本發(fā)明涉及核酸檢測領域，更具體地說，涉及一種用于生物樣本提取的生物反應載體和提取方法。

背景技術：

自pcr技術在上世紀八十年代問世以來，其在分子生物學相關領域的應用越來越廣泛。尤其是近年來，隨著人們對臨床診斷精度靈敏度要求的提高，以及個體化醫(yī)療概念的提出和推廣，pcr技術憑借其在臨床診斷中快速、敏感、特異等優(yōu)點，已經(jīng)迅速廣泛的應用到了臨床診療，通過檢測患者樣本中的基因，從而幫助醫(yī)生確定用藥和治療方案。

而樣本核酸提取是pcr技術運用的前提，人類外周血在人體內(nèi)免疫反應及代謝中發(fā)揮著重要作用，可用于血液系統(tǒng)及其他眾多系統(tǒng)疾病的分子監(jiān)測，由于其在臨床上取樣簡單易得，在臨床診斷或研究中應用最為廣泛。

目前全血核酸提取方法主要有苯酚-氯仿法、離心柱法、磁珠法。其中苯酚-氯仿法操作復雜且含有大毒性的有機溶劑已少有使用；離心柱法仍然是目前使用最廣泛的全血核酸提取方法，但其需要特殊的硅膠膜層析柱，且需要反復的離心清洗后才能洗脫獲得核酸；磁珠法采用磁珠吸附、清洗洗脫獲得核酸；這些方法操作過程中需要多次離心、換管、磁棒分離等過程，操作復雜，提取時間較長，對操作要求較高，不利于臨床診療或研究應用。

專利cn201611137387.0公開了一種微量樣品中核酸的檢測方法，該方法披露了使用復合捕獲體捕獲細胞或病毒，再向所述復合捕獲體施加磁場，使所述捕獲復合體吸附到容器內(nèi)壁上，去除廢液后，在加入漂洗液對所述捕獲復合體進行洗滌，得到捕獲復合體-細胞結合物或捕獲復合體-病毒結合物，再執(zhí)行pcr擴增的過程，該方法可以有效避免樣品中其他雜質(zhì)對pcr擴增及核酸檢測的干擾，但該方法必須使用磁性復合捕獲體捕獲細胞或病毒，并需要使用磁鐵或磁力棒等裝置反復的轉移所述復活捕獲體或轉移廢液，所述復活捕獲體被吸附時會成團聚集在一起，聚集后不可避免的包埋雜質(zhì)，這樣就需要反復多次吸附和解吸附并進行多次洗滌，造成試劑消耗量大，并增加了操作的復雜度。

技術實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術存在問題，本發(fā)明提供一種用于生物樣本提取的生物反應載體，使用所述生物反應載體可以簡化生物樣本提取過程，提高了生物樣本提取效率，并降低了對設備的要求。

另一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N使用所述生物反應載體進行生物樣本提取的方法，所述方法操作簡單，提高了生物樣本提取效率。

本發(fā)明的目的是通過以下的技術方案來實現(xiàn)的：一種用于生物樣本提取的生物反應載體，其特征在于，所述生物反應載體包括反應腔，所述反應腔內(nèi)壁具有活性表面，所述活性表面上結合有活性生物分子或者化學基團，所述活性生物分子或所述化學基團用于結合核酸、病毒或細胞。

進一步地，所述生物反應載體為反應管，所述反應管包括管身和設置于所述管身上部的加樣口，所述管身包括內(nèi)壁和內(nèi)壁圍成的反應腔，所述內(nèi)壁具有活性表面，所述活性表面上結合有活性生物分子或者化學基團。

進一步地，所述反應管的內(nèi)壁設置有凹槽或凸臺，以增大生物反應載體的活性表面面積。

進一步地，所述凹槽或凸臺的布局方式為沿管身延伸方向、斜向或呈螺旋狀，一方面增大了活性表面面積，另一方面，反應液震蕩或攪拌時，所述的凹槽或凸臺結構可以增加渦流，提高生物樣本中核酸、病毒或細胞與所述生物微粒結合的效率。

進一步地，所述生物反應載體為生物芯片，所述生物芯片包括反應腔，所述反應腔具有活性表面，所述活性表面上結合有活性生物分子或者化學基團。

進一步地，所述反應腔的空間結構選自圓球狀、半球狀、槽狀、微流道、毛細管中的至少一種。

進一步地，所述生物芯片還包括進樣口、洗滌液池、廢液池、pcr反應液池和毛細管電泳分離通道，所述進樣口、洗滌液池、廢液池、pcr反應液池和毛細管電泳分離通道通過微通道與所述反應腔相連。使用所述生物芯片可以實現(xiàn)：樣品處理-pcr擴增-樣品檢測等過程，不需要再另外處理樣品，簡化了操作過程，提高了工作效率，可以廣泛的應用于核酸提取、核酸擴增、基因測序、白細胞檢測、循環(huán)腫瘤細胞檢測、胎兒有核紅細胞檢測等領域。

