本發(fā)明屬于環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用改進(jìn)的疊皿平板法篩選分離硫酸鹽還原菌的方法。
背景技術(shù)：
目前，運(yùn)用生物工程等高科技生物技術(shù)，培育能夠用于固定重金屬的植物和土壤微生物超級(jí)工程菌，并運(yùn)用于土壤污染治理是目前環(huán)境科學(xué)、環(huán)境工程學(xué)、植物生理學(xué)、微生物學(xué)等研究中最活躍的前沿領(lǐng)域之一。微生物能通過氧化還原、甲基化和去甲基化作用轉(zhuǎn)化重金屬，將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化成動(dòng)植物不可利用的形態(tài)。
硫酸鹽還原菌(sulfate-reducingbacterium，簡(jiǎn)稱srb下同)是自然界中能把硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等硫氧化物以及元素硫還原形成硫離子，由于重金屬硫化物的溶度積普遍較小，硫離子能夠立即與微量重金屬離子結(jié)合生成生物不能利用的形態(tài)，因此硫酸鹽還原菌可以用作處理固定環(huán)境中的重金屬離子。srb菌在工業(yè)管道的腐蝕、受重金屬污染的廢水及酸性礦山廢水的環(huán)境修復(fù)中都扮演著重要角色。
srb為嚴(yán)格的厭氧菌，但隨著研究的深入，已有研究結(jié)果表明srb并非嚴(yán)格意義上的絕對(duì)厭氧而是兼性厭氧，但總體上來說srb對(duì)氧還是極其敏感的，因此對(duì)其培養(yǎng)與分離關(guān)鍵要采用嚴(yán)格的厭氧技術(shù)。srb可選用的培養(yǎng)方法有很多，例如疊皿夾層法、稀釋搖管法、hungate滾管技術(shù)，還可以利用厭氧袋、厭氧罐、厭氧手套箱等。稀釋搖管法的不足之處是觀察與挑取菌落比較困難，hungate滾管法以及利用厭氧設(shè)備的方法則受到技術(shù)方法和設(shè)備材料成本的制約，而疊皿夾層法實(shí)質(zhì)是將菌夾在上下兩層培養(yǎng)基之間，使其造成一個(gè)相對(duì)無氧的環(huán)境，從而使srb能在夾縫中生長(zhǎng)。疊皿夾層法的優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)物均采用涂布生長(zhǎng)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂夾層中，取菌落時(shí)可很方便地做到定點(diǎn)取菌，同時(shí)該方法不需要另外創(chuàng)建一個(gè)無氧環(huán)境，省時(shí)、省力，容易實(shí)現(xiàn)的同時(shí)具備了所有好氧、厭氧分離方法的優(yōu)點(diǎn)。
然而傳統(tǒng)的疊皿夾層法分離菌一般不能均勻地涂布滲透在第一層平板上，且菌液經(jīng)過稀釋后氧化還原電位會(huì)隨著稀釋倍數(shù)的增大而升高，對(duì)于硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)很不利。此外在第二層瓊脂層的倒入過程中稀釋液會(huì)隨著擴(kuò)散入第二層中，從而出現(xiàn)菌落上下重疊甚至出現(xiàn)雜菌生長(zhǎng)的第二層表面的現(xiàn)象，不易獲得單菌落，給分離和篩選菌落帶來一定的難度。為了繼承傳統(tǒng)厭氧培養(yǎng)分離法的優(yōu)點(diǎn)，克服其缺點(diǎn)，本發(fā)明根據(jù)科研實(shí)際需要對(duì)硫酸鹽還原菌(srb)的稀釋涂布-疊皿夾層法分離培養(yǎng)方法進(jìn)行了改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有硫酸鹽還原菌篩選技術(shù)存在的上述問題，提供一種從土壤中富集并利用改進(jìn)后的疊皿平板法篩選、分離、純化出有較高重金屬離子耐受性的硫酸鹽還原菌的方法。該方法操作更加簡(jiǎn)便，提高了篩選分離的效率，縮短了篩選分離周期。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
