本發(fā)明涉及一株產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的滴孔菌及其在制備γ-癸內(nèi)酯中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

內(nèi)酯類香料以其獨特的香氣品質(zhì)在香料行業(yè)中占有重要位置，可用于食品和日用品香精的調(diào)配。其中，應(yīng)用較為廣泛的一種是γ-癸內(nèi)酯。γ-癸內(nèi)酯(gamma-decalactone，gdl)，又稱為丙位癸內(nèi)酯，其分子式為c10h18o2，γ-癸內(nèi)酯的香氣閾值為11μg/kg，香氣閾值很低，香氣很強，具有甜果香、桃子、椰子、香草以及奶油香氣的味道。γ-癸內(nèi)酯被美國食品和藥物管理局將其列為一般公認(rèn)為安全的食品添加劑。中國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)也將其列為允許使用的食品用香料。γ-癸內(nèi)酯是調(diào)配牛奶、奶油、黃油、桃子、杏子、漿果、芒果、蘋果、草莓、椰子、柑橘、巧克力等食用香精的常用原料。

天然γ-癸內(nèi)酯存在于很多水果中，如桃子、草莓、椰子、芒果、杏子等。從這些天然原料中提取是制備天然γ-癸內(nèi)酯的主要方法。但是由于植物原料的生產(chǎn)受地域和季節(jié)限制，難以實現(xiàn)持續(xù)和大量的供應(yīng)。目前γ-癸內(nèi)酯的主要生產(chǎn)方法是化學(xué)合成。然而合成香料生產(chǎn)過程中殘留的化學(xué)物質(zhì)可能對人體健康帶來不利，而且化學(xué)合成法合成的γ-癸內(nèi)酯是無旋光的外消旋混合物，而利用微生物生產(chǎn)則可以得到具有旋光活性和較純的產(chǎn)物，是天然香料生產(chǎn)的大趨勢。

目前發(fā)現(xiàn)能夠合成或轉(zhuǎn)化產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯的微生物主要為酵母菌和部分絲狀真菌，其中研究最多的為耶羅威亞解脂酵母yarrowialipolytic，該菌種及利用該菌種發(fā)酵產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯的技術(shù)已獲得國外專利的保護。

γ-癸內(nèi)酯是多種微生物代謝的中間產(chǎn)物，以蓖麻油為前體利用微生物發(fā)酵可以產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯。但是，根據(jù)目前有關(guān)微生物產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯的文獻，多數(shù)報道是有關(guān)γ-癸內(nèi)酯的代謝途徑理論方面的研究，少數(shù)涉及的γ-癸內(nèi)酯的生產(chǎn)的報道也是菌種經(jīng)過基因工程操作的突變菌株才能達到克級的生產(chǎn)能力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一株產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的滴孔菌及其在制備γ-癸內(nèi)酯中的應(yīng)用。利用本發(fā)明所述菌株可有效地轉(zhuǎn)化蓖麻油生成γ-癸內(nèi)酯，實現(xiàn)通過微生物發(fā)酵法獲得以γ-癸內(nèi)酯為主要目的產(chǎn)物的愿望。

本發(fā)明所述產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的滴孔菌a-9屬于多孔菌科滴孔菌屬，其特征在于：該菌株名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9，菌株已于2017年5月25日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為cgmccn0.13895。

上述產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯及三萜類化合物的滴孔菌a-9是一株發(fā)明人自主野外采摘分離純化得到的滴孔菌，其生物學(xué)特征是：子實體無柄，呈現(xiàn)半圓形，大小約20×15cm，單片菌蓋厚度約0.5-1.5cm，菌蓋覆瓦狀排列。子實體正面呈現(xiàn)淡黃色至橙色，邊緣顏色較深，呈現(xiàn)波浪狀或瓣狀，較圓滑，子實體背面呈現(xiàn)白色，邊緣黃色，布滿菌孔。菌絲系統(tǒng)二體型，具有生殖菌絲和骨架菌絲。生殖菌絲具有擔(dān)子菌菌絲的顯著特點，即鎖狀聯(lián)合。同時該菌生殖菌絲還具有簡單隔膜，但是簡單隔膜的數(shù)量較少，且往往出現(xiàn)于菌絲的前端。生殖菌絲的直徑從2-3μm到5-7μm不等。

對本發(fā)明所述產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的滴孔菌a-9cgmccn0.13895測定18srrna以及its的基因序列的結(jié)果顯示，其18srdna序列長度為1679bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示；其its序列片段大小為727bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示。通過形態(tài)觀察和18srrna以及its的基因序列比對，初步鑒定為piptoporussp.。

本發(fā)明所述產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的滴孔菌a-9菌種選育的基本方法是：