進一步地，所述活性生物分子選自抗體、蛋白質(zhì)或核酸適體中的至少一種，所述化學基團選自羧基或氨基。

進一步地，所述抗體選自cd45特異性抗體、e.coli抗體、mabre-4d8、anti-m13抗體、甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體中的一種或多種。

進一步地，所述蛋白質(zhì)為細胞或者微生物的主要表面抗原蛋白。

進一步地，本發(fā)明還提供一種使用所述生物反應載體提取生物樣本的方法，包括：

將樣品加入所述反應腔中，使活性生物分子或者化學基團特異性結合樣品中的核酸、細胞或病毒；

加入漂洗液進行洗滌，去除廢液；

加入pcr反應液，執(zhí)行核酸擴增過程，獲得pcr擴增產(chǎn)物。

進一步地，所述樣品選自淋巴液、淚液、汗液、尿液、唾液、全血、精液、腦脊液、肺腔液、腹膜液、關節(jié)的液體、羊水、組織間隙液、組織培養(yǎng)液或細胞培養(yǎng)液中的一種或多種。

進一步地，所述細胞培養(yǎng)液中的細胞選自人體細胞、動物細胞、植物細胞、細菌、真菌細胞或重組細胞中的一種或多種。

進一步地，所述人體細胞選自腸道脫落細胞、上皮脫落細胞、吞噬細胞、白細胞、干細胞、神經(jīng)細胞、循環(huán)腫瘤細胞、胎兒有核紅細胞中的一種或多種。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供一種用于生物樣本提取的生物反應載體，包括反應腔，所述反應腔內(nèi)壁具有活性表面，所述活性表面上結合有活性生物分子或者化學基團，所述活性生物分子或者化學基團用于特異性結合核酸、病毒或細胞。使用本發(fā)明生物反應載體進行核酸檢測時，不需要裂解細胞或病毒，細胞或病毒被結合到所述活性表面，去除廢液后，直接執(zhí)行pcr擴增程序，操作步驟少，擴增純度高。另一方面，所述生物微粒均勻的涂布在所述反應腔內(nèi)壁上，與核酸、病毒或細胞的結合效率更高，洗滌更方便，并且避免了使用磁珠法提取生物樣本時需要使用磁鐵反復洗滌-吸附的問題，簡化了設備結構，減少了試劑的用量。

另一方面，本發(fā)明提供一種使用上述生物反應載體進行生物樣本提取的方法，所述方法步驟簡單，操作方便，提高了生物樣本的提取效率，減少樣本用量，并且結合-洗滌-裂解-擴增等過程可以在一個生物反應載體中完成，避免了樣品在反復轉移過程中的損失或引入橫向污染的問題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例一示意圖

圖2為本發(fā)明實施例二的示意圖

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明實施例提供一種用于生物樣本提取的生物反應載體，包括反應腔，所述反應腔內(nèi)壁具有活性表面，所述活性表面上結合有活性生物分子或者化學基團，其中，所述活性生物分子或者化學基團可以特異性的結合核酸、病毒或細胞。

實施例一

圖1為符合本發(fā)明的第一實施例，本實施例所述生物反應載體為反應管，所述反應管包括管身1和設置于所述管身上部的加樣口2，所述管身1包括內(nèi)壁和內(nèi)壁圍成的反應腔，所述內(nèi)壁具有活性表面3，所述活性表面上結合有生物活性分子，本實施例所述生物活性分子為抗體，所述抗體選自cd45特異性抗體、e.coli抗體、mabre-4d8、anti-m13抗體、甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體中的一種或多種。在本發(fā)明其他實施例中，所述活性表面上結合有羧基或氨基，用于結合核酸、病毒或細胞。

本實施例中，所述反應管的內(nèi)壁設置有凹槽或凸臺，所述凹槽或凸臺的布局方式為沿管身延伸方向、斜向或呈螺旋狀，一方面增大了活性表面面積，另一方面，反應液震蕩或攪拌時，所述的凹槽或凸臺結構可以增加渦流，提高生物樣本中核酸、病毒或細胞與所述抗體結合的效率。

