相關(guān)申請的交叉引用

本申請是申請?zhí)枮?01180033386.0、申請日為2011年5月5日、發(fā)明名稱為“金黃色葡萄球菌殺白細胞素及其治療組合物和用途”的中國發(fā)明專利申請的分案申請，原申請為國際申請?zhí)枮閜ct/us2011/035354的國家階段申請，該國際申請要求申請日為2010年5月5日，申請?zhí)枮?1/331,550的美國申請的優(yōu)先權(quán)，其通過引用并入本文。

序列表

本申請包括了一份通過efs-web提交的序列表，其公開內(nèi)容在此參考并入。所述ascii拷貝創(chuàng)建于2011年5月2日，并被命名為sequencelisting_staphylococcusaureusleukocidins_st25.txt，大小為102kb。

發(fā)明背景

金黃葡萄球菌或“葡萄球菌”通?？稍谌撕蛣游锏钠つw或鼻孔內(nèi)發(fā)現(xiàn)。葡萄球菌一般情況下是無害的，除非其通過切口或其他傷口進入身體。在健康人身上，典型的葡萄球菌感染是很小的皮膚問題。以前，葡萄球菌感染使用廣譜抗菌素，如甲氧西林進行治療。然而，現(xiàn)在出現(xiàn)了一些耐藥葡萄球菌菌株，其對甲氧西林和其他β-內(nèi)酰胺類抗生素，如青霉素和頭孢菌素有耐藥性。它們被稱為甲氧西林耐藥性金黃葡萄球菌(也稱多藥耐藥性金黃葡萄球菌，或"mrsa")。

葡萄球菌感染，包括mrsa，開始通常為類似丘疹、癤子或蜘蛛咬傷一樣的小紅腫包。這些腫包或缺損可能很快轉(zhuǎn)化為需要外科手術(shù)排膿治療的深度、疼痛型膿腫。有時，細菌僅限于皮膚。在有些情況下，它們可能深入到身體內(nèi)部，并可能導(dǎo)致危及生命的人體多個組織的感染，包括皮膚、軟組織、骨頭、關(guān)節(jié)、外科手術(shù)傷口、血液系統(tǒng)、心臟瓣膜、肺部、或其他器官。因此金黃葡萄球菌感染可能變成致命性疾病，例如，壞死性筋膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、中毒性休克綜合征以及各種形式的肺炎。在醫(yī)院或醫(yī)療環(huán)境下mrsa感染是特別麻煩的，患者常常會有開放性創(chuàng)傷、侵入性器械和免疫系統(tǒng)衰弱，所以比在公共場合中有更高的感染風(fēng)險。沒有遵循正確衛(wèi)生程序的操作人員可能將mrsa細菌從一名患者傳遞給另外一名患者。

金黃葡萄球菌產(chǎn)生一系列的不同的毒力因子和毒素，它們能使該細菌中和并抵抗各種類型免疫細胞的攻擊，特別是白細胞的亞群，白細胞組成身體主要抵御系統(tǒng)。這些毒力因子和毒素的產(chǎn)生可以讓金黃色葡萄球菌保持感染狀態(tài)。參見nizet,j.allergyclin.immunol.120:1322(2007)。在這些毒力因子中，金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生各種雙組分的白細胞毒素，這些毒素通過兩種非結(jié)合的蛋白或亞單位的協(xié)同作用破壞宿主防御細胞和紅細胞的細胞膜。參見，supersac,等,infect.immun.61:580-7(1993)。在這些雙組分的白細胞毒素中，γ-溶血素(hlgab和hlgcb)和潘通-瓦倫丁(pantone-valentine)殺白細胞素(pvl)是最具代表的。

