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一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法與流程

文檔序號(hào):11570453閱讀:518來(lái)源:國(guó)知局

本發(fā)明涉及一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法,屬于膠原蛋白制備技術(shù)領(lǐng)域。



背景技術(shù):

近年來(lái),由于膠原蛋白越來(lái)越多地用于醫(yī)藥、食品、高檔化妝品、生物肥料等工業(yè)領(lǐng)域,造成市場(chǎng)供不應(yīng)求。目前,工業(yè)膠原蛋白主要來(lái)源于牛、豬等陸產(chǎn)動(dòng)物。由于畜產(chǎn)動(dòng)物中重大疾病的頻繁發(fā)生,如牛的海綿狀腦病(瘋牛病);豬的口蹄疫等,使用戶對(duì)膠原蛋白的安全性產(chǎn)生懷疑。

實(shí)際上,水產(chǎn)動(dòng)物的皮、骨、鰭等含豐富的膠原蛋白,而且是安全的膠原蛋白的來(lái)源。從水產(chǎn)動(dòng)物中提取膠原蛋白并對(duì)其進(jìn)行深入研究在國(guó)外已相當(dāng)普遍。中華鱉(pelodiscussinensiswiegmann)是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴水產(chǎn)品,俗稱甲魚(yú)、團(tuán)魚(yú)、水魚(yú)、王八、神守等。鱉類(lèi)的生理活性物質(zhì)及其抗癌藥品、保健食品的開(kāi)發(fā)是研究的熱點(diǎn)。據(jù)世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì),我國(guó)2013年中華鱉產(chǎn)量347587t,按比例計(jì)算大約有43000t的殼、骨下腳料。有關(guān)中華鱉裙邊膠原蛋白的研究已有報(bào)道,但關(guān)于含鈣組織如中華鱉殼、骨中膠原蛋白的研究報(bào)道極少。如果這些下腳料能得到有效利用,將會(huì)為企業(yè)帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是克服上述不足之處,提供一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案,一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法,步驟如下:

(1)清洗:取中華鱉殼,徹底清除附著的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用;

(2)脫鹽:中華鱉殼充分剁碎后,按照料液比1:6~8g/ml加入0.3~0.7mol/l的鹽酸溶液,溫度10~20℃;靜置放置,每隔1~3h換液1次;換液3~5次后,用水清洗至洗出液呈中性,收集得到脫鹽中華鱉殼,冷凍干燥24~48h備用;

(3)堿液浸泡:用步驟(2)所得脫鹽中華鱉殼質(zhì)量15~25倍的0.05~0.15mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡3~5h;

(4)醇浸泡:取步驟(3)所得中華鱉殼用蒸餾水反復(fù)洗滌,充分瀝干后加入中華鱉殼質(zhì)量計(jì)15~25倍的質(zhì)量濃度為10%的異丙醇溶液,于20~25℃下浸泡12~24h,以去除脂肪;

(5)超聲酶提:步驟(4)所得中華鱉殼經(jīng)蒸餾水反復(fù)洗滌,瀝干后再加入以中華鱉殼質(zhì)量計(jì)15~25倍的0.3~0.7mol/l的乙酸溶液,在超聲波100~200w下預(yù)處理4~8min,然后添加100~200u/g的胃蛋白酶,并在37℃下磁力攪拌3~5h,以未進(jìn)行超聲處理的酶提膠原蛋白進(jìn)行對(duì)照;

(6)后處理:在0~8℃下,以8000~12000×g離心25~35min后得上清液即為粗膠原蛋白;

(7)重復(fù)鹽析:取步驟(6)所得粗膠原蛋白加入nacl至溶液終濃度為0.8~1.0mol/l,同時(shí)析出絮狀沉淀,于4℃,5000~10000×g離心10~20min得沉淀物,用0.5mol/l冰醋酸重新溶解,重復(fù)鹽析一次,5000~10000×g離心10~20min得沉淀物即為鹽析后的膠原蛋白;

(8)透析:對(duì)步驟(7)所得膠原蛋白用0.3~0.7mol/l乙酸溶解,在0.05~0.15mol/l乙酸中透析24~48h,每6~10h更換一次透析液,冷凍干燥后置-40℃冰箱中待用,即得產(chǎn)品高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白。

