本發(fā)明涉及高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及植酸酶凝膠制劑，尤其涉及耐
高溫植酸酶凝膠制劑。
背景技術(shù)：
我國是世界玉米種植大國，70％的玉米用于生產(chǎn)飼料。玉米中50％～80％的磷以植酸形式存在，但這種形式的磷不能被豬禽等單胃動物消化利用，隨動物糞便排泄后還會嚴(yán)重污染環(huán)境。植酸酶是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸(鹽)的一類酶的總稱，可以降解飼料中含量豐富的植酸，不但可以釋放出有利于動物生長發(fā)育的無機磷，同時也可以釋放出與植酸結(jié)合的其它營養(yǎng)物質(zhì)，有利于豬禽等單胃動物更好地吸收利用，降低飼料成本，減少動物糞便中磷的排泄量，減輕環(huán)境污染。因此，植酸酶是目前應(yīng)用較多且前景較好的一種綠色飼料添加劑。植酸酶在應(yīng)用中存在的主要問題是植酸酶的耐熱性欠佳，在存放時以及飼料加工過程中造成酶活性降低甚至失活，造成酶的浪費以及使用成本的提高。在中國，顆粒飼料約占飼料總產(chǎn)量的70％,市場需求量巨大。通常，飼料的生產(chǎn)需要經(jīng)過高溫制粒過程，一般為75℃一80℃，植酸酶在這樣的溫度下很容易失去部分活力，甚至完全失活。所以獲得高熱穩(wěn)定性的植酸酶是近年來植酸酶工業(yè)的研究熱點和難點。目前，獲得耐高溫植酸酶可以有以下幾種方法：(1)改變植酸酶的分子結(jié)構(gòu)，用化學(xué)方法將植酸酶分子用糖基修飾，能在一定程度上提高植酸酶的耐熱性。(2)利用生物技術(shù)和基因定點突變技術(shù)，培育新的植酸酶菌株。利用化學(xué)或生物學(xué)方法獲得新的植酸酶品種，可以從根本上上提高植酸酶耐高溫性能，并且取得了一些研究成果，如cn10659256a、cn106434850a、cn10638890a、106323964a、cn106260584a、cn10601102a、cn10601101a、cn10601000a、cn106119223a.。但是由于植酸酶的耐熱機理仍不清楚，因此，植酸酶新品種的開發(fā)尚缺乏理論依據(jù)。另外，植酸酶新品種的開發(fā)具有投入大，時間長、篩選困難、風(fēng)險高的弊端，不適合中國的國情，而且開發(fā)出的新品種由于工藝不成熟，很容易受到工藝條件的影響，產(chǎn)生變異，導(dǎo)致酶產(chǎn)品性能不穩(wěn)定，難以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
酶的固定化是改善酶性能的另一種方法，它是用化學(xué)或物理方法將酶固定在載體上，改變酶的周圍環(huán)境，以降低溫度對酶的影響，提高耐熱性能。與開發(fā)植酸酶的新品種相比，固定化酶具有以下優(yōu)點：(1)可以采用傳統(tǒng)的方法生產(chǎn)酶產(chǎn)品，工藝成熟，產(chǎn)品性能穩(wěn)定，有利于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。另外，固定化的酶，不僅能克服自由酶的缺點，還能保留自由酶原有的活性，而且還易于與其它組份分離，重復(fù)使用率高。此外，選擇組成不同的載體，還可以賦予酶載體部分所具有的獨特性能。因此，固定化酶技術(shù)自20世紀(jì)60年代發(fā)展以來，已經(jīng)成為國內(nèi)外的研究熱點，是酶工業(yè)的核心內(nèi)容之一(《中國甜菜糖業(yè)》，2007(1)，29-32)。)。
