，q是熒光淬滅基團bhq，3’端c3-spacer封閉。

熒光定量pcr方法同實施例1。犬細小病毒定量pcr檢測結果分析見圖4，從左至右，模版濃度依次為①10⁷拷貝,②10⁶拷貝，③10⁵拷貝，④10⁴拷貝，⑤10³拷貝，⑥10²拷貝，⑦10拷貝，⑧1拷貝。不同模版濃度的樣本都產(chǎn)生了擴增曲線。

擴增曲線隨著dna拷貝數(shù)降低，擴增信號出現(xiàn)的時間逐漸延后；擴增信號的熒光強度隨著dna拷貝數(shù)的降低而逐漸下降，探針檢測下限為1個拷貝數(shù)。

在實際應用中，通常檢測樣本的病毒dna的量遠高于1個拷貝，說明本發(fā)明探針的檢測靈敏度能夠滿足大部分的應用需求。

實施例4探針對樣本的特異性分析實驗

材料和方法

犬細小病毒、犬瘟病毒、犬冠狀病毒血清樣本由四川成都天緣寵物醫(yī)院提供，dna試劑盒提取，采用tianampvirusdna/rnakit試劑盒，按照說明書進行操作。

引物與探針設計：同實施例3。

熒光定量pcr方法同實施例1。

實驗結果

探針特異性定量pcr檢測結果分析見圖5，圖中數(shù)字1是犬細小病毒樣本，圖中數(shù)字2是犬瘟病毒樣本，圖中數(shù)字3是犬冠狀病毒樣本。

犬細小病毒樣本產(chǎn)生了擴增曲線，而犬瘟和犬冠狀病毒樣本沒有產(chǎn)生擴增曲線，說明探針具有特異性。

本發(fā)明的探針結構不影響重組酶特異性識別同源序列，因此具有特異性識別目的基因序列的能力，對非同源序列，不會產(chǎn)生擴增信號。

實施例5采用本發(fā)明方法檢測犬細小病毒

將本發(fā)明試劑盒用于犬細小病毒2型基因等溫擴增檢測，犬細小病毒病是犬的一種具有高度接觸性傳染的烈性傳染病。臨床上以急性出血性腸炎和心肌炎為特征。

細小病毒是一種單鏈dna病毒，cpv-2已有三個亞型，即cpv-2a、cpv-2b、cpv-2c。cpv-2型在家犬和犬科其他成員間具有高度傳染性。感染cpv-2發(fā)展為急性胃腸炎，臨床癥狀表現(xiàn)食欲不振，嘔吐，發(fā)熱，出血性腹瀉和白細胞減少，具有高發(fā)病率與死亡率。

樣本收集

四川成都天緣寵物醫(yī)學，金毛犬，雄性，3個月，經(jīng)臨床診斷感染犬細小病毒。

唾液病毒樣本采集，采用棉簽試子從犬口腔中沾取，將試子放于1.5ml離心管中，加入磷酸鹽緩沖液200ul，渦旋振蕩，病毒dna試劑盒提取。

血液病毒樣本采集，采血針，100-200ul血樣，普通采血管收集，離心取上清液50ul，病毒dna試劑盒提取。

糞便病毒樣本采集，用棉簽試子插入直腸，試取內(nèi)容物，放入1.5ml離心管中，加入磷酸鹽緩沖液600ul，渦旋振蕩15秒，10000g離心2分鐘，取上清液，病毒dna試劑盒提取。

病毒dna提取采用tianampvirusdna/rnakit試劑盒，按照說明書進行操作。

雙蒸水作為陰性對照樣本。

引物設計

根據(jù)genbankay742953.1病毒基因序列設計引物：

犬細小病毒vp2上游引物：agatccaattggaggtaaaacaggaattaactata(seqidno.2)

犬細小病毒vp2下游引物:attctttatcccaaatttgaccatttggataaact(seqidno.3)

探針采用探針8：acttatggtccttt(f)aactg-h-at(q)taaataatgtgcc[c3-spacer]

探針說明：h是四氫呋喃(tetrahydrofuran)，f是熒光基團fam，q是熒光淬滅基團bhq，3’端c3-spacer封閉。

引物和探針均由sangon合成生物科技有限公司(中國上海)合成。

重組酶聚合酶擴增反應

bio-radcfx96熒光定量pcr儀，重組酶聚合酶體系組成：150ng/ulreca重組酶蛋白，90ng/ulssb單鏈結合蛋白，50ng/ulklenow聚合酶，緩沖液體系組成：200mmol/l醋酸鎂，5％聚乙二醇，5mmol/l二硫蘇糖醇，3mmol/latp,2u磷酸肌酸激酶，300umdntp，上下游引物各加2.5ul，終濃度0.5um，dna模板2ul，探針1ul，加水至體積20ul。熒光定量pcr儀參數(shù)設置：37℃10分鐘。