殺白細胞素對哺乳動物細胞的毒性涉及兩個組分的作用。第一個亞單位命名為s亞單位級(即，慢洗脫的亞單位)，第二個亞單位命名為f亞單位級(即，快洗脫的亞單位)。s亞單位和f亞單位協(xié)同作用可在白細胞上形成孔洞，白細胞包括單核細胞、吞噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞(統(tǒng)稱為吞噬細胞)。參見，menestrina,等,toxicol.39:1661-1672(2001)。雙組分的毒素在靶細胞膜上形成孔洞的機制還沒有完全了解。這些毒素可能的作用機制包括s亞單位與靶細胞膜的結(jié)合，該結(jié)合很可能是通過一個受體，然后f亞單位結(jié)合到s亞單位上，從而形成一個低聚物，該低聚物形成了插入靶細胞膜的前孔洞(jayasinghe,等,protein.sci.14:2550-2561(2005))。雙組分白細胞毒素形成的孔洞是典型的陽離子選擇性的?？锥吹男纬蓵?dǎo)致細胞的裂解死亡，已有報道在白血球細胞中，其裂解死亡是由于陽離子匯集導(dǎo)致的滲透壓不平衡所致(miles,等,biochemistry40:8514-8522(2001))。

除了pvl(即s/f-pv或luksf-pv)以及γ-溶血素(hlgab和hlgcb)，金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的雙組分組成中還包括殺白細胞素e/d(luked)和殺白細胞素m/f’(lukmf’)。因此，這些雙組分殺白細胞素的s亞單位包括hlga、hlgc、luke、luks-pv、和lukm，f亞單位包括hlgb、lukd、lukf-pv、和lukf’-pv(menestrina,等，如上所述)。金黃色葡萄球菌的s-和f-亞單位不是殺白細胞素所特有的。即，其可以相互替換，這就使其他的雙組分組合可以在白血球細胞上形成功能性孔洞，從而大大增加了殺白細胞素的組成(meyer,等,infect.immun.77:13-22(2009))。

開發(fā)對mrsa感染的有效治療已經(jīng)變得很有必要。除了對前述的甲氧西林和相關(guān)的抗生素的耐藥性，mrsa還發(fā)現(xiàn)對大環(huán)內(nèi)脂類(如，紅霉素)、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物(如，舒巴坦、奧格門汀)以及氟喹諾酮類(如，環(huán)丙沙星)，還有克林霉素、甲氧芐啶/磺胺甲基異噁唑(復(fù)方新諾明)和利福平具有顯著的抗藥性。在嚴重的金黃色葡萄球菌感染中，臨床醫(yī)生已經(jīng)開始使用靜脈給予萬古霉素。然而，金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥已有報道。所以，有必要開發(fā)可以有效抵抗金黃色葡萄球菌感染的新型抗菌藥物。

發(fā)明概述

申請人發(fā)現(xiàn)并鑒定了金黃色葡萄球菌天然存在的防御系統(tǒng)中的另外一個雙組分成員。新鑒定的天然s亞單位多肽組分在本申請中被稱為“l(fā)uka”，其包含天然多肽及其類似物，天然多肽的類似物與天然多肽的序列有至少70％的相似性。因此，本發(fā)明的一方面涉及l(fā)uka的分離和/或純化。本發(fā)明的另一方面涉及編碼luka的分離和/或純化的多核苷酸，含有該多核苷酸的轉(zhuǎn)染宿主(如，細胞)，以及通過在轉(zhuǎn)染宿主中表達多核苷酸制備重組luka的方法。

新鑒定的f亞單位多肽組分在本申請中被稱為“l(fā)ukb”，其包含天然多肽及其類似物，天然多肽的類似物與天然多肽的序列有至少70％的相似性。因此，本發(fā)明的一方面涉及l(fā)ukb的分離和/或純化。本發(fā)明的另一方面涉及編碼lukb的分離和/或純化的多核苷酸，含有該多核苷酸的轉(zhuǎn)染宿主(如，細胞)，以及通過在轉(zhuǎn)染宿主中表達多核苷酸制備重組lukb的方法。

然而，本申請的另外一方面涉及治療組合物，該組合物含有制備于藥學(xué)上可接受的藥物載體中的治療有效量的luka和/或lukb，可用于抑制金黃色葡萄球菌感染的發(fā)病或?qū)ζ溥M行治療。因此，在一個實施方式中，治療組合物中包括治療有效量的luka。在另一個實施方式中，治療組合物中包括治療有效量的lukb。在另一個實施方式中，治療組合物中包括治療有效量的luka和lukb。在其他實施方式中，組合物包含luka的類似物，其缺少10c-端殘基且沒有毒性(本申請中稱為lukaδ10c或rlukaδ10c)。這些組合物具有多種治療用途。在一些實施方式中，組合物稱為抗炎組合物，并可被用于治療急性炎癥或疾病，特別是局部急性炎癥情況。

