本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體地，涉及一種vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞培養(yǎng)是生物與健康相關(guān)研究領(lǐng)域的一項重要技術(shù)。隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展，目前細(xì)胞培養(yǎng)已成為細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科研究的重要基礎(chǔ)。為了深入探討細(xì)胞的生長活動規(guī)律、有關(guān)疾病的病理和藥物的藥理（毒理）機(jī)制，開發(fā)具有不同針對性的細(xì)胞培養(yǎng)方法具有重要意義。細(xì)胞復(fù)蘇是培養(yǎng)細(xì)胞的一種，是生命及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)，在研究中往往需要對凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，從而進(jìn)行體內(nèi)外的相關(guān)研究。

vero細(xì)胞是日本學(xué)者1962年從非洲綠猴(cercopithecusaethiopsmonkey)腎建立的猴腎細(xì)胞系。其名稱的由來是取自世界語中“綠”字的verde前兩個字母和“腎”字前兩個字母合在一起，但世界語中不允許vere存在，而需以“o”結(jié)尾，故命名為“vero”。其第93代被帶到美國nih的過敏與傳染病研究所熱帶病毒研究室，第113代被提交給atcc，編號為atccno.ccl-81。

除了常規(guī)的科研需要之外，經(jīng)過全面的研究鑒定，vero細(xì)胞具有胞核學(xué)穩(wěn)定，沒有外源因子污染和致瘤性的優(yōu)點，完全符合1987年who關(guān)于用于生物制品的傳代細(xì)胞的規(guī)程要求，并已被who批準(zhǔn)可用作疫苗生產(chǎn)的基質(zhì)。于是，vero細(xì)胞小兒麻痹滅活疫苗、小兒麻痹活疫苗、vero細(xì)胞狂犬病疫苗相繼在法國被研制出來并獲批準(zhǔn)生產(chǎn)。因此，vero細(xì)胞的應(yīng)用前景以及需求量極大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明提供了一種vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，包括以下步驟：將凍存的vero細(xì)胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內(nèi)于37℃搖晃至含有vero細(xì)胞專用凍存液的vero細(xì)胞液完全融化將vero細(xì)胞液加入到盛有2-3ml新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基的離心管中，用移液槍上下吹打20-30次，于1000-1500g/min的轉(zhuǎn)速下離心3-10min；移去上清液，加入1-2ml的新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基，用移液槍上下吹打40-50次，然后均勻的加入到盛有7-9ml的新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基，于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；所述vero細(xì)胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5-15份、羥乙基淀粉3-8份、葡萄糖5-15份、維生素e1-5份、20%甘露醇2-10份、丙二醇1-2份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基）磺?；?2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷0.8-2份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基80-90份。本發(fā)明所述的vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，方法合理，能夠去除凍存劑對復(fù)蘇后細(xì)胞生長的影響，復(fù)蘇后的vero細(xì)胞存活率高，細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞狀態(tài)好，邊界清晰，可以有利于乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究。其中，vero細(xì)胞專用凍存液對細(xì)胞損傷小，20%甘露醇為滲透性保護(hù)液，而(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基)磺?；?2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷則抑制細(xì)胞活動和基因表達(dá)，維生素e的抗氧化性好，在保證休眠vero細(xì)胞的營養(yǎng)的同時還可以顯著減少對細(xì)胞的損傷，提高凍存細(xì)胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的狀態(tài)。

進(jìn)一步的，上述的vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，所述vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括70-90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10-30%的胎牛血清。vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基，組分合理，可以進(jìn)一步為復(fù)蘇的細(xì)胞的提供營養(yǎng)物質(zhì)。

進(jìn)一步的，上述的vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖80-90份、碳酸氫鈉10-20份、丙酮酸鈉8-18份、人血白蛋白2-10份、氯化鉀30-50份、無水硫酸鎂5-12份、氯化鈉60-80份、無水磷酸二氫鈉8-16份、pha-植物血球凝集素0.2-1份、葉酸0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、煙酰胺0.2-0.8份、無水氯化鈣20-40份、硝酸鐵0.1-0.5份、丁二酸5-10份、丁二酸鈉9-18份、d-泛酸鈣0.2-0.8份、酒石酸膽堿0.5-1份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.1-0.5份、鹽酸吡哆辛0.1-0.6份、還原谷胱甘肽0.1-0.8份、膽固醇1-5份、抗壞血酸磷酸酯0.5-1.2份、聚碳酸酯0.3-1.5份、酚紅鈉0.8-1.5份和去離子水100份。