本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明采用的超聲輔助酶提工藝操作簡(jiǎn)單,既能有效縮短提取時(shí)間,又能獲得具有良好熱穩(wěn)定性能的膠原蛋白,而且對(duì)環(huán)境的污染也較小。此外,還可充分有效開(kāi)發(fā)和利用中華鱉副產(chǎn)物,避免資源的浪費(fèi),提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說(shuō)明

圖1是常規(guī)酶提和超聲輔助酶提膠原蛋白的分?jǐn)?shù)粘度變化趨勢(shì)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法,步驟如下:

(1)清洗:取中華鱉殼,徹底清除附著的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用;

(2)脫鹽:中華鱉殼充分剁碎后,按照料液比1:6g/ml加入0.3mol/l的鹽酸溶液,溫度10℃;靜置放置,每隔1h換液1次;換液5次后,用水清洗至洗出液呈中性,收集得到脫鹽中華鱉殼,冷凍干燥24h備用;

(3)堿液浸泡:用步驟(2)所得脫鹽中華鱉殼質(zhì)量15倍的0.15mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡3h;

(4)醇浸泡:取步驟(3)所得中華鱉殼用蒸餾水反復(fù)洗滌,充分瀝干后加入中華鱉殼質(zhì)量計(jì)15倍的質(zhì)量濃度為10%的異丙醇溶液,于20℃下浸泡24h,以去除脂肪;

(5)超聲酶提:步驟(4)所得中華鱉殼經(jīng)蒸餾水反復(fù)洗滌,瀝干后再加入以中華鱉殼質(zhì)量計(jì)15倍的0.7mol/l的乙酸溶液,在超聲波100w下預(yù)處理4min,然后添加200u/g的胃蛋白酶,并在37℃下磁力攪拌3h,以未進(jìn)行超聲處理的酶提膠原蛋白進(jìn)行對(duì)照;

(6)后處理:在0℃下,以8000×g離心35min后得上清液即為粗膠原蛋白;

(7)重復(fù)鹽析:取步驟(6)所得粗膠原蛋白加入nacl至溶液終濃度為0.8mol/l,同時(shí)析出絮狀沉淀,于4℃,10000×g離心10min得沉淀物,用0.5mol/l冰醋酸重新溶解,重復(fù)鹽析一次,5000×g離心20min得沉淀物即為鹽析后的膠原蛋白;

(8)透析:對(duì)步驟(7)所得膠原蛋白用0.3mol/l乙酸溶解,在0.15mol/l乙酸中透析24h,每10h更換一次透析液,冷凍干燥后置-40℃冰箱中待用,即得產(chǎn)品高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白。

實(shí)施例2

一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法,其特征是步驟如下:

(1)清洗:取中華鱉殼,徹底清除附著的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用;

(2)脫鹽:中華鱉殼充分剁碎后,按照料液比1:8g/ml加入0.3mol/l的鹽酸溶液,溫度20℃;靜置放置,每隔1h換液1次;換液3次后,用水清洗至洗出液呈中性,收集得到脫鹽中華鱉殼,冷凍干燥24h備用;

(3)堿液浸泡:用步驟(2)所得脫鹽中華鱉殼質(zhì)量25倍的0.05mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡3h;

(4)醇浸泡:取步驟(3)所得中華鱉殼用蒸餾水反復(fù)洗滌,充分瀝干后加入中華鱉殼質(zhì)量計(jì)25倍的質(zhì)量濃度為10%的異丙醇溶液,于20℃下浸泡12h,以去除脂肪;

(5)超聲酶提:步驟(4)所得中華鱉殼經(jīng)蒸餾水反復(fù)洗滌,瀝干后再加入以中華鱉殼質(zhì)量計(jì)25倍的0.3mol/l的乙酸溶液,在超聲波100w下預(yù)處理8min,然后添加200u/g的胃蛋白酶,并在37℃下磁力攪拌3h,以未進(jìn)行超聲處理的酶提膠原蛋白進(jìn)行對(duì)照;

(6)后處理:在8℃下,以8000×g離心25min后得上清液即為粗膠原蛋白;

(7)重復(fù)鹽析:取步驟(6)所得粗膠原蛋白加入nacl至溶液終濃度為1.0mol/l,同時(shí)析出絮狀沉淀,于4℃,10000×g離心10min得沉淀物,用0.5mol/l冰醋酸重新溶解,重復(fù)鹽析一次,10000×g離心20min得沉淀物即為鹽析后的膠原蛋白;

