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基于eGFP的GPR120基因表達(dá)的檢測方法及應(yīng)用與流程

文檔序號:11172005閱讀:2865來源:國知局
基于eGFP的GPR120基因表達(dá)的檢測方法及應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于egfp生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種基于egfp的gpr120基因表達(dá)的檢測方法,本發(fā)明還涉及一種基于egfp在gpr120基因表達(dá)檢測中的應(yīng)用。



背景技術(shù):

gpr120(g-proteincoupledreceptor120;又名freefattyacidreceptor4,ffar4)是脂肪酸受體家族一員,屬于g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr),可被長鏈脂肪酸激活,尤以n-3不飽和脂肪酸激活能力最強(qiáng)。gpr120在腦、垂體、肺、舌、胃腸、脂肪組織等許多組織表達(dá),主要分布于胃腸多種內(nèi)分泌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成骨和破骨細(xì)胞以及味蕾細(xì)胞。gpr120激活可刺激glp-1、cck、gip等胃腸激素分泌,影響機(jī)體的內(nèi)分泌代謝活動,與肥胖等代謝異常密切相關(guān)。

gpr120表達(dá)水平高低顯著影響其細(xì)胞調(diào)節(jié)作用,gpr120表達(dá)調(diào)控的研究將促進(jìn)對gpr120功能的認(rèn)識和發(fā)現(xiàn)可能的代謝調(diào)節(jié)靶分子,為gpr120靶點(diǎn)藥物的研發(fā)提供一定的依據(jù)?;虮磉_(dá)研究所常用技術(shù)手段目前有反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)和northern印跡雜交(northernblot),這兩種方法雖然技術(shù)成熟,廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)水平的檢測,但是也存在一定的缺點(diǎn):一是實(shí)驗(yàn)過程較為繁瑣,二是不能在活細(xì)胞水平監(jiān)測基因表達(dá)的變化。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是提供一種基于egfp的gpr120基因表達(dá)水平的檢測方法及其應(yīng)用,解決了現(xiàn)有g(shù)pr120基因表達(dá)水平的檢測中實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、不能在活細(xì)胞水平監(jiān)測基因表達(dá)的變化的問題,為gpr120基因表達(dá)水平的檢測提供了新思路。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是,egfp在gpr120基因表達(dá)水平的檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明的特征在于,

egfp與gpr120基因表達(dá)水平的呈線性關(guān)系,即隨著egfp熒光平均強(qiáng)度值的增加,gpr120基因表達(dá)水平增加。

本發(fā)明所采用的另一個(gè)技術(shù)方案是,基于egfp的gpr120基因表達(dá)水平的檢測方法:

步驟1,首先通過crispr/cas9技術(shù)將egfp片段定點(diǎn)插入到gpr120基因的終止密碼子taa處,使egfp隨gpr120表達(dá)而表達(dá),獲得egfp標(biāo)記gpr120陽性細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因模型小鼠;

步驟2,隨后應(yīng)用熒光分析儀在488nm激光激發(fā)下對小鼠的陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定。

本發(fā)明的特征在于,

步驟2的熒光強(qiáng)度通過單細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行表達(dá)。

步驟2的具體步驟:

步驟2.1,使用沒有被egfp標(biāo)定的小鼠細(xì)胞進(jìn)行熒光分析儀的激光強(qiáng)度指標(biāo)校正;

步驟2.2,收取步驟1中轉(zhuǎn)基因模型小鼠的不同組織的egfp陽性細(xì)胞,通過經(jīng)步驟2.1校正后的熒光分析儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定,獲取egfp與gpr120基因表達(dá)水平之間的關(guān)系;同時(shí)通過rt-pcr方法檢測egfp陽性細(xì)胞中g(shù)pr120的基因表達(dá)水平,驗(yàn)證egfp與gpr120基因表達(dá)水平之間的關(guān)系。

本發(fā)明有益效果是:

a)本發(fā)明通過實(shí)時(shí)監(jiān)測gpr120基因表達(dá),做到自身前后對照,控制組內(nèi)誤差,減少組間誤差,保證測定結(jié)果更為可靠,從而彌補(bǔ)和克服了rt-pcr和northernblot等方法對不同組織細(xì)胞進(jìn)行組間比較而產(chǎn)生的變異性、不能在活細(xì)胞水平監(jiān)測基因表達(dá)的變化的問題;

b)本發(fā)明收取細(xì)胞后即刻確定gpr120基因表達(dá)水平,省去了rna提取、rna反轉(zhuǎn)錄和pcr等操作和反應(yīng)過程,使gpr120基因表達(dá)檢測更加簡便快捷。

附圖說明

圖1是gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠的組織細(xì)胞中egfp熒光陽性細(xì)胞,其中,圖1a為gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠組織在488nm激光激發(fā)下egfp熒光陽性細(xì)胞圖,圖1b為圖1a的組織的普通光鏡圖,圖1c為野生型小鼠組織在488nm激光激發(fā)下細(xì)胞圖,圖1d為圖1c的組織的普通光鏡圖;