一種利用改進(jìn)的疊皿平板法篩選分離硫酸鹽還原菌的方法，包括以下步驟：(a)將預(yù)處理后的土壤加入到硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，所得富集液接種至新的硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)基中再次進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)多次后得到富集菌液；(b)將富集菌液稀釋成不同濃度，向其中加入l-半胱氨酸、抗壞血酸和硫酸亞鐵銨備用，將篩選培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待其冷凝后分別將不同濃度的稀釋液涂布在平板上，待稀釋液滲透后先后兩次倒入篩選培養(yǎng)基，冷凝后依次形成第二層、第三層，將培養(yǎng)皿密閉后恒溫培養(yǎng)；(c)將滅菌后的篩選培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中冷凝備用，挑取步驟(b)第二層菌株生長(zhǎng)層中生長(zhǎng)明顯的黑色單菌，在新配制的平板上劃線分離，再將篩選培養(yǎng)基倒入劃線分離后的平板上，密封后反復(fù)多次分離培養(yǎng)；(d)將劃線分離得到的單菌落接種到保存培養(yǎng)基內(nèi)，恒溫培養(yǎng)即得。
按照上述方案，所述硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)基的成分包括：0.4-0.6g/的k2hpo4，1-2g/l的mgso4·7h2o，0.4-0.6g/l的na2so4，0.1-0.2g/l的cacl2，1-2g/l的nacl，0.8-1.0g/l的nh4cl，1.0-2.0g/l的酵母膏，配制好后在121℃下滅菌20min，調(diào)節(jié)ph至8.0-8.5。
按照上述方案，所述篩選培養(yǎng)基的成分包括：0.4-0.6g/l的k2hpo4,0.1-0.2g/l的cacl2，0.8-1.0g/l的nh4cl，1-2g/l的mgso4·7h2o，1-2g/l的nacl，0.4-0.6g/l的na2so4,2.0-3.0g/l的c3h5o3na,0.5-0.6g/l的l-半胱氨酸，0.5-0.6g/l的抗壞血酸，0.5-0.6g/l的fe(nh4)2(so)2以及2wt％的瓊脂，配制時(shí)先將其他原料混合并在121℃下滅菌20min，接著降溫至55℃后加入l-半胱氨酸、抗壞血酸、fe(nh4)2(so4)2，調(diào)節(jié)ph至8.0-8.5。
按照上述方案，所述保存培養(yǎng)基的成分包括：0.5-0.7g/l的k2hpo4,0.1-0.2g/l的cacl2，1-1.2g/l的nh4cl，1-2g/l的mgso4·7h2o，2-3g/l的nacl，0.4-0.6g/l的na2so4,3.0-4.0g/l的c3h5o3na,0.5-0.6g/l的l-半胱氨酸，0.5-0.6g/l的抗壞血酸，配制時(shí)先將其他原料混合并在121℃下滅菌20min，接著降溫至55℃后加入l-半胱氨酸、抗壞血酸，調(diào)節(jié)ph至8.0-8.5。
按照上述方案，步驟(a)中首先用篩網(wǎng)對(duì)土壤樣品進(jìn)行篩選預(yù)處理，接著按照1g：200-220ml的比例將土壤加入到滅菌后的硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)基中，在其表面覆蓋一層液體石蠟并充氮?dú)猓湃?0℃的恒溫?fù)u床中以100-120r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。
按照上述方案，步驟(a)中初次富集時(shí)間為7d，之后以5‰的接種量在新的硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2-3次，每次時(shí)長(zhǎng)4d。
按照上述方案，步驟(b)中將富集菌液稀釋成10-4、10-5、10-6三個(gè)濃度，接著向稀釋液中加入0.5wt％的l-半胱氨酸和0.5wt％的抗壞血酸以及0.5％的硫酸亞鐵銨。
按照上述方案，步驟(b)中向若干培養(yǎng)皿中倒入約1/2高度的55℃篩選培養(yǎng)基，冷凝后吸取0.2-0.3ml不同濃度的稀釋液快速涂布在各平板上，待稀釋液滲透一段時(shí)間后向培養(yǎng)皿中倒入1/3高度的同種篩選培養(yǎng)基形成第二層菌株生長(zhǎng)層，再倒入同種培養(yǎng)基至將溢未溢的形態(tài)形成第三層瓊脂層，蓋上培養(yǎng)皿蓋密封后置于30℃恒溫培養(yǎng)2-3d，直至出現(xiàn)明顯的黑色菌落。
按照上述方案，步驟(c)中劃線分離培養(yǎng)溫度為30℃，每次劃線分離培養(yǎng)3-4d，分離2-3次。