菌種系采自于野外的擔(dān)子菌子實體。將新鮮的子實體以無菌手術(shù)刀切開，用眼科鑷子撕取少許菌肉接種于pda平板，30℃培養(yǎng)。待菌絲墊直徑達2-3厘米時，從菌絲邊緣挑取少許菌絲接種于新的pda平板，經(jīng)反復(fù)多次轉(zhuǎn)接，直至分離得到純菌種。將該菌株命名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9，該菌株已于2017年5月25日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為cgmccn0.13895。

本發(fā)明所述的產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的滴孔菌(piptoporussp.)a-9在制備γ-癸內(nèi)酯中的應(yīng)用。

其中，所述應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下：

(1)菌種選擇：選用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895；

(2)斜面培養(yǎng)活化：將菌種接種于斜面培養(yǎng)基，27～33℃條件下，靜止培養(yǎng)96～102小時，備用；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于90～100ml液體種子培養(yǎng)基中，置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為160～180轉(zhuǎn)/分鐘、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm的搖床上，27～33℃培養(yǎng)72～96小時，得種子液；

(4)以γ-癸內(nèi)酯為目的產(chǎn)物發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶發(fā)酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種于裝有80～100ml(500ml三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，27～33℃，轉(zhuǎn)速為150～180轉(zhuǎn)/分鐘，ph為5.0±0.5，搖瓶發(fā)酵144～168小時，即獲得含γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵產(chǎn)物；

或者，5l發(fā)酵罐發(fā)酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種于罐裝有3.3～3.5l發(fā)酵培養(yǎng)基的5l發(fā)酵罐中，27～33℃進行通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，其中攪拌轉(zhuǎn)速為200～300r/min，通氣量8l/min，罐內(nèi)壓力1.0±0.02mpa，發(fā)酵時間為144～168小時，發(fā)酵液初始ph值為5.0～6.0，發(fā)酵過程中定時取樣測定發(fā)酵液中的菌體干重和γ-癸內(nèi)酯的濃度，當(dāng)發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯濃度不再上升時，結(jié)束發(fā)酵，即獲得含γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵產(chǎn)物；

其中：上述斜面培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然；固體培養(yǎng)基加1.5％瓊脂粉，即pda；

上述液體種子培養(yǎng)基組成：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然；

上述以γ-癸內(nèi)酯為目的產(chǎn)物發(fā)酵培養(yǎng)基的組成是：可溶性淀粉10～40g/l，豆粕粉10～40g/l，蓖麻油100g，吐溫-20體積比0.05％，七水合硫酸鎂0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，十二水合磷酸氫二鈉1.2g/l；去離子水1l，ph5±0.5，滅菌117℃，30min。

上述的應(yīng)用中，步驟(2)、(3)、(4)所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選30℃。

上述的應(yīng)用中，步驟(2)所述培養(yǎng)時間優(yōu)選100小時。

上述的應(yīng)用中，步驟(3)所述培養(yǎng)時間優(yōu)選80小時。

上述的應(yīng)用中，步驟(4)所述培養(yǎng)時間優(yōu)選150～160小時。

上述的應(yīng)用中，步驟(4)所述發(fā)酵培養(yǎng)基初始可溶性淀粉濃度優(yōu)選20g/l～30g/l。

上述的應(yīng)用中，步驟(4)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph優(yōu)選為5.0。

上述γ-癸內(nèi)酯按下述方法測定：

氣相色譜檢測：標(biāo)準(zhǔn)樣品制備：取6.33μlγ-癸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)樣品加入到3ml色譜純乙酸丁酯中，即得到濃度為2g/l的γ-癸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)樣品，以此樣品稀釋得到濃度分別為1g/l，0.5g/l，0.25g/l，0.1g/l的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

gc分析條件：

進樣口spl1：溫度250℃，壓力：23mpa，控制方式線速度，線速度10.3cm/min，總流量12.5ml/min，柱流量0.5ml/min，吹掃流量2ml/min，分流比20:1，進樣體積1μl。

柱溫：起始溫度100℃，以8℃/min升至250℃，250℃保持20min。

檢測器：氫火焰離子檢測器fid，檢測器溫度275℃，氫氣流量40ml/min，空氣流量400ml/min，尾吹流量3ml/min。

載氣：高純氮氣

取樣時取1ml培養(yǎng)物于5ml離心管中，加入1ml分析純乙酸丁酯，充分振蕩混勻，離心12000rpm，10min，取上層有機相0.8ml于1.5ml離心管中，離心12000rpm，10min，離心完畢以無菌注射器取適量以0.22μm有機系濾器過濾，進行氣相色譜檢測。