酶的固定化載體包括無機材料和有機高分子材料。cn106333084a將植酸酶固定在膨潤土上，以期減少高溫造粒對植酸酶的影響。周建琴(《中國釀造》，2012,31(9)，110-114.)以聚乙烯醇為原料，以戊二醛為交聯(lián)劑，得到交聯(lián)球型聚乙烯醇，經(jīng)與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)得到固定化載體，用吸附法將植酸酶固定在載體上。王成波(《黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)》2014,14,5,99-102.)以殼聚糖為原料，以戊二醛為交聯(lián)劑，制得固定化載體，用吸附法將植酸酶固定在載體上。有機高分子材料原料種類多，合成方法多樣，并且有機高分子材料強度小，易于加工成型。因此固定化酶越來越多地使用有機高分子材料作為載體。
廖妙飛(重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文)以殼聚糖為原料，以戊二醛為交聯(lián)劑，以碳酸鈣為致孔劑，用反相懸浮法制備出交聯(lián)殼聚糖；以二環(huán)己基碳二亞胺為縮合劑制備交聯(lián)殼聚糖-賴氨酸樹脂，然后用吸附法將植酸酶固定在載體上。固定化酶的最適ph范圍是5.5-6.5，最適溫度范圍35-45℃。唐三三(食品工業(yè)科技，2010(9)，1-4.))以海藻酸鈉、明膠、瓊脂、卡拉膠、殼聚糖為原料，采用瓊脂包埋法制備固定化奶酪氨酸酶，固定化酶的性能得到明顯改善。
由于載體的原料和制備方法不同，酶的固定化過程通常有兩種方法。一種是吸附法，由于載體的制備條件復(fù)雜，反應(yīng)慢，需要高溫加熱，為了避免破壞酶的活性，一般先通過一系列反應(yīng)制備出固體載體，然后再將固體載體浸入到酶液中，將植酸酶吸附在載體上。第二種方法是包埋法。包埋法是將載體的原料或中間體配成溶液，和植酸酶混合在一起，在載體固化的同時，將植酸分子包埋在載體中。吸附法的特點是載體的制備與酶的固定化過程分別進行，對載體的原料和制備方法選擇范圍廣，不必?fù)?dān)心在載體制備過程中，酶的活性遭到破壞。吸附法的缺點是酶的吸附速度慢，由于受到濃度梯度的影響，酶的吸附量小，且大多數(shù)酶只吸附在載體表面，提高溫度或延長吸附時間又容易造成酶的失活和浪費。吸附在載體表面的酶在貯存和加工過程中容易脫落，結(jié)果使固定化酶的有效含量降低，使用時需要增大固定化酶的用量才能達到有效濃度，實際上增加了酶的使用成本，造成酶的浪費，不利于植酸酶的推廣應(yīng)用。而包埋法在載體固化的同時就將植酸酶包裹在其中，因此，原位包埋法的最大優(yōu)點是將酶包裹在載體內(nèi)部，不易脫落，并且酶的載有量增加，能大大有效提高植酸酶和載體的利用率，是固定化植酸酶理想的方法。但是原位包埋法的特點是載體的制備和酶的固定化過程同時進行，在載體制備過程中，酶的活性遭到破壞，因此，對載體的原料選擇和制備方法有較高的要求。
文獻報道了以可溶性大分子藻酸鈉、明膠、瓊脂、卡拉膠、殼聚糖等作為固定化載體材料，將其植酸溶解在水中，不需要進一步反應(yīng)，采用包埋法，直接干燥固化，就能得到固定化植酸酶。該方法以水溶性大分子為載體原料，為實現(xiàn)包埋法固定植酸酶創(chuàng)造了條件。但是這些大分子在水中的溶解性有限，不能完全溶解，因此，會造成植酸酶在固定化載體中分布不均勻，使用的時候會表現(xiàn)出性能不穩(wěn)定。另外，雖然明膠、瓊脂、卡拉膠等這些大分子都可以作為食品添加劑，但是，畢竟不是人和動物生長的必需物質(zhì)，長期食用，勢必會對人和動物的健康造成不良的影響。隨著人們對酶的固定化載體的深入研究，以及人們對環(huán)境保護的重視，天然大分子在載體中的應(yīng)用越來越引起人們的關(guān)注。天然大分子如纖維素、淀粉廣泛存在于大自然中,是一種既價廉又取之不盡的可再生資源,它們安全無毒，可生物降解，具有良好的生物相容性、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。