(8)透析:對(duì)步驟(7)所得膠原蛋白用0.7mol/l乙酸溶解,在0.05mol/l乙酸中透析48h,每10h更換一次透析液,冷凍干燥后置-40℃冰箱中待用,即得產(chǎn)品高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白。

實(shí)施例3

一種高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白的制備方法,其特征是步驟如下:

(1)清洗:取中華鱉殼,徹底清除附著的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用;

(2)脫鹽:中華鱉殼充分剁碎后,按照料液比1:7g/ml加入0.5mol/l的鹽酸溶液,溫度15℃;靜置放置,每隔2h換液1次;換液4次后,用水清洗至洗出液呈中性,收集得到脫鹽中華鱉殼,冷凍干燥34h備用;

(3)堿液浸泡:用步驟(2)所得脫鹽中華鱉殼質(zhì)量20倍的0.1mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡4h;

(4)醇浸泡:取步驟(3)所得中華鱉殼用蒸餾水反復(fù)洗滌,充分瀝干后加入中華鱉殼質(zhì)量計(jì)20倍的質(zhì)量濃度為10%的異丙醇溶液,于23℃下浸泡20h,以去除脂肪;

(5)超聲酶提:步驟(4)所得中華鱉殼經(jīng)蒸餾水反復(fù)洗滌,瀝干后再加入以中華鱉殼質(zhì)量計(jì)20倍的0.5mol/l的乙酸溶液,在超聲波150w下預(yù)處理6min,然后添加150u/g的胃蛋白酶,并在37℃下磁力攪拌4h,以未進(jìn)行超聲處理的酶提膠原蛋白進(jìn)行對(duì)照;

(6)后處理:在4℃下,以10000×g離心30min后得上清液即為粗膠原蛋白;

(7)重復(fù)鹽析:取步驟(6)所得粗膠原蛋白加入nacl至溶液終濃度為0.9mol/l,同時(shí)析出絮狀沉淀,于4℃,8000×g離心15min得沉淀物,用0.5mol/l冰醋酸重新溶解,重復(fù)鹽析一次,8000×g離心15min得沉淀物即為鹽析后的膠原蛋白;

(8)透析:對(duì)步驟(7)所得膠原蛋白用0.5mol/l乙酸溶解,在0.1mol/l乙酸中透析36h,每8h更換一次透析液,冷凍干燥后置-40℃冰箱中待用,即得產(chǎn)品高熱穩(wěn)定性中華鱉副產(chǎn)物膠原蛋白。

應(yīng)用實(shí)施例1熱變性溫度(td)的測(cè)定

通過(guò)測(cè)定膠原蛋白溶液分?jǐn)?shù)粘度的變化來(lái)確定其熱變性溫度。取一定量的膠原蛋白樣品溶于0.1mol/l的乙酸中的配制成0.1%(m/v)濃度的溶液,將膠原蛋白溶液置于ostwald粘度計(jì)中,再將粘度計(jì)浸入15℃的水浴中后,保持30min,使得膠原溶液達(dá)到15℃。然后將溫度從15℃逐步升高至50℃,用ostwald粘度計(jì)測(cè)定膠原蛋白溶液在15-50℃(間隔5℃)區(qū)間內(nèi)的粘度,各溫度保持恒溫30min,并進(jìn)行8次實(shí)驗(yàn),取平均值。然后,利用公式計(jì)算每個(gè)溫度的分?jǐn)?shù)粘度。繪制分?jǐn)?shù)粘度-溫度曲線,td值為該曲線線性部分的中點(diǎn)。

式中:t為任意時(shí)間的溫度,℃;t0為0min時(shí)的溫度,℃。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示,常規(guī)酶提中華鱉殼膠原蛋白的熱變性溫度大約為35.3℃,而超聲輔助酶提中華鱉殼得到的膠原蛋白的熱變性溫度為38.5℃左右。水生動(dòng)物由于其生活的環(huán)境,一般情況下的熱變形溫度均比陸生哺乳動(dòng)物低7~12℃,以上試驗(yàn)方法得到的膠原蛋白的熱變形溫度已接近陸生哺乳動(dòng)物,因此,超聲輔助酶提所得的膠原蛋白熱穩(wěn)定性較好,可在生物材料、制藥等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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