本發(fā)明公開了一株產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的滴孔菌(piptoporussp.)a-9，作為自主采摘分離鑒定的新菌株，發(fā)明人未檢索到有關(guān)利用滴孔菌a-9以生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯為目的產(chǎn)物的文獻報道，也未檢索到滴孔菌屬其他菌種產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯或與cgmccn0.13895菌株有相當(dāng)?shù)母弋a(chǎn)率的文獻報道。實驗證實利用本發(fā)明所述滴孔菌cgmccn0.13895可發(fā)酵轉(zhuǎn)化蓖麻油直接生成并獲得目的產(chǎn)物γ-癸內(nèi)酯，蓖麻油轉(zhuǎn)化生成γ-癸內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化率高，菌種發(fā)酵性能穩(wěn)定，是一株極具研究開發(fā)價值的γ-癸內(nèi)酯生產(chǎn)菌株。其為液體發(fā)酵生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯探索了新的方向與途徑，為將來進行發(fā)酵生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

本發(fā)明采用生物發(fā)酵的方法，以可溶性淀粉、蔗糖、豆粕粉等為原料生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯具有生產(chǎn)方法簡單，條件溫和，原料來源豐富，生產(chǎn)成本低等特點，發(fā)酵生產(chǎn)的γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)率最高可達6.5g/l以上，具有較高的應(yīng)用價值，極具工業(yè)化應(yīng)用前景。

具體實施方式

實施例1產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的滴孔菌菌株分離純化

菌種系采自于野外的擔(dān)子菌子實體。將新鮮的子實體以無菌手術(shù)刀切開，用眼科鑷子撕取少許菌肉接種于pda平板，30℃培養(yǎng)。待菌絲墊直徑達2-3厘米時，從菌絲邊緣挑取少許菌絲接種于新的pda平板，經(jīng)反復(fù)多次轉(zhuǎn)接，直至分離得到純菌種。將目的菌株再經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩和進一步分離篩選，得到一株性能穩(wěn)定的γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)生菌，該菌株命名為滴孔菌(piptoporussp.)a-9。

上述菌株滴孔菌a-9已于2017年5月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101，其保藏編號為cgmccn0.13895。

上述液體種子培養(yǎng)基組成(g/l)：鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然。

上述斜面培養(yǎng)基組成為(g/l)：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然。固體培養(yǎng)基加1.5％瓊脂粉，即pda。

上述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)：可溶性淀粉10～40g/l，豆粕粉10～40g/l，蓖麻油100g，吐溫-200.05％(體積比)，硫酸鎂(七水合)0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，磷酸氫二鈉(十二水合)1.2g/l。去離子水1l，ph5，滅菌117℃，30min。

實施例2滴孔菌a-9cgmccn0.13895菌株18srdna及its序列測序

將實施例1分離純化得到的產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯菌株即cgmccno.1869菌株委托博尚生物公司進行18srdna測序。

實驗方法是：挑取斜面培養(yǎng)物，提取基因組作為模板，分別以通用引物ns1，ns8擴增18srrna基因，片段大小約為1.8kb，以通用引物its1，its4擴增its序列，片段大小約為750bp。

取5μl進行瓊脂糖凝膠電泳，使用takaraagarosegeldnapurificationkitver.2.0(codeno.dv805a)切膠回收目的片斷，對上述回收產(chǎn)物進行dna測序。

測序結(jié)果：

cgmccn0.13895菌株18srdna序列長度為1679bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示；cgmccn0.13895菌株its序列片段大小為727bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示。所用引物如表1所示。

表1所用引物列表

實施例3滴孔菌a-9cgmccn0.13895在搖瓶培養(yǎng)制備γ-癸內(nèi)酯中的應(yīng)用

應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下：

(1)菌種選擇：選用滴孔菌(piptoporussp.)a-9cgmccn0.13895；

(2)斜面培養(yǎng)活化：將菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30℃條件下，靜止培養(yǎng)100小時，備用；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于90～100ml(500ml三角瓶)液體種子培養(yǎng)基中，置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm的搖床上，30℃培養(yǎng)80小時，得種子液；

(4)搖瓶發(fā)酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種于裝有90～100ml(500ml三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，30～35℃，轉(zhuǎn)速為150～180轉(zhuǎn)/分鐘，搖瓶發(fā)酵150小時，即獲得含γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵產(chǎn)物；

上述斜面培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然。固體培養(yǎng)基加1.5％瓊脂粉，即pda；

上述液體種子培養(yǎng)基組成：馬鈴薯180～220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然；

上述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：可溶性淀粉20g/l，豆粕粉30g/l，蓖麻油100g，吐溫-20體積比0.05％，硫酸鎂(七水合)0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，磷酸氫二鈉(十二水合)1.2g/l，去離子水1l；ph5，滅菌117℃，30min。