因此,近年來天然多糖成為國內(nèi)外研究最熱門的固定化材料之一，但是天然多糖含有大量羥基，分子間作用力強，不溶于水，反應(yīng)性差，難以加工成型，因此，限制了它們在很多領(lǐng)域的應(yīng)用。目前,我國開展天然多糖在酶固定化載體材料中的應(yīng)用還處于起步階段,尤其是其實際的生產(chǎn)、應(yīng)用基本上是空白。因此，開發(fā)出質(zhì)優(yōu)價廉耐高溫的植酸酶制劑，促進它們在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，是酶工業(yè)和食品工業(yè)的重要任務(wù)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種安全無毒且耐高溫植酸酶凝膠制劑，且合成簡單、價格低廉。
考慮到醛基淀粉優(yōu)良的溶解性以及活潑的反應(yīng)活性，為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明以醛基淀粉和交聯(lián)劑為原料制備酶的固定化載體，同時將植酸酶包裹在其中。
所述耐高溫植酸酶凝膠制劑通過如下方法制備而成：將醛基淀粉溶液和植酸酶溶于水中，混合均勻，加入植酸酶配成前體溶液。然后將交聯(lián)劑溶液加到前體溶液中，室溫下攪拌使各組分混合均勻。室溫下靜置，使其充分反應(yīng)，即可得到果凍狀載有植酸酶的水凝膠。將得到的水凝膠經(jīng)過切粒、干燥，即可得到植酸酶凝膠制劑?？梢詫⑵渲瞥善瑺詈皖w粒狀或微球。
所述的醛基淀粉為：可溶性淀粉經(jīng)氧化反應(yīng)得到的醛基淀粉；
所述的醛基淀粉溶液為：將醛基淀粉溶于水形成的水溶液，其質(zhì)量濃度優(yōu)選5％-20％。
所述的交聯(lián)劑為：賴氨酸、殼聚糖中的一種或兩種。
所述的醛基淀粉與交聯(lián)劑的摩爾數(shù)比優(yōu)選1:2-8。
本發(fā)明創(chuàng)新點及優(yōu)點在于：
(1)本發(fā)明的原料安全無毒，價廉易得，可生物降解。
(2)本發(fā)明選用醛基淀粉，克服了普通淀粉溶解性差、反應(yīng)活性低的缺點。不僅增加了淀粉的水溶性，而且提高了淀粉的反應(yīng)活性，為實現(xiàn)原位包埋法固定化植酸酶提供了技術(shù)支持。
(3)本發(fā)明原位包埋法固定化植酸酶，條件溫和，反應(yīng)快速，載體的制備和酶的固定化過程不無需加熱和其它催化劑，反應(yīng)快速，現(xiàn)象明顯，反應(yīng)過程容易控制。
(4)本發(fā)明的原料均能溶于水，植酸酶能溶解在固定化載體的前體溶液中，反應(yīng)后得到不溶于水的果凍狀水凝膠，反應(yīng)前前體是透明的溶液，當(dāng)醛基淀粉和交聯(lián)劑反應(yīng)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)后，整個體系變成成了一塊不溶于水的固體凝膠，溶液中的所有物質(zhì)包括水和植酸酶都被包埋在凝膠當(dāng)中，酶幾乎沒有流失，能全部包埋在固定化載體中，酶的包埋效果好，且植酸酶在固定化載體中分布均勻，使用時制劑性能穩(wěn)定，可以做到定量投料，避免造成酶和酶制劑的浪費，有利于酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。
(5)載體的制備過程可以和酶的固定化過程同時進行，在室溫下反應(yīng)快速，十幾分鐘即可完成，并且不會對酶造成破壞，真正實現(xiàn)原位包埋法制備植酸酶凝膠制劑。
(6)本發(fā)明利用改性醛基淀粉中的醛基和交聯(lián)劑中的氨基反應(yīng)形成亞胺基，這類化合物很穩(wěn)定，并且通常有較好的耐熱性，使得植酸酶被緊緊包埋在含亞胺基的凝膠載體內(nèi)部，因此，植酸酶的耐熱性得到明顯的改善。在實際應(yīng)用中，亞胺基團在酸性溶液中容易分解，產(chǎn)生原來的醛基化合物(即醛基淀粉)和氨基化合物(即賴氨酸)。本發(fā)明植酸酶凝膠制劑在酸性條件下(即在胃液中)固定化載體中亞胺基發(fā)生分解，凝膠制劑的交聯(lián)結(jié)構(gòu)發(fā)生解離，被包埋的植酸酶迅速游離出來，參與胃中食物的消化作用，使得植酸酶得到充分利用，而且產(chǎn)生的醛基淀粉和賴氨酸可以被動物消化吸收。