按照上述方案，步驟(d)中采用針刺法將劃線分離得到的單菌落接種到保存培養(yǎng)基內(nèi)，于30℃恒溫培養(yǎng)，直至出現(xiàn)明顯絲狀菌落后置于低溫環(huán)境冷藏。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
1)本發(fā)明能夠?qū)⑼坎荚谄桨迳系木汉芎玫木鶆蚍稚⒃诘诙颖∑桨鍖又?，解決了傳統(tǒng)疊皿平板法倒入第二層瓊脂層時(shí)易將涂布在第一層的菌液混入到之后倒入的第二層瓊脂層中從而出現(xiàn)菌落上下重疊，甚至在第二層瓊脂層表面出現(xiàn)雜菌生長(zhǎng)的現(xiàn)象；
2)本發(fā)明提供的疊皿夾層法相比別的改進(jìn)方法，操作更加簡(jiǎn)便，同時(shí)因有上下兩層瓊脂層無縫隙無氣泡夾住中間菌株生長(zhǎng)層，從而給硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)提供了更好的厭氧環(huán)境；
3)與目前的疊皿夾層法硫酸鹽還原菌篩選分離方法相比，本發(fā)明改進(jìn)后較傳統(tǒng)法在相同濃度梯度涂布下能夠多篩選出50％數(shù)量的硫酸鹽還原菌單菌落，提高了篩選分離的效率；
4)本發(fā)明因在稀釋涂布液中加入0.5wt％的l-半胱氨酸和0.5wt％的抗壞血酸以及0.5wt％的硫酸亞鐵銨，使得篩選分離得到的硫酸鹽還原菌較傳統(tǒng)法硫酸鹽還原菌的篩選分離周期中縮短了2～3d。
具體實(shí)施方式
為使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員充分理解本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1
第一步：硫酸鹽還原菌的富集
首先將取樣的土壤用篩網(wǎng)除去大顆粒石塊和植物根莖等備用。在燒杯中配制好硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)基，向錐形瓶中倒入200-220ml硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)液，在高溫滅菌鍋中于121℃下滅菌20min。待其冷卻降溫后，稱取1g處理過后的土壤加入到冷卻至常溫的錐形瓶中，并在錐形瓶培養(yǎng)液表層覆蓋一層液體石蠟，同時(shí)充入氮?dú)夥饪诒３謪捬醐h(huán)境，將錐形瓶放入30℃恒溫?fù)u床中在100～120r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)。初次富集時(shí)間為7d，待到富集液顏色至墨汁色即表示富集成功，隨后以5‰的接種量在新的硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2-3次，每次時(shí)長(zhǎng)4d。
其中，硫酸鹽還原菌液體富集培養(yǎng)基包括以下組分：0.4-0.6g/的k2hpo4，1-2g/l的mgso4·7h2o，0.4-0.6g/l的na2so4，0.1-0.2g/l的cacl2，1-2g/l的nacl，0.8-1.0g/l的nh4cl，1.0-2.0g/l的酵母膏，配制好后在121℃下滅菌20min，調(diào)節(jié)ph至8.0-8.5。
第二步：菌株的稀釋涂布-疊皿夾層法篩選
上述富集馴化2～3次的菌液經(jīng)紫外線照射15min以上，在無菌操作臺(tái)上用移液槍將菌液稀釋成10-4、10-5、10-6三個(gè)濃度梯度，并向稀釋液中加入0.5wt％的l-半胱氨酸、0.5wt％的抗壞血酸以及0.5wt％的硫酸亞鐵銨。接著將篩選培養(yǎng)基高溫滅菌后保持在55℃左右，向若干培養(yǎng)皿的皿底中倒入約1/2高度，待其冷凝備用。吸取0.2～0.3ml10-4、10-5、10-6濃度梯度的稀釋液，分別快速涂布在冷凝后的若干平板上。待稀釋液在平板上滲透約10min后，在培養(yǎng)皿底的中間位置緩慢倒入同種篩選培養(yǎng)基至1/3高度，將菌液固定在其中形成的第二層菌株生長(zhǎng)層，再倒入同種的篩選培養(yǎng)基至將溢未溢的形態(tài)形成第三層瓊脂層。迅速蓋上培養(yǎng)皿蓋盡量不要留有氣泡，去掉培養(yǎng)皿內(nèi)外兩層側(cè)壁間多余的瓊脂，在側(cè)縫灌入適量熔化的石蠟，使培養(yǎng)皿側(cè)壁縫隙被石蠟密封，盡量不要留有氣泡。最后將培養(yǎng)皿放入30℃的恒溫箱中培養(yǎng)2-3d，在10-5濃度梯度下的培養(yǎng)皿中出現(xiàn)了20-30個(gè)黑色圓點(diǎn)狀單菌落，在10-6濃度梯度下的培養(yǎng)皿中出現(xiàn)了2-4個(gè)黑色圓點(diǎn)狀單菌落。
