本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種豬腎細(xì)胞缺鐵模型及其建立方法。

背景技術(shù)：

鐵是生物體需要量最大而又最易產(chǎn)生代謝障礙的必需微量元素，鐵攝入不足會引起動物機(jī)體貧血或相關(guān)功能障礙。因此，缺鐵模型的建立對缺鐵性疾病的研究至關(guān)重要。目前的一些缺鐵模型的方法為：剪尾放血法或是用低鐵飼料喂養(yǎng)。迄今，沒有關(guān)于豬腎缺鐵細(xì)胞建立的方法和模型。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種豬腎細(xì)胞缺鐵模型及其建立方法，為深入探索和預(yù)防新生動物缺鐵性貧血提供可靠的缺鐵模型。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案：

一種豬腎細(xì)胞缺鐵模型的建立方法，包括以下步驟：

s1豬腎細(xì)胞培養(yǎng)；

s2缺鐵誘導(dǎo)：在豬腎細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入缺鐵誘導(dǎo)劑，致使豬腎細(xì)胞產(chǎn)生缺鐵應(yīng)激，得到豬腎細(xì)胞缺鐵模型。

進(jìn)一步的，所述缺鐵誘導(dǎo)劑為去鐵胺。

進(jìn)一步的，所述步驟s2缺鐵誘導(dǎo)的具體方法為：

在豬腎細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入去鐵胺溶液孵育12～48小時，得到豬腎細(xì)胞缺鐵模型；所述去鐵胺溶液的濃度為：75～125μm。

進(jìn)一步的，所述步驟s2缺鐵誘導(dǎo)的具體方法為：

收集豬腎細(xì)胞對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度10⁴個/ml，每孔加入2～3ml；在36～37℃、4～6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；至細(xì)胞單層鋪滿孔底加入去鐵胺溶液孵育12～48小時，得到豬腎細(xì)胞缺鐵模型；所述去鐵胺溶液的濃度為：75～125μm。

進(jìn)一步的，所述步驟s1豬腎細(xì)胞培養(yǎng)中選取的豬腎細(xì)胞為新生仔豬的腎細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述步驟s1豬腎細(xì)胞培養(yǎng)的具體方法為：

選用原代的豬腎細(xì)胞，以dmem含血清培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在36～37℃、4～6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，所述的豬腎細(xì)胞缺鐵模型的腎細(xì)胞抑制率為0～15%。

進(jìn)一步的，所述的豬腎細(xì)胞缺鐵模型的鐵含量為100～180μg/dl。

本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點之一：

一．本發(fā)明提供了一種豬腎細(xì)胞缺鐵模型及其建立方法，為深入探索和預(yù)防新生動物缺鐵性貧血提供可靠的技術(shù)和方法。

二．由于腎臟是合成促紅細(xì)胞生成素（epo）的主要場所，與紅細(xì)胞生成和血紅蛋白合成密切相關(guān)，因此本發(fā)明豬腎細(xì)胞缺鐵模型是研究鐵營養(yǎng)及預(yù)防貧血的優(yōu)良的細(xì)胞材料。

三．本發(fā)明制得的豬腎細(xì)胞缺鐵模型活性好，腎細(xì)胞抑制率低，缺鐵效果明顯。

四．本發(fā)明的建立方法簡單，易操作，重復(fù)性強(qiáng)。

附圖說明

圖1正常豬腎細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)；

圖2豬腎細(xì)胞缺鐵模型的細(xì)胞形態(tài)；

圖3去鐵銨濃度對豬腎細(xì)胞的抑制率的影響；

圖4去鐵銨濃度對豬腎細(xì)胞鐵含量的影響；

圖5去鐵銨孵育時間對豬腎細(xì)胞的抑制率的影響。

具體實施方式

實施例1

一種豬腎細(xì)胞缺鐵模型的建立方法，包括以下步驟：

s1豬腎細(xì)胞培養(yǎng)：選用原代的豬腎細(xì)胞，以dmem含血清培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在36℃、4%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