圖2是小鼠組織中的擴(kuò)增曲線圖,其中,圖2a為gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠的組織中g(shù)pr120的rt-pcr小擴(kuò)增曲線,圖2b為gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠的組織中egfp的rt-pcr小擴(kuò)增曲線,圖2c為野生型小鼠組織中g(shù)pr120的rt-pcr小擴(kuò)增曲線,圖2d為野生型小鼠組織中egfp的rt-pcr小擴(kuò)增曲線;

圖3是gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織細(xì)胞中egfp熒光強(qiáng)度和gpr120基因表達(dá)水平之間的關(guān)系;

圖4是gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在體外經(jīng)脂多糖處理后egfp熒光強(qiáng)度和gpr120基因表達(dá)水平之間的關(guān)系圖,其中,圖4a是gpr120基因表達(dá)水平在對照組和經(jīng)脂多糖處理組的關(guān)系圖,圖4b是egfp熒光強(qiáng)度均值在對照組和經(jīng)脂多糖處理組的關(guān)系圖,圖4c是gpr120基因表達(dá)水平與細(xì)胞egfp熒光強(qiáng)度均值的關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明以egfp標(biāo)記gpr120陽性細(xì)胞的模型小鼠為對象,利用熒光顯微鏡技術(shù)測定小鼠egfp陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,與egfp陽性細(xì)胞的gpr120基因表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析,確定egfp陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與gpr120基因表達(dá)水平之間的線性關(guān)系,使egfp熒光強(qiáng)度作為gpr120基因表達(dá)水平的一個(gè)可靠的檢測指標(biāo)提供了依據(jù)。

基于egfp的gpr120基因表達(dá)水平的檢測方法:

步驟1,首先通過crispr/cas9技術(shù)將egfp片段定點(diǎn)插入到gpr120基因的終止密碼子taa處,使egfp隨gpr120表達(dá)而表達(dá),獲得egfp標(biāo)記gpr120陽性細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因模型小鼠,這樣egfp隨gpr120表達(dá)而表達(dá),并且在mrna水平,egfp和gpr120相互分離,保證了gpr120蛋白的功能和代謝過程不受影響;

步驟2,隨后應(yīng)用熒光分析儀在488nm激光激發(fā)下對小鼠的陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定,并通過單細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度表達(dá),

步驟2.1,使用沒有被egfp標(biāo)定的小鼠細(xì)胞進(jìn)行熒光分析儀的激光強(qiáng)度指標(biāo)校正;

步驟2.2,收取步驟1中轉(zhuǎn)基因模型小鼠的不同組織的egfp陽性細(xì)胞,通過經(jīng)步驟2.1校正后的熒光分析儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定,獲取egfp與gpr120基因表達(dá)水平之間的關(guān)系;同時(shí)通過rt-pcr方法檢測egfp陽性細(xì)胞中g(shù)pr120的基因表達(dá)水平,驗(yàn)證egfp與gpr120基因表達(dá)水平之間的關(guān)系。

1.實(shí)驗(yàn)對象

制備的egfp標(biāo)記gpr120的模型小鼠,細(xì)胞組織中能見egfp陽性細(xì)胞,在488nm激光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光,具體如圖1所示:圖1a為gpr120-ires-egfp轉(zhuǎn)基因小鼠組織的熒光陽性細(xì)胞圖,可見陽性細(xì)胞,圖1b為圖1a的組織的普通光鏡圖,圖1c為野生型小鼠組織的細(xì)胞圖,未見熒光陽性細(xì)胞,圖1d為圖1c的組織的普通光鏡圖。

2.細(xì)胞內(nèi)rna提取和反轉(zhuǎn)錄

在egfp標(biāo)記gpr120的模型小鼠和野生型小鼠,分別提取小鼠的胃粘膜、十二指腸粘膜、空腸粘膜、結(jié)腸粘膜、脂肪組織、垂體、肺臟等組織器官的rna提取并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,具體如下:取上述組織各1-2mg,每樣加入350μl裂解液rl,使用組織破裂儀破裂組織,再將所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱cs中以12000rpm速度離心2min,收集濾液;再向?yàn)V液中加入350μl70%的乙醇溶液,混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱cr3中以12000rpm速度離心1min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱cr3放回收集管中;向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1,以12000rpm速度離心1min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱cr3放回收集管中;向吸附柱cr3中加入80μldnasei工作液,室溫放置15min;向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1,以12000rpm速度離心1min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱cr3放回收集管中;向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw,室溫靜置2min,以12000rpm速度離心1min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱cr3放回收集管中;重復(fù)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw,室溫靜置2min,以12000rpm速度離心2min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱cr3置于室溫放置5min以徹底晾干殘余的漂洗液;將吸附柱cr3轉(zhuǎn)入rnase-free離心管中,加入50μlrnase-freeddh2o,室溫放置2min,以12000rpm速度離心2min,得到rna溶液。