這些用途運用了申請人的其他發(fā)現(xiàn)，即在生理條件下(即，lukab直接由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生)，lukab復(fù)合物對吞噬細胞具有特別的特異性，而對其他有核細胞則無，所述有核細胞例如上皮細胞和內(nèi)皮細胞。也就是說，復(fù)合物在這些種類的細胞膜上形成孔洞，從而導(dǎo)致細胞死亡，這在本申請中稱為“l(fā)ukab介導(dǎo)的細胞毒性”。另外一方面，lukab對其他有核哺乳動物細胞具有相對較小或可忽略不計的特異性。因此，本發(fā)明的抗炎組合物利用了lukab對人類吞噬細胞的特異性作用，來針對性治療急性炎癥，該炎癥的特點為大量吞噬細胞對炎癥部位的浸潤。

在其他實施方式中，治療組合物可被稱為(活性)疫苗組合物。該組合物可被用于在患者身上誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性抗-luka和抗-lukb抗體，所述患者具有感染金黃色葡萄球菌的風(fēng)險或被診斷為金黃色葡萄球菌感染，如mrsa。

本發(fā)明的其他方面涉及特異性結(jié)合luka的抗體、特異性結(jié)合lukb的抗體、包含luka和/或lukb抗體的治療用復(fù)合物、以及使用它們治療金黃色葡萄球菌感染。這些治療組合物可被稱為被動疫苗組合物。因此，在一個實施方式中，這些治療組合物中包含治療有效量的抗-luka抗體。在另一個實施方式中，這些治療組合物中包含治療有效量的抗-lukb抗體。在另一個實施方式中，這些治療組合物中包含治療有效量的抗-luka抗體和抗-lukb抗體。

本發(fā)明的被動和主動疫苗組合物運用了申請人的其他發(fā)現(xiàn)，即感染性的、惡性的金黃色葡萄球菌菌株，例如mrsa表達luka和lukb。大量金黃色葡萄球菌菌株間luka和lukb的保守性使本發(fā)明的疫苗可以提供全譜的治療效果。luka、lukb、抗luka抗體、抗lukb抗體在本申請中也被稱為活性劑。

本發(fā)明還進一步涉及使用lukab、luka、和/或lukb鑒定lukab介導(dǎo)細胞毒性抑制劑的方法。這些方法可能會利用lukab復(fù)合物本身，與吞噬細胞或吞噬細胞膜結(jié)合部分的組合。由此鑒定的抑制劑可以是候選藥物用于金黃色葡萄球菌感染治療。

本發(fā)明進一步涉及預(yù)測或評價金黃色葡萄球菌感染嚴重性的方法，該方法檢測來自感染對象的生物樣品中l(wèi)uka和/或lukb的存在情況及量，或檢測其中l(wèi)uka和/或lukb的相應(yīng)基因。本發(fā)明的這一方面是以申請人的進一步發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的，在許多金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的細胞毒素中，lukab會表現(xiàn)出很強的人類吞噬細胞毒性。因此，相對于對照(例如金黃色葡萄球菌菌株usa100和usa400)產(chǎn)生少量或無法檢測到的luka和/或lukb，如檢測到luka和/或lukb或其對應(yīng)基因(如，金黃色葡萄球菌菌株newman、4645、和mrsa菌株usa300和usa500)的存在或具有相對高的表達量，可以指示存在嚴重的金黃色葡萄球菌感染。

本發(fā)明的上述和其他方面將在下文中進行詳細描述。

附圖簡要說明

圖1為luka的主要序列(命名為seqidno.:1)和來自金黃色葡萄球菌13個不同菌株對應(yīng)的luka多肽(命名為seqidnos.:2-14)的氨基酸序列比對情況。

圖2為lukb主要序列(命名為seqidno.:15)和來自金黃色葡萄球菌12個不同菌株對應(yīng)的lukb多肽(命名為seqidnos.:16-27)的氨基酸序列比對情況。