可以看出，本發(fā)明制備的植酸酶凝膠制劑，不僅能提高酶的耐熱性，還具有在胃液中控制釋放的特性，有利于動物健康。而且制備方法簡便快速、反應(yīng)條件溫和，對植酸酶無傷害、酸酶負(fù)載量高，達50％以上，用率高，可達100％。載體原料安全無毒、可生物降解、原料組成少、價格低廉、植酸酶凝膠制劑可加工成片、顆粒和微球，能滿足不同領(lǐng)域應(yīng)用的需要，有利于植酸酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。
附圖說明
圖1為本發(fā)明植酸酶凝膠制劑分別在模擬胃液和模擬腸液中對植酸酶的釋放率。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明的具體實施進行更詳細(xì)的描述，但所述實施例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實施例1醛基淀粉的制備
取10g可溶性淀粉于250ml加入水,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的淀粉乳,加熱至80-85℃糊化30分鐘。然后降溫到45℃，邊攪拌邊加入硫酸銅溶液(cu2+的用量為淀粉質(zhì)量的0.02％)作為催化劑,緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的雙氧水(雙氧水用量與淀粉用量的摩爾比為3:1),在45℃反應(yīng)3小時。反應(yīng)結(jié)束產(chǎn)物用無水乙醇沉析，得到的固體產(chǎn)物，用乙醚洗滌，50℃干燥，即可得到醛基淀粉，密封保存，備用。
實施例2植酸酶凝膠制劑的制備
稱取2g醛基淀粉于20ml的小燒杯中，加入8g蒸餾水,另取賴氨酸1.75g和植酸酶3g加入2ml蒸餾水中，將兩溶液混合均勻。室溫下反應(yīng)十幾分鐘，反應(yīng)物固化，即得到柔軟的載有植酸酶的水凝膠。將載有植酸酶的水凝膠小心從反應(yīng)器中拿出來用刀片切成片狀或顆粒狀，室溫下自然干燥，變硬化，即可得到片狀和顆粒狀植酸酶凝膠制劑。酸酶負(fù)載量54.4％。
實施例3植酸酶凝膠制劑的制備
將2g醛基淀粉溶解于20ml蒸餾水中，加入5g植酸酶，配成前體溶液。稱取殼聚糖2.5g，配成溶液，加到前體溶液中，迅速攪拌使混合均勻。室溫下靜置，反應(yīng)十幾分鐘，即得到載有植酸酶的水凝膠。小心取出來，用刀切成片狀或顆粒狀。室溫下干燥硬化，即得片狀和顆粒狀植酸酶凝膠制劑。酸酶負(fù)載量57.1％。
對本發(fā)明植酸酶凝膠制劑的熱穩(wěn)定性進行測定(樣品在各種溫度下保溫1h后，測定酶的相對活力)。結(jié)果如表1。
表1植酸酶自由酶和植酸酶凝膠制劑的溫度穩(wěn)定性
表1說明：自由酶的最適溫度范圍45-55℃，本發(fā)明的植酸酶凝膠制劑，最適溫度范圍45-70℃,最適溫度范圍明顯變寬，并且80℃受熱1小時，酶活力仍能保持85％以上，大大提高了植酸酶的熱穩(wěn)定性。
結(jié)合圖1，可以看出：本發(fā)明植酸酶凝膠制劑，不管在模擬胃液中，還是在模擬腸液中，都要先有一個吸水溶脹過程，然后才能將水溶性的植酸酶釋放出來，因此，前30分鐘兩種溶液中植酸酶的釋放率都不高。但是，當(dāng)達到溶脹平衡以后，胃液中植酸酶的釋放率快速增加。這是由于在胃液中，酸酶不僅僅隨著凝膠制劑的溶脹而釋放出來，胃液中，亞胺基團解離，凝膠制劑的交聯(lián)結(jié)構(gòu)破壞，使包埋在里面的植酸酶迅速釋放出來，很快就全部釋放，參與消化過程。