結果分析

犬細小病毒cpv2基因熒光定量pcr檢測結果見圖6，圖中數(shù)字標識1是唾液樣本，圖中數(shù)字標識2是糞便樣本，圖中數(shù)字標識3是血清樣本，圖中數(shù)字標識4是雙蒸水樣本(陰性對照)。由圖6可看出，唾液、糞便和血清樣本都產(chǎn)生了擴增曲線，而陰性對照樣本雙蒸水沒有產(chǎn)生擴增信號。本發(fā)明試劑盒檢測效率高，準確度高。

sequencelisting

<110>成都海之元生物科技有限公司

<120>檢測基因片段缺失的試劑盒及其檢測方法

<130>a170499k

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1755

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>犬細小病毒vp2基因的核苷酸序列

<400>1

atgagtgatggagcagttcaaccagacggtggtcaacctgctgtcagaaatgaaagagct60

acaggatctgggaacgggtctggaggcgggggtggtggtggttctgggggtgtggggatt120

tctacgggtactttcaataatcagacggaatttaaatttttggaaaacggatgggtggaa180

atcacagcaaactcaagcagacttgtacatttaaatatgccagaaagtgaaaattataga240

agagtggttgtaaataatttggataaaactgcagttaacggaaacatggctttagatgat300

actcatgcacaaattgtaacaccttggtcattggttgatgcaaatgcttggggagtttgg360

tttaatccaggagattggcaactaattgttaatactatgagtgagttgcatttagttagt420

tttgaacaagaaatttttaatgttgttttaaagactgtttcagaatctgctactcagcca480

ccaactaaagtttataataatgatttaactgcatcattgatggttgcattagatagtaat540

aatactatgccatttactccagcagctatgagatctgagacattgggtttttatccatgg600

aaaccaaccataccaactccatggagatattattttcaatgggatagaacattaatacca660

tctcatactggaactagtggcacaccaacaaatatataccatggtacagatccagatgat720

gttcaattttatactattgaaaattctgtgccagtacacttactaagaacaggtgatgaa780

tttgctacaggaacatttttttttgattgtaaaccatgtagactaacacatacatggcaa840

acaaatagagcattgggcttaccaccatttctaaattctttgcctcaagctgaaggaggt900

actaactttggttatataggagttcaacaagataaaagacgtggtgtaactcaaatggga960

aatacaaactatattactgaagctactattatgagaccagctgaggttggttatagtgca1020

ccatattattcttttgaggcgtctacacaagggccatttaaaacacctattgcagcagga1080

cgggggggagcgcaaacagatgaaaatcaagcagcagatggtgatccaagatatgcattt1140

ggtagacaacatggtcaaaaaactaccacaacaggagaaacacctgagagatttacatat1200

atagcacatcaagatacaggaagatatccagaaggagattggattcaaaatattaacttt1260

aaccttcctgtaacaaatgataatgtattgctaccaacagatccaattggaggtaaaaca1320

ggaattaactatactaatatatttaatacttatggtcctttaactgcattaaataatgtg1380

ccaccagtttatccaaatggtcaaatttgggataaagaatttgatactgacttaaaacca1440

agacttcatgtaaatgcaccatttgtttgtcaaaataattgtcctggtcaattatttgta1500

aaagttgcgcctaatttaacaaatgaatatgatcctgatgcatctgctaatatgtcaaga1560

attgtaacttactcagatttttggtggaaaggtaaattagtatttaaagctaaactaaga1620

gcctctcatacttggaatccaattcaacaaatgagtattaatgtagataaccaatttaac1680

tatgtaccaagtaatattggaggtatgaaaattgtgtatgaaaaatctcaactagcacct1740

agaaaattatattaa1755

<210>2

<211>35

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>犬細小病毒vp2上游引物

<400>2

agatccaattggaggtaaaacaggaattaactata35

<210>3

<211>35

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>犬細小病毒vp2下游引物

<400>3

attctttatcccaaatttgaccatttggataaact35

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>基礎核苷酸序列1

<400>4

ctttaactgattaaataatgtgcc24

<210>5

<211>29

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>基礎核苷酸序列2

<400>5

tggtcctttaactgattaaataatgtgcc29

<210>6

<211>34

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>基礎核苷酸序列3

<400>6

acttatggtcctttaactgattaaataatgtgcc34

<210>7

<211>39

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>基礎核苷酸序列4

<400>7

ttaatacttatggtcctttaactgattaaataatgtgcc39

<210>8

<211>39

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>基礎核苷酸序列5

<400>8

tatatacttatggtcctttaactgattaaataatgtgcc39