圖3：lukab是很強的葡萄球菌細胞毒素，其靶向并殺死主要的人類吞噬細胞。(a)用金黃色葡萄球菌菌株newman(野生型)及所示同基因突變株的培養(yǎng)物濾液(2.5％v/v)對人主要外周血單核細胞(pbmc)進行攻毒。細胞存活情況使用celltiter進行檢查，使用培養(yǎng)基處理的細胞設(shè)置為100％。結(jié)果顯示為三份重復(fù)樣品的平均值+標準偏差(s.d.)。(b)用金黃色葡萄球菌菌株newman(野生型)及所示同基因突變株的培養(yǎng)物濾液(2.5％v/v)對人主要單核細胞、吞噬細胞、和樹突狀細胞(dc)進行攻毒。細胞存活情況使用前述方法進行檢查。結(jié)果顯示為兩個供體的平均值，每一個供體的細胞都用三份獨立制備的胞外蛋白制劑對其攻毒，+s.e.m。(c)用金黃色葡萄球菌菌株newman(野生型)及所示同基因突變株的培養(yǎng)物濾液的不同稀釋液對原代人中性粒細胞(pmn)進行攻毒。細胞存活情況使用前述方法進行檢查。結(jié)果顯示為四名供體的pmn平均值±s.e.m.。(d)用純化的rluka、rlukb、或rluka和rlukb組合物以所示濃度對原代人pmn細胞進行攻毒。*指的是與rluka和rlukb都具有統(tǒng)計上的顯著性，p<0.05。對于(a-c)*指的是與野生型(wt)具有統(tǒng)計上的顯著性，**指的是與δlukab/p有統(tǒng)計上的顯著性，p<0.05(student’st檢驗，p<0.05)。

圖4：lukab優(yōu)先靶向人類吞噬細胞。攻毒實驗：(a、c和d)pmn-hl60或(b)thp1細胞，用金黃色葡萄球菌野生型(wt)菌株newman、缺少所示基因/毒素的同基因突變株的培養(yǎng)物濾液的不同稀釋度進行攻毒，(c)用含有空質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌wt(wt/p)，缺少lukab并含有空質(zhì)粒的菌株(δlukab/p)，以及缺少lukab并含有l(wèi)ukab互補質(zhì)粒的菌株(δlukab/plukab)的培養(yǎng)物濾液進行攻毒，或(d)用所示濃度的純化重組luka(rluka)、lukb(rlukb)、或rluka和rlukb的組合(rluka+rlukb)進行攻毒。對于同時用rluka和rlukb的攻毒，總蛋白濃度為等量的rluka和rlukb(如，2.8μg的總蛋白與1.4μg的rluka和1.4μg的rlukb相等)。(e)用10μg/mlrlukab對所示人類細胞系攻毒。細胞存活情況使用celltiter進行檢查，使用培養(yǎng)基處理的細胞設(shè)為100％。結(jié)果顯示為三份重復(fù)樣品的平均值±標準偏差(s.d.)。星號(*)表示與wt相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(單因素方差分析(one-wayanova))。

圖5：lukab是不同葡萄球菌菌株中的重要毒素。(a)使用抗-lukb的多克隆抗體血清，通過免疫印跡分析不同金黃色葡萄球菌的lukb表達情況。(b)使用不同金黃色葡萄球菌胞外蛋白的稀釋液對pmn-hl60細胞進行攻毒。細胞存活情況使用celltiter進行檢查，其中用培養(yǎng)基處理的細胞設(shè)為100％存活。(c)使用毒素特異性血清，通過免疫印跡分析測定wt和lukab同基因菌株的lukb和α-毒素的表達情況。(d)來自wt菌株newman(new)和4645、以及l(fā)ukab同基因菌株的胞外蛋白對pmn-hl60細胞攻毒。細胞存活測定情況見b。結(jié)果為三份重復(fù)樣本的平均值+s.d.。*表示與newman(c)或wt(e)相比有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性(student’st檢驗，p<0.05)。