其中，豬腎細(xì)胞為新生仔豬的腎細(xì)胞。這是由于新生仔豬一般出生后如不補(bǔ)鐵，7天內(nèi)會出現(xiàn)嚴(yán)重貧血癥狀。而腎臟是合成促紅細(xì)胞生成素（epo）的主要場所，與紅細(xì)胞生成和血紅蛋白合成密切相關(guān)。選用新生仔豬的腎細(xì)胞建立缺鐵模型，易操作，重復(fù)性好。

s2缺鐵誘導(dǎo)：在豬腎細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入缺鐵誘導(dǎo)劑，致使豬腎細(xì)胞產(chǎn)生缺鐵應(yīng)激，得到豬腎細(xì)胞缺鐵模型。

其中，所述缺鐵誘導(dǎo)劑為去鐵胺。去鐵胺的濃度為：75μm。在豬腎細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入去鐵胺孵育12小時，得到豬腎細(xì)胞缺鐵模型。

本發(fā)明得到的豬腎細(xì)胞缺鐵模型的腎細(xì)胞抑制率為0～15%；豬腎細(xì)胞缺鐵模型的鐵含量為100～180μg/dl。

實施例2

一種豬腎細(xì)胞缺鐵模型的建立方法，包括以下步驟：

s1豬腎細(xì)胞培養(yǎng)：選用原代的豬腎細(xì)胞，以dmem含血清培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在37℃、6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

s2缺鐵誘導(dǎo)：收集豬腎細(xì)胞對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度10⁴個/ml，每孔加入2ml；在37℃、6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；至細(xì)胞單層鋪滿孔底加入缺鐵誘導(dǎo)劑進(jìn)行孵育，其中，去鐵胺的濃度為：125μm。在豬腎細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入去鐵胺孵育48小時，得到豬腎細(xì)胞缺鐵模型。

本發(fā)明得到的豬腎細(xì)胞缺鐵模型的腎細(xì)胞抑制率為0～15%；豬腎細(xì)胞缺鐵模型的鐵含量為100～180μg/dl。

實施例3

一種豬腎細(xì)胞缺鐵模型的建立方法，包括以下步驟：

s1豬腎細(xì)胞培養(yǎng)：選用原代的豬腎細(xì)胞，以dmem含血清培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在37℃、6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

s2缺鐵誘導(dǎo)：收集豬腎細(xì)胞對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度10⁴個/ml，每孔加入3ml；在37℃、6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；至細(xì)胞單層鋪滿孔底加入缺鐵誘導(dǎo)劑進(jìn)行孵育，其中，去鐵胺的濃度為：100μm。在豬腎細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入去鐵胺孵育24小時，得到豬腎細(xì)胞缺鐵模型。

本發(fā)明得到的豬腎細(xì)胞缺鐵模型的腎細(xì)胞抑制率為0～15%；豬腎細(xì)胞缺鐵模型的鐵含量為100～180μg/dl。

豬腎細(xì)胞缺鐵模型的細(xì)胞形態(tài)

s1豬腎細(xì)胞培養(yǎng)：選用原代的豬腎細(xì)胞（由本實驗室細(xì)胞庫提供），以dmem含血清培養(yǎng)液（10%胎牛血清）為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在36～37℃、4～6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

s2缺鐵誘導(dǎo)：在豬腎細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入缺鐵誘導(dǎo)劑，致使豬腎細(xì)胞產(chǎn)生缺鐵應(yīng)激，得到豬腎細(xì)胞缺鐵模型。具體方法為：

收集豬腎細(xì)胞對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度10⁴個/ml，每孔加入2.5ml；在36～37℃、4～6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；至細(xì)胞單層鋪滿孔底加入缺鐵誘導(dǎo)劑去鐵胺（dfo）；設(shè)置7個實驗組，每組重復(fù)5次。在這7個實驗組的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別加入0μm、25μm、50μm、75μm、100μm、125μm、150μmdfo致使細(xì)胞產(chǎn)生缺鐵應(yīng)激。再于0h、12h、24h、48h、56h、64h、72h觀察細(xì)胞狀態(tài)變化，其中顯微鏡放大倍數(shù)為100倍?？梢钥吹秸Ｘi腎細(xì)胞呈現(xiàn)多角形，如圖1所示；去鐵胺dfo處理細(xì)胞形態(tài)變長，如圖2所示。