進(jìn)一步的，上述的vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5-10份、l-鹽酸胱氨酸3-8份、l-絲氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、l-鹽酸組氨酸4-6份、l-異亮氨酸8-20份、l-亮氨酸7-18份、l-鹽酸賴氨酸10-20份、l-甲硫氨酸1-6份、l-苯丙氨酸2-8份、l-蘇氨酸5-15份、l-色氨酸1-3份、l-酪氨酸5-9份和l-纈氨酸8-12份。

進(jìn)一步的，上述的vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2-5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子2-10份、白介素23-8份、白介素43-6份、白介素141-5份、ifn-γ3-6份和神經(jīng)白細(xì)胞素1-4份?；A(chǔ)培養(yǎng)基組分合理，營養(yǎng)豐富，富含生長因子，可以為vero細(xì)胞培養(yǎng)提供更多的營養(yǎng)物，細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞狀態(tài)好，邊界清晰，鏡下觀察透亮、分裂相更多、形態(tài)及分散度佳，用于vero細(xì)胞的培養(yǎng)以及研究。

進(jìn)一步的，上述的vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，以重量組分計，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素?？梢杂行Х乐箯?fù)蘇的細(xì)胞被污染。

進(jìn)一步的，上述的vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。青霉素和鏈霉素活性好，效果佳。

有益效果：本發(fā)明所述的vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，能夠去除凍存劑對復(fù)蘇后細(xì)胞生長的影響，復(fù)蘇后的vero細(xì)胞存活率高，細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞狀態(tài)好，邊界清晰，可以有利于乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究。

具體實施方式

下面將通過幾個具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，這些實施例只是為了說明問題，并不是一種限制。

實施例1

一種vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，包括以下步驟：將凍存的vero細(xì)胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內(nèi)于37℃搖晃至含有vero細(xì)胞專用凍存液的vero細(xì)胞液完全融化將vero細(xì)胞液加入到盛有2ml新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基的離心管中，用移液槍上下吹打20次，于1000g/min的轉(zhuǎn)速下離心10min；移去上清液，加入1ml的新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基，用移液槍上下吹打40次，然后均勻的加入到盛有7ml的新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基，于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

其中，所述vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括70%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及30%的胎牛血清。此外，所述vero細(xì)胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5份、羥乙基淀粉3份、葡萄糖5份、維生素e1份、20%甘露醇2份、丙二醇1份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基）磺?；?2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷0.8份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基80份。

其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖80份、碳酸氫鈉10份、丙酮酸鈉8份、人血白蛋白2份、氯化鉀30份、無水硫酸鎂5份、氯化鈉60份、無水磷酸二氫鈉8份、pha-植物血球凝集素0.2份、葉酸0.2份、肌醇0.5份、煙酰胺0.2份、無水氯化鈣20份、硝酸鐵0.1份、丁二酸5份、丁二酸鈉9份、d-泛酸鈣0.2份、酒石酸膽堿0.5份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.1份、鹽酸吡哆辛0.1份、還原谷胱甘肽0.1份、膽固醇1份、抗壞血酸磷酸酯0.5份、聚碳酸酯0.3份、酚紅鈉0.8份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸3份、l-絲氨酸3份、甘氨酸1份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸8份、l-亮氨酸7份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-蘇氨酸5份、l-色氨酸1份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子2份、白介素23份、白介素43份、白介素141份、ifn-γ3份和神經(jīng)白細(xì)胞素1份。

此外，以重量組分計，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。

實施例2

一種vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，包括以下步驟：將凍存的vero細(xì)胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內(nèi)于37℃搖晃至含有vero細(xì)胞專用凍存液的vero細(xì)胞液完全融化將vero細(xì)胞液加入到盛有3ml新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基的離心管中，用移液槍上下吹打30次，于1500g/min的轉(zhuǎn)速下離心3min；移去上清液，加入2ml的新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基，用移液槍上下吹打50次，然后均勻的加入到盛有9ml的新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基，于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

其中，所述vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10%的胎牛血清。此外，所述vero細(xì)胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜15份、羥乙基淀粉8份、葡萄糖15份、維生素e5份、20%甘露醇10份、丙二醇2份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基）磺?；?2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷2份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基90份。