其中，篩選培養(yǎng)基組成為：k2hpo40.4-0.6g/l，cacl20.1-0.2g/l，nh4cl0.8-1.0g/l，mgso4·7h2o1-2g/l，nacl1-2g/l，na2so40.4-0.6g/l，c3h5o3na2.0-3.0g/l，l-半胱氨酸0.5-0.6g/l，抗壞血酸0.5-0.6g/l，fe(nh4)2(so)20.5-0.6g/l以及2wt％的瓊脂。配制時(shí)先將其他原料混合并在121℃下滅菌20min，接著降溫至55℃后加入l-半胱氨酸、抗壞血酸、fe(nh4)2(so4)2，調(diào)節(jié)ph至8.0-8.5。
第三步：菌株的分離純化
在無菌操作臺(tái)上，將篩選培養(yǎng)基高溫滅菌后保持在55℃左右，向若干培養(yǎng)皿皿底中倒入約1/2高度。待其冷凝后，將平板篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基拆封，將不同冷卻時(shí)間凝固的瓊脂平板層小心撬開，挑取明顯的黑色單菌落并在新配制的平板中橫向劃線分離。再將高溫滅菌后保持在55℃左右的篩選培養(yǎng)基倒入劃線分離后的平板上，直至將溢未溢的狀態(tài)迅速蓋上培養(yǎng)皿，盡量不要留有氣泡，去掉培養(yǎng)皿內(nèi)外兩層側(cè)壁間多余的瓊脂，培養(yǎng)皿的縫隙用膠帶密封。將培養(yǎng)皿放入30℃的恒溫箱中培養(yǎng)，直至出現(xiàn)明顯的黑色原點(diǎn)狀單菌落。一次劃線分離培養(yǎng)3-4d，分離2-3次。
第四步：菌株的保存
將保存培養(yǎng)基和10ml小試管置于121℃滅菌20min，在無菌操作臺(tái)上將保存培養(yǎng)基倒入10ml小試管中，留取1-2mm的縫隙。待其冷卻凝固后用針刺法將劃線分離過后的黑色單菌落挑取后刺入凝固后的固體保存培養(yǎng)基內(nèi)，將小試管放入30℃的恒溫烘箱中培養(yǎng)，直至出現(xiàn)明顯絲狀菌落后置于低溫冷藏，保存期可達(dá)半年以上。
其中，保存培養(yǎng)基組成為：k2hpo40.5-0.7g/l，cacl20.1-0.2g/l，nh4cl1-1.2g/l，mgso4·7h2o1-2g/l，nacl2-3g/l，na2so40.4-0.6g/l，c3h5o3na3.0-4.0g/l，l-半胱氨酸0.5-0.6g/l，抗壞血酸0.5-0.6g/l。配制時(shí)先將其他原料混合并在121℃下滅菌20min，接著降溫至55℃后加入l-半胱氨酸、抗壞血酸，調(diào)節(jié)ph至8.0-8.5。
篩選所得硫酸鹽還原菌還原硫酸鹽能力測(cè)定
從保存培養(yǎng)基中挑取硫酸鹽還原菌接種至液體培養(yǎng)基中，在厭氧條件下活化菌株。在30℃恒溫?fù)u床中于100-120r/min的轉(zhuǎn)速下活化4d以上，測(cè)定其od600在0.5以上后，按照5‰的接種量轉(zhuǎn)接至新的液體培養(yǎng)基中，在厭氧條件下培養(yǎng)后采用亞甲基藍(lán)分光光度法測(cè)定菌液中的s2-含量，計(jì)算得到其將so42-轉(zhuǎn)化為s2-離子的轉(zhuǎn)化率為70％～80％。其中，厭氧條件為：用液體石蠟封面，并充入氮?dú)獗３謪捬鯛顟B(tài)；所使用的液體培養(yǎng)基組成為：k2hpo40.4-0.6g/l，nh4cl0.8-1g/l，mgso4·7h2o1-2g/l，nacl2-3g/l，na2so40.4-0.6g/l，c3h5o3na2.0-3.0g/l，l-半胱氨0.5-0.6g/l，抗壞血酸0.5-0.6g/l。配制時(shí)先將其他原料混合并在121℃下滅菌20min，接著降溫至55℃后加入l-半胱氨酸、抗壞血酸，調(diào)節(jié)ph至8.0-8.5。
通過改進(jìn)后的三層疊皿平板法與傳統(tǒng)雙層疊皿平板法對(duì)比測(cè)試發(fā)現(xiàn)，在相同濃度梯度下得到的硫酸鹽還原菌單菌落數(shù)量多出50％左右；并且由于在稀釋液中加入了0.5wt％的l-半胱氨酸、0.5wt％的抗壞血酸以及0.5wt％的硫酸亞鐵銨，為硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)創(chuàng)造了良好的厭氧環(huán)境，使其篩選分離周期縮短了2-3d；同時(shí)最終測(cè)定表明，篩選所得菌種將so42-轉(zhuǎn)化為s2-離子的轉(zhuǎn)化率高達(dá)70％～80％，比傳統(tǒng)篩選方法高出10％～20％。