圖6：lukab破壞目標細胞的胞質(zhì)膜。(a)pmn-hl60細胞的光學(xué)顯微鏡照片，pmn-hl60用金黃色葡萄球菌wt菌株和同基因lukab缺陷型(δlukab)的培養(yǎng)物濾液進行攻毒。(b-c)wt菌株(wt/p)、同基因lukab缺陷型菌株(δlukab/p)、互補菌株(δlukab/plukab)培養(yǎng)物濾液的攻毒，或用培養(yǎng)基攻毒的模擬。細胞膜破損細胞使用sytox綠染色，使用熒光顯微鏡成像(c)并測定綠色熒光的強度(b)。(d)用金黃色葡萄球菌菌株newman(mssa)或usa300菌株lac(mrsa)和所示同基因突變株，以不同的感染復(fù)數(shù)(moi)對pmn細胞進行體外感染。用sytox綠檢查膜破損情況。結(jié)果顯示為三份重復(fù)樣品的平均值±標準偏差(s.d.)。星號(*)表示與wt相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(student’st檢驗，p<0.05)。

圖7：通過靶向和殺傷吞噬細胞，lukab保護金黃色葡萄球菌避免宿主介導(dǎo)的殺傷作用。(a)用金黃色葡萄球菌wt、lukab缺陷型菌株、和lukab缺陷型及具有l(wèi)ukab互補的菌株(δlukab/plukab)，以不同的感染復(fù)數(shù)(moi)對pmn-hl60細胞進行感染。如圖6所示，用sytox綠檢查哺乳動物細胞的細胞膜損傷。結(jié)果顯示為三份重復(fù)樣品的平均值±標準偏差(s.d.)。(b)所示金黃色葡萄球菌體外感染人類全血后的存活情況。結(jié)果為12名供體全血的平均值+s.e.m.。(c)所示金黃色葡萄球菌newman菌株體外感染原代人中性粒細胞(pmn)后的存活情況。結(jié)果顯示為12名供體的pmn平均值+s.e.m.。(d)用wt/p、δlukab/p、和δlukab/plukab菌株培養(yǎng)物濾液的不同稀釋度對原代人pmn的攻毒。測定ldh-釋放作為細胞裂解的指標。結(jié)果顯示為6名供體的pmn平均值+s.e.m.。星號(*)表示與wt菌株newman相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(student’st檢驗，p<0.05)。

圖8：lukab對金黃色葡萄球菌體內(nèi)發(fā)病的重要性。(a)小鼠腎的生物性發(fā)光圖像，小鼠用含有pxen1或plukab.xen1的wt金黃色葡萄球菌lac菌株感染。圖片顯示了每組中具有代表性的代表性兩只小鼠的腎。(b)小鼠腎臟回收的載菌量，小鼠用所示金黃色葡萄球菌lac菌株感染。每個數(shù)據(jù)點表示各動物每毫升組織勻漿中的菌數(shù)(cfu)虛線表示檢測限。對于欄(a-c和e)*表示與wt具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，**表示與δlukab/p具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，p<0.05。

圖9：lukab通過在細胞膜上形成孔洞殺傷人吞噬細胞。(a)使用rluka+rlukb對pmn-hl60細胞攻毒，通過sds-page和免疫印跡進行檢測毒素結(jié)合情況，使用luka或lukb的特異抗體。(b)pmn-hl60與rlukab進行孵育，通過facs檢測毒素的結(jié)合情況，使用兔抗his抗體。(c)用rlukab對pmn-hl60細胞攻毒，通過sds-page和免疫印跡進行檢測質(zhì)膜中l(wèi)ukab寡聚體的形成，使用抗-lukb抗體。(d)在有或者沒有peg-400的情況下，用rlukab或皂苷攻毒處理pmn-hl60細胞。lukab孔洞用溴化乙錠進行檢測。(e)pmn-hl60細胞存活情況用celltiter進行測定，用培養(yǎng)基處理的細胞設(shè)為100％。d和e欄中的結(jié)果為三個樣品的平均值+/sem。星號(*)表示與-peg(d-e)相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(student’st檢驗，p<0.05)。