(5)產(chǎn)物檢測：取樣時取1ml培養(yǎng)物于5ml離心管中，加入1ml分析純乙酸丁酯，充分振蕩混勻，離心12000rpm，10min，取上層有機相0.8ml于1.5ml離心管中，離心12000rpm，10min，離心完畢以無菌注射器取適量以0.22μm有機系濾器過濾，進行氣相色譜檢測；

經(jīng)檢測發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量為3.6g/l。

實施例4滴孔菌a-9cgmccn0.13895在發(fā)酵罐培養(yǎng)制備γ-癸內(nèi)酯中的應(yīng)用

應(yīng)用方法涉及的步驟順序如下：

(1)菌種選擇：選用滴孔菌a-9(piptoporussp.)cgmccn0.13895；

(2)斜面培養(yǎng)活化：將菌種接種于斜面培養(yǎng)基，35℃條件下，靜止培養(yǎng)102小時，備用；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于90～100ml(500ml三角瓶)液體種子培養(yǎng)基中，置旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘、旋轉(zhuǎn)半徑為40mm的搖床上，30～35℃培養(yǎng)80小時，得種子液；

(4)發(fā)酵培養(yǎng)：

5l發(fā)酵罐發(fā)酵：以8～10％的體積比的接種量，將種子液接種于罐裝有3.5l發(fā)酵培養(yǎng)基的5l發(fā)酵罐中，30℃進行通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，其中攪拌轉(zhuǎn)速為250r/min，通氣量以發(fā)酵液體8l/min，罐內(nèi)壓力0.08mpa；發(fā)酵液初始ph值為5.0～5.5，發(fā)酵過程中定時取樣測定發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的濃度，發(fā)酵時間為144小時，結(jié)束發(fā)酵，即獲得含γ-癸內(nèi)酯的發(fā)酵產(chǎn)物；

上述斜面培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然，固體培養(yǎng)基加1.5％瓊脂粉，即pda；

上述液體種子培養(yǎng)基組成：馬鈴薯220g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，去離子水1l，將馬鈴薯去皮后切成小塊，在水中煮沸30min，以8層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖，補足水至1l，ph自然；

上述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：可溶性淀粉40g/l，豆粕粉40g/l，蓖麻油100g，吐溫-20體積比0.05％，硫酸鎂(七水合)0.5g/l，磷酸二氫鉀0.46g/l，磷酸氫二鈉(十二水合)1.2g/l。去離子水1l，ph5，滅菌117℃，30min。

(5)產(chǎn)物檢測：取樣時取1ml培養(yǎng)物于5ml離心管中，加入1ml分析純乙酸丁酯，充分振蕩混勻，離心12000rpm，10min，取上層有機相0.8ml于1.5ml離心管中，離心12000rpm，10min，離心完畢以無菌注射器取適量以0.22μm有機系濾器過濾，進行氣相色譜檢測；

經(jīng)檢測發(fā)酵液中γ-癸內(nèi)酯的含量為6.8g/l。

上述實施例所述γ-癸內(nèi)酯按下述方法測定：

氣相色譜檢測：標(biāo)準(zhǔn)樣品制備：取6.33μlγ-癸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)樣品加入到3ml色譜純乙酸丁酯中，即得到濃度為2g/l的γ-癸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)樣品，以此樣品稀釋得到濃度分別為1g/l，0.5g/l，0.25g/l，0.1g/l的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

gc分析條件：

進樣口spl1：溫度250℃，壓力：23mpa，控制方式線速度，線速度10.3cm/min，總流量12.5ml/min，柱流量0.5ml/min，吹掃流量2ml/min，分流比20:1，進樣體積1μl。

柱溫：起始溫度100℃，以8℃/min升至250℃，250℃保持20min。

檢測器：氫火焰離子檢測器fid，檢測器溫度275℃，氫氣流量40ml/min，空氣流量400ml/min，尾吹流量3ml/min。

載氣：高純氮氣

取樣時取1ml培養(yǎng)物于5ml離心管中，加入1ml分析純乙酸丁酯，充分振蕩混勻，離心12000rpm，10min，取上層有機相0.8ml于1.5ml離心管中，離心12000rpm，10min，離心完畢以無菌注射器取適量以0.22μm有機系濾器過濾，進行氣相色譜檢測。

序列表

<110>山東大學(xué)

<120>一株產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的滴孔菌及其應(yīng)用

<141>2017-06-14

<160>2

<210>1

<211>1679

<212>rdna

<213>滴孔菌(piptoporussp.)a-9

<221>滴孔菌菌株cgmccn0.13895的18srdna序列

<222>（1）…（1679）

<400>1

cagtttgtactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatagtttatttgatggta60

ccttgctacatggataactgtggtaattctagagctaatacatgcaatcaaagccccgac120

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