其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖90份、碳酸氫鈉20份、丙酮酸鈉18份、人血白蛋白10份、氯化鉀50份、無水硫酸鎂12份、氯化鈉80份、無水磷酸二氫鈉16份、pha-植物血球凝集素1份、葉酸0.6份、肌醇1.5份、煙酰胺0.8份、無水氯化鈣40份、硝酸鐵0.5份、丁二酸10份、丁二酸鈉18份、d-泛酸鈣0.8份、酒石酸膽堿1份、核黃素0.3份、鹽酸硫胺0.5份、鹽酸吡哆辛0.6份、還原谷胱甘肽0.8份、膽固醇5份、抗壞血酸磷酸酯1.2份、聚碳酸酯1.5份、酚紅鈉1.5份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸10份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸5份、l-鹽酸組氨酸6份、l-異亮氨酸20份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸6份、l-苯丙氨酸8份、l-蘇氨酸15份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸9份和l-纈氨酸12份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子10份、白介素28份、白介素46份、白介素145份、ifn-γ6份和神經(jīng)白細(xì)胞素4份。

此外，以重量組分計，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。

實施例3

一種vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，包括以下步驟：將凍存的vero細(xì)胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內(nèi)于37℃搖晃至含有vero細(xì)胞專用凍存液的vero細(xì)胞液完全融化將vero細(xì)胞液加入到盛有2ml新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基的離心管中，用移液槍上下吹打25次，于1200g/min的轉(zhuǎn)速下離心6min；移去上清液，加入2ml的新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基，用移液槍上下吹打45次，然后均勻的加入到盛有8ml的新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基，于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

其中，所述vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括80%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及20%的胎牛血清。此外，所述vero細(xì)胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜12份、羥乙基淀粉5份、葡萄糖12份、維生素e3份、20%甘露醇8份、丙二醇1.5份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷1.2份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基88份。

其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖86份、碳酸氫鈉18份、丙酮酸鈉12份、人血白蛋白6份、氯化鉀40份、無水硫酸鎂8份、氯化鈉75份、無水磷酸二氫鈉12份、pha-植物血球凝集素0.5份、葉酸0.4份、肌醇1份、煙酰胺0.5份、無水氯化鈣30份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、還原谷胱甘肽0.5份、膽固醇3份、抗壞血酸磷酸酯0.8份、聚碳酸酯0.8份、酚紅鈉1.2份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括4份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸8份、l-鹽酸胱氨酸6份、l-絲氨酸5份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸10份、l-鹽酸賴氨酸15份、l-甲硫氨酸3份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸9份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-纈氨酸9份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子8份、白介素26份、白介素44份、白介素143份、ifn-γ5份和神經(jīng)白細(xì)胞素2份。

此外，以重量組分計，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。

實施例4

一種vero細(xì)胞的復(fù)蘇方法，包括以下步驟：將凍存的vero細(xì)胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min內(nèi)于37℃搖晃至含有vero細(xì)胞專用凍存液的vero細(xì)胞液完全融化將vero細(xì)胞液加入到盛有3ml新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基的離心管中，用移液槍上下吹打30次，于1400g/min的轉(zhuǎn)速下離心4min；移去上清液，加入1-2ml的新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基，用移液槍上下吹打40次，然后均勻的加入到盛有9ml的新鮮vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基，于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

其中，所述vero細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10%的胎牛血清。此外，所述vero細(xì)胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5份、羥乙基淀粉8份、葡萄糖9份、維生素e5份、20%甘露醇2份、丙二醇1份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基）磺?；?2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷1.6份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基85份。

其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖88份、碳酸氫鈉12份、丙酮酸鈉12份、人血白蛋白6份、氯化鉀35份、無水硫酸鎂10份、氯化鈉70份、無水磷酸二氫鈉14份、pha-植物血球凝集素0.4份、葉酸0.4份、肌醇0.9份、煙酰胺0.5份、無水氯化鈣28份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.2份、鹽酸吡哆辛0.5份、還原谷胱甘肽0.6份、膽固醇3份、抗壞血酸磷酸酯0.8份、聚碳酸酯0.4份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸3份、l-絲氨酸5份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸20份、l-亮氨酸7份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸4份、l-苯丙氨酸5份、l-蘇氨酸8份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸12份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括4份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子2份、白介素23份、白介素45份、白介素143份、ifn-γ6份和神經(jīng)白細(xì)胞素4份。

此外，以重量組分計，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。

以上所述僅是發(fā)明的幾個實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。