圖10：lukab細胞毒可以被α-luka的多克隆抗體所中和。用5％(v/v)的金黃色葡萄球菌菌株newman的培養(yǎng)物濾液對pmn-hl60細胞進行攻毒，該菌株已用來自兩只不同兔子不同采血的α-luka多克隆抗體或免疫前血清以所示量進行孵育。細胞存活情況使用celltiter進行檢查，用培養(yǎng)基處理的細胞設(shè)為100％。結(jié)果顯示為三份重復(fù)樣品的平均值±標準偏差(s.d.)。

圖11：luka的c端延伸對lukab的毒性作用是必須的，但對α-luka多克隆抗體的識別是不需要的。(a)使用lasergene軟件的megalignclustalw算法對不同金黃色葡萄球菌淋巴細胞毒性s亞單位氨基酸序列(命名為seqidnos:44-49)的比對。只在luka序列中出現(xiàn)的n端和c端延伸使用黑框進行了強調(diào)。(b)從e.coli中純化和用sds-page分離的2μg重組luka(rluka)、lukb(rlukb)、缺失c端延伸的luka(rlukaδ10c)和缺失n端延伸的luka(rδ33nluka)的考馬斯藍染色，以及用不同量的搭配rlukb的rluka、rlukaδ10c和rδ33nluka對pmn-hl60細胞攻毒。終蛋白濃度為等量的rluka、rlukaδ10c或rδ33nluka和rlukb的量。結(jié)果顯示為三份重復(fù)樣品的平均值±標準偏差(s.d.)。(c)免疫印跡顯示α-luka和α-his多克隆抗體對6xhis-標記的rlukaδ10c具有相同的識別能力。

發(fā)明詳述

下面的公開，按先后次序分別涉及l(fā)uka多肽、lukb多肽、luka和lukb多肽、抗-luka和抗-lukb抗體，包含luka和/或lukb的治療組合物、或抗-luka和/或抗-lukb的抗體、使用該治療組合物的方法、lukab-介導(dǎo)的細胞毒的抑制劑的鑒定方法以及預(yù)測或評價金黃色葡萄球菌感染嚴重程度的方法。

luka多肽

來自金黃色葡萄球菌的多肽現(xiàn)在已被申請人分離并鑒定，其表現(xiàn)出已知的s亞單位殺白細胞素(例如，luks-pvl、luke和hlgc)活性譜。這些肽在本申請中被稱為luka，特異性靶向和結(jié)合人類吞噬細胞(但不靶向和結(jié)合人上皮細胞或人內(nèi)皮細胞、或鼠源細胞)，而且一旦結(jié)合到吞噬細胞膜上，luka就和金黃色葡萄球菌的f亞單位殺白細胞素(如，本申請中公開的lukf-pvl、lukd和hlgb、和lukb)寡聚化，且寡聚化時形成將跨膜的孔洞(統(tǒng)稱為luka活性)。圖1中的比對包含luka的主要序列(本申請中命名為seqidno.:1)以及來自13個不同的金黃色葡萄球菌菌株對應(yīng)的luka多肽(本申請中命名為seqidnos.:2-14)的氨基酸序列。

每個seqidnos:1-14的n端27個氨基酸殘基為天然的分泌/信號序列。因此，成熟、分泌型的luka，其為每個seqidnos:1-14序列中的28-351個殘基，在本申請中可稱為“l(fā)uka(28-351)”或“成熟luka”。對應(yīng)的，未成熟形式的luka在本申請中可稱為“l(fā)uka(1-351)”。