不同去鐵銨濃度對豬腎細(xì)胞的抑制率的影響實驗

步驟s1豬腎細(xì)胞培養(yǎng)：選用原代的豬腎細(xì)胞（由本實驗室細(xì)胞庫提供），以dmem含血清培養(yǎng)液（10%胎牛血清）為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在36～37℃、4～6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

步驟s2缺鐵誘導(dǎo)：

收集豬腎細(xì)胞對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度10⁴個/ml，每孔加入2.5ml；在36～37℃、4～6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；至細(xì)胞單層鋪滿孔底加入缺鐵誘導(dǎo)劑去鐵胺（dfo）；設(shè)置7個實驗組，每組重復(fù)5次。在這7個實驗組的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別加入0μm、25μm、50μm、75μm、100μm、125μm、150μmdfo致使細(xì)胞產(chǎn)生缺鐵應(yīng)激。孵育24h后進(jìn)行腎細(xì)胞抑制率檢測。

檢測方法：采用mtt法，收集匯合的細(xì)胞，于每孔中加入20μlmtt溶液（5mg/ml，即0.5%mtt），繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值。

結(jié)果如圖3所示，隨dfo濃度增加，腎細(xì)胞抑制率升高，濃度過大會對腎細(xì)胞產(chǎn)生毒性；dfo的時用濃度為75～125μm，優(yōu)選100μm。此時，豬腎細(xì)胞的抑制率較低，活性較強(qiáng)。

不同去鐵銨濃度對豬腎細(xì)胞鐵含量的影響

步驟s1豬腎細(xì)胞培養(yǎng)：選用原代的豬腎細(xì)胞（由本實驗室細(xì)胞庫提供），以dmem含血清培養(yǎng)液（10%胎牛血清）為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在36～37℃、4～6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。步驟s2缺鐵誘導(dǎo)中：

收集豬腎細(xì)胞對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度10⁴個/ml，每孔加入2.5ml；在36～37℃、4～6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；至細(xì)胞單層鋪滿孔底加入缺鐵誘導(dǎo)劑去鐵胺（dfo）；設(shè)置7個實驗組，每組重復(fù)5次。在這7個實驗組的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別加入0μm、25μm、50μm、75μm、100μm、125μm、150μmdfo致使細(xì)胞產(chǎn)生缺鐵應(yīng)激。孵育24h后進(jìn)行豬腎細(xì)胞抑制率檢測。

檢測方法：使用亞諾法生技股份有限公司（abnova)ironassaykit檢測試劑盒。

結(jié)果如圖4所示，隨dfo濃度增加，鐵含量減少。

不同去鐵銨孵育時間對豬腎細(xì)胞的抑制率的影響

步驟s1豬腎細(xì)胞培養(yǎng)：選用原代的豬腎細(xì)胞（由本實驗室細(xì)胞庫提供），以dmem含血清培養(yǎng)液（10%胎牛血清）為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在36～37℃、4～6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

步驟s2缺鐵誘導(dǎo)中：

收集豬腎細(xì)胞對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度10⁴個/ml，每孔加入2.5ml；在36～37℃、4～6%co2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；至細(xì)胞單層鋪滿孔底加入缺鐵誘導(dǎo)劑去鐵胺（dfo）；設(shè)置7個實驗組，每組重復(fù)5次。在這7個實驗組的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入100μmdfo致使細(xì)胞產(chǎn)生缺鐵應(yīng)激。分別孵育0h、12h、24h、48h、56h、64h、72h后進(jìn)行豬腎細(xì)胞抑制率檢測。

檢測方法：采用mtt法，收集匯合的細(xì)胞，于每孔中加入20μlmtt溶液（5mg/ml，即0.5%mtt），繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值。

結(jié)果如圖5所示，隨作用時間延長，豬腎細(xì)胞抑制率升高，時間過長，對豬腎細(xì)胞造成毒副作用。dfo的適宜的孵育時間為12～48小時，優(yōu)選24小時。此時，豬腎細(xì)胞的抑制率較低，活性較強(qiáng)。