實施例二

圖2為符合本發(fā)明的第二實施例，本實施例所述生物反應載體為生物芯片，所述生物芯片包括反應腔10，所述反應腔10具有活性表面，所述活性表面上結合有生物活性分子，其中，所述生物活性分子為抗體，所述抗體為cd45特異性抗體，在本發(fā)明其他優(yōu)選實施例中，所述抗體選自e.coli抗體、mabre-4d8、anti-m13抗體、甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體，乙肝病毒表面抗原單克隆抗體中的一種或多種，所述抗體固定在所述反應腔內(nèi)表面的任何位置，在另一個優(yōu)選實施例中，所述生物活性分子為蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)為細胞或者微生物的主要表面抗原蛋白。

在本實施例中，所述反應腔10的空間結構選自圓球狀，在其他優(yōu)選實施例中，所述反應腔10的空間結構還可以是半球狀、槽狀、微流道、毛細管中的至少一種。

在本實施例中，所述生物芯片還包括進樣口11、洗滌液池12、廢液池14、pcr反應液池13和毛細管電泳分離通道15，所述進樣口11、洗滌液池12、廢液池14、pcr反應液池13和毛細管電泳分離通道15通過微通道與所述反應腔10相連。使用本實施例所述生物芯片可以實現(xiàn)：樣品處理-pcr擴增-擴增產(chǎn)物檢測等過程，不需要再另外處理樣品，簡化了操作過程，避免了樣本之間可能存在的橫向污染，提高了工作效率，可以廣泛的應用于核酸提取、核酸擴增、基因測序、白細胞檢測、循環(huán)腫瘤細胞檢測、胎兒有核紅細胞檢測等領域。

實施例三

使用本發(fā)明的生物反應載體進行人全血中白細胞分離及核酸檢測的過程包括：

(1)使用實施例二所述的生物芯片；

(2)取1滴人指尖血樣置于所述進樣口，控制所述血樣進入反應腔，37攝氏度下，向反應腔加入10微升hepes緩沖液(ph7.4)，所述cd45抗體特異性結合白細胞形成cd45抗體-白細胞結合物，去除廢液，加入漂洗液對cd45抗體-白細胞結合物進行洗滌，去除廢液；

(3)將pcr所需試劑(包含緩沖液、taq聚合酶、dntps、引物、探針、水等)加入cd45抗體-白細胞結合物中，直接進入熒光定量pcr程序，在低滲溶液及高溫作用下，白細胞將裂解并釋放出核酸作為pcr的模板，利用熒光定量pcr、arms-pcr,lamp等方法對白細胞核酸進行擴增、擴增產(chǎn)物通過所述毛細管電泳分離通道15進行分離和檢測，或者直接讀取熒光進行結果判定。

實施例四

使用如實施例一所述的反應管進行m13噬菌體分離及核酸檢測的方法，包括以下步驟：

(1)結合：獲得用anti-m13抗體標記在所述活性表面的反應管，將100微升m13噬菌體培養(yǎng)液加入所述反應管中，震蕩30秒，在37攝氏度條件下孵育1分鐘，使所述anti-m13抗體特異性結合噬菌體，獲得anti-m13抗體-噬菌體結合物，移走廢液；

(2)漂洗：加入漂洗液，洗滌anti-m13抗體-噬菌體結合物，移走廢液；

(3)執(zhí)行將pcr程序，在低滲溶液及高溫作用下，m13噬菌體將裂解并釋放出核酸作為pcr的模板，得到m13噬菌體核酸擴增產(chǎn)物；

(4)pcr結束之后，使用凝膠電泳對核酸擴增產(chǎn)物進行檢測和分析。

上面對本發(fā)明的各種實施方式的描述以描述的目的提供給本領域技術人員。其不旨在是窮舉的、或者不旨在將本發(fā)明限制于單個公開的實施方式。如上所述，本發(fā)明的各種替代和變化對于上述技術所屬領域技術人員而言將是顯而易見的。因此，雖然已經(jīng)具體討論了一些另選的實施方式，但是其它實施方式將是顯而易見的，或者本領域技術人員相對容易得出。本發(fā)明旨在包括在此已經(jīng)討論過的本發(fā)明的所有替代、修改、和變化，以及落在上述申請的精神和范圍內(nèi)的其它實施方式。

雖然通過實施方式描繪了本發(fā)明，本領域普通技術人員知道，本發(fā)明有許多變形和變化而不脫離本發(fā)明的精神，希望所附的權利要求包括這些變形和變化而不脫離本發(fā)明的精神。