基于seqidnos:2-14(相對天然的金黃色葡萄球菌是不全面的)的luka共有序列，包含了luka最少64個位點的變異性(其中連續(xù)的變異位點為x¹-x⁶⁴)，指的是如下位點：8(x¹＝l或f)、16(x²＝a或v)、17(x³＝i或l)、24(x⁴＝t或n)、26(x⁵＝q或e)、31(x⁶＝h或n)、38(x⁷＝n或t)、46(x⁸＝s或a)、50(x⁹＝e或d)、55(x¹⁰＝t或n)、56(x¹¹＝n或d)、61(x¹²＝s或t)、62(x¹³＝t或p)、63(x¹⁴＝a、g或v)、73(x¹⁵＝i或v)、78(x¹⁶＝e或v)、77(x¹⁷＝t或s)、80(x¹⁸＝v或e)、83(x¹⁹＝e或k)、84(x²⁰＝e或k)、105(x²¹＝v或i)、124(x²²＝k或r)、125(x²³＝e或n)、127(x²⁴＝k、t或n)、129(x²⁵＝s或a)、130(x²⁶＝n或s)、135(x²⁷＝k或q)、146(x²⁸＝r或s)、148(x²⁹＝r或p)、173(x³⁰＝s或n)、174(x³¹＝s或l)、181(x³²＝t或v)、184(x³³＝i或v)、195(x³⁴＝t或s)、202(x³⁵＝n或k)、208(x³⁶＝s或i)、214(x³⁷＝w或r)、221(x³⁸＝i或v)、229(x³⁹＝g或n)、231(x⁴⁰＝v或i)、237(x⁴¹＝e或d)、239(x⁴²＝l或f)、243(x⁴³＝n或t)、246(x⁴⁴＝i或l)、247(x⁴⁵＝a或s)、278(x⁴⁶＝l或i)、283(x⁴⁷＝s或t)、285(x⁴⁸＝e或d)、288(x⁴⁹＝q或r)、299(x⁵⁰＝i或v)、303(x⁵¹＝r或k)、309(x⁵²＝a或g)、310(x⁵³＝p或q)、315(x⁵⁴＝k或q)、318(x⁵⁵＝d或e)、322(x⁵⁶＝l或f)、325(x⁵⁷＝t或v)、338(x⁵⁸＝v或i)、339(x⁵⁹＝d或e)、342(x⁶⁰＝s或t)、344(x⁶¹＝d、e或q)、347(x⁶²＝p或s)、348(x⁶³＝y(tǒng)或f)、和349(x⁶⁴＝k或r)。

lukb多肽

來自金黃色葡萄球菌的多肽現(xiàn)在已被申請人鑒定，其表現(xiàn)出已知的f亞單位殺白細胞素(例如，lukf-pvl、lukd和hlgb)活性譜。這些多肽在本申請中被稱為lukb，其與金黃色葡萄球菌s亞單位殺白細胞素特異性聚合(如，本申請中公開的luks-pvl、luke和hlgc、和luka)，其可結(jié)合到人吞噬細胞上；且在寡聚化時在吞噬細胞上形成一個跨膜的孔洞(本申請中統(tǒng)稱為lukb活性)。圖2中所示的比對包含lukb的主要序列(本申請中命名為seqidno.:15)以及來自12個不同金黃葡萄球菌菌株對應(yīng)的lukb多肽(本申請中命名為seqidnos.:16-27)的氨基酸序列。

每個seqidnos:15-27的n端的29個氨基酸殘基為分泌/信號序列。這樣，成熟、分泌型的lukb，其為每個seqidnos:16-27序列中的30-339個殘基，可被稱為“l(fā)ukb(30-339)”或“成熟lukb”。對應(yīng)的，未成熟形式的lukb可稱為“l(fā)uka(1-339)”。

基于seqidnos:15-28(相對于天然的金黃色葡萄球菌lukb是不全面的)的lukb共有序列，包含了luka最少49個位點的變異性(其中連續(xù)的變異位點為x¹-x⁴⁹)，指的是如下位點：5(x¹＝l或v)、6(x²＝c或y)、13(x³＝s或t)、15(x⁴＝a或t)、16(x⁵＝l或i)、19(x⁶＝a或t)、20(x⁷＝l或f)、23(x⁸＝f或l)、26(x⁹＝s或t)、28(x¹⁰＝y(tǒng)或f)、34(x¹¹＝e或k)、36(x¹²＝k或t)、37(x¹³＝q、t或a)、46(x¹⁴＝d或e),59(x¹⁵＝s或t)、60(x¹⁶＝q或e)、62(x¹⁷＝n或k)、64(x¹⁸＝t或s)、75(x¹⁹＝p或k)、95(x²⁰＝k或r)、98(x²¹＝n、d或e)、126(x²²＝s或刪除)、159(x²³＝r或q)、163(x²⁴＝t或p)、170(x²⁵＝s或k)、187(x²⁶＝l或i)、190(x²⁷＝s或p)、192(x²⁸＝s或t)、193(x²⁹＝s或t)、193(x²⁹＝h或n)、197(x³⁰＝g或a)、204(x³¹＝s或l)、222(x³²＝d或n)、224(x³³＝t或v)、247(x³⁴＝n或d)、270(x³⁵＝n或k)、272(x³⁶＝k或e)、276(x³⁷＝r、q或k)、287(x³⁸＝d或e)、290(x³⁹＝l或i)、294(x⁴⁰＝k或r)、309(x⁴¹＝q或k)、327(x⁴²＝d或n)、329(x⁴³＝l或f)、330(x⁴⁴＝i或v)、332(x⁴⁵＝t或v)、333(x⁴⁶＝f、i或l)、336(x⁴⁷＝k或n)、和338(x⁴⁸＝k或q)。