酶標(biāo)儀檢測rna濃度與純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測rna質(zhì)量。在八連管中依次加入2μl5xgdnaeraserbuffer,再分別加入1μlgdnaeraser,再分別加入1μgtotalrna,最后用rnasefreedh2o補(bǔ)足至10μl,混勻,室溫反應(yīng)5min。在各管中分別加入以下試劑,4μl5xprimescriptbuffer2、4μlrnasefreedh2o、1μlprimescriptrtenzymemixi和1μlrtprimermix,總反應(yīng)體系為20μl,混勻。反應(yīng)條件為37℃、15min,85℃、5s。反應(yīng)完成后將cdna存于4℃?zhèn)溆?,長期保存時(shí)轉(zhuǎn)入-20℃。

3.gpr120和egfp基因表達(dá)水平的檢測

采用定量pcr方法對gpr120和egfp的基因表達(dá)進(jìn)行檢測。在八連管中依次加入6μldh2o,2μl模板cdna,2μlfas引物,10μlsybrpremixextaqii(2x),總反應(yīng)體系為20μl,混勻。

反應(yīng)條件是:第一步是94℃、5min,第二步是94℃、30s,56℃、30s,72℃、1min循環(huán)進(jìn)行40次,第三步是加溫溶解擴(kuò)增產(chǎn)物,獲得溶解曲線。

其中,總反應(yīng)體系中小鼠gpr120引物序列是:

上游引物:5’-gtgccgggactggtcattgtg-3’;

下游引物:5’-ttgttgggacactcggatctgg-3’。

總反應(yīng)體系中egfp引物序列是:

上游引物:5’-tcttcttcaaggacgacggcaact-3’;

下游引物:5’-ccttgatgccgttcttctgcttgt-3’。

以beta-actin基因表達(dá)為內(nèi)對照,總反應(yīng)體系中beta-actin引物序列是:

上游引物:5’-cgttggcatccacgaaacta-3’;

下游引物:5’-ggtgctgggaggtacaggg-3’。

對實(shí)驗(yàn)結(jié)果表達(dá)水平分析得到如圖2所示的擴(kuò)增曲線。如圖2a表示轉(zhuǎn)基因小鼠的組織中g(shù)pr120的rt-pcr小擴(kuò)增曲線,如圖2b表示轉(zhuǎn)基因小鼠的組織中egfp的rt-pcr小擴(kuò)增曲線,在一定階段內(nèi)兩者均隨著擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)的增大而升高。如圖2c表示野生型小鼠組織中g(shù)pr120的rt-pcr小擴(kuò)增曲線,在一定階段內(nèi)兩者均隨著擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)的增大而升高,如圖2d表示野生型小鼠組織中egfp的rt-pcr小擴(kuò)增曲線,曲線結(jié)果無表達(dá)。

以beta-actin基因表達(dá)為內(nèi)對照,對各個(gè)不同組織中的gpr120基因表達(dá)水平進(jìn)行分析,并應(yīng)用熒光顯微鏡對各個(gè)組織中egfp標(biāo)記的細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量。結(jié)果表明,組織中g(shù)pr120表達(dá)水平與組織中綠色熒光細(xì)胞的熒光強(qiáng)度之間呈顯著正相關(guān),結(jié)果如圖3所示。

實(shí)施例

培養(yǎng)egfp標(biāo)記的gpr120的模型小鼠的肺泡巨噬細(xì)胞,具體方法如下:體外培養(yǎng)采用頸部脫臼法處死egfp標(biāo)記gpr120的模型小鼠,用75%的酒精對小鼠進(jìn)行消毒處理;用10ml注射器吸取pbs緩沖液6ml左右,除去氣泡備用;用眼科剪剪開頸部至胸腔外表皮,分離頸部氣管穿線備用,剪開胸腔使肺部暴露,用鑷子夾住氣管前端,剪短氣管將注射器針尖插入氣管并用線扎緊;緩慢注入pbs緩沖液2-3ml使肺部充滿,吸出肺內(nèi)溶液再緩慢注入,循環(huán)3-5次,吸取肺內(nèi)pbs緩沖液注入離心管,所得為含肺巨噬細(xì)胞的溶液;將離心管配平于低溫水平離心機(jī)離心6min,轉(zhuǎn)速為1200rpm;吸去上清液,底物即為肺巨噬細(xì)胞。

向肺巨噬細(xì)胞中加入細(xì)胞培養(yǎng)液,充分混勻,種于培養(yǎng)皿,使每組培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞數(shù)均勻,標(biāo)上日期及名稱,置37℃的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8小時(shí)后,細(xì)胞分組,一組加入200ng/ml的脂多糖(lps)處理24小時(shí),另外一組為對照組。

隨后,應(yīng)用熒光顯微鏡對各個(gè)組織中egfp標(biāo)記的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量,測量熒光強(qiáng)度之后,收集細(xì)胞的rna,反轉(zhuǎn)錄之后應(yīng)用定量pcr方法觀察gpr120基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示,如圖4a所示,肺泡巨噬細(xì)胞的gpr120基因表達(dá)與lps處理組比較,對照組顯著升高;如圖4b所示,同時(shí)肺泡巨噬細(xì)胞的egfp熒光強(qiáng)度均值與lps處理組比較,對照組也顯著升高;如圖4c所示,gpr120基因表達(dá)與細(xì)胞egfp熒光強(qiáng)度均值之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系,隨著egfp熒光強(qiáng)度均值的增大,gpr120基因表達(dá)水平升高。

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