就一個或多個其他氨基酸的插入、替換或刪除而言，luka和lukb殺白細胞素不同于序列分別為seqidnos:2-14和16-27的天然多肽，例如，seqidnos:2-14或16-27的一個或多個氨基酸殘基可能被另外一個具有相似極性的氨基酸取代，具有相似極性的氨基酸以功能性等價物發(fā)揮作用，從而產(chǎn)生沉默變化。也就是說，相對于天然序列的變化不能明顯減小天然luka和lukb的基本特征。例如seqidnos:1和15。luka或lukb的任何此類類似物都可按照本申請中公開的實驗方案進行檢測(例如，細胞毒性實驗和膜損傷實驗)，以確定其是否維持了天然的luka或lukb活性。這些殺白細胞素內(nèi)的替換可以從這些氨基酸所屬類別中的其他成員中選擇。例如，非極性(疏水性的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。陽離子(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

在其他實施方式中，非保守型變化(例如，一個或多個氨基酸替換、刪除和/或增加)可用于luka和lukb的失活或減毒。在一個實施方式中，非毒性luka類似物c端342-351位的氨基酸被刪除，因此與天然多肽不同。除了seqidnos:4-6(在這些位點包含9個氨基酸)，類似物缺少了10個c-端氨基酸殘基。這些類似物統(tǒng)稱為lukaδ10c。減毒的luka和lukb可用于本申請所述的活性疫苗組合物中。分子修改可以通過本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法進行，包括在質(zhì)粒模板上引物延伸，可使用單鏈模板(kunkel,proc.acad.sci.,usa82:488-492(1985))、雙鏈dna模板(papworth,等,strategies9(3):3-4(1996))、以及pcr克隆(braman,j.(ed.),invitromutagenesisprotocols,2nded.humanapress,totowa,n.j.(2002))。確定luka或lukb上特定分子的變化是否降低lukab毒性的方法，在本申請中有描述。

因此，根據(jù)上文所述及本發(fā)明的目的，luka可以以seqidnos:1-14(例如，seqidno:2，其為來自于金黃色葡萄球菌newman菌株的luka多肽)中的任何一個進行更加廣泛地描述，或者是與其有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相似性的多肽(天然的或非天然的)。

類似的，鑒于上文所述及本發(fā)明的目的，lukb可以以seqidnos:15-27(例如，seqidno:27，其為來自金黃色葡萄球菌newman菌株的lukb多肽)中的任何一個進行更加廣泛地描述，或者是與其有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相似性的多肽(天然的或非天然的)。

因此，除非有相反說明，無論是天然luka和lukb的未成熟和成熟形式、以及與天然的luka有小于100％序列相似性的序列(即，天然序列和類似物一樣，本申請中統(tǒng)稱為“l(fā)uka”和“l(fā)ukb”)可被用于本發(fā)明的組合物和方法中，以及用于制備本發(fā)明中的抗luka和抗lukb的抗體。

編碼luka和lukb的多核苷酸以及合成或分離luka和lukb的方法

luka和lukb殺白細胞素可通過本領(lǐng)域內(nèi)熟知的重組dna的方法進行合成。例如，下文將描述編碼金黃色葡萄球菌(newman)(seqidno:2)luka多肽的核酸序列(命名為seqidno:28)。編碼這一多肽的簡并序列(degeneratesequence)(例如，考慮密碼子偏好性時，在選擇用于重組表達的宿主時有用)、以及編碼其他本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的luka多肽的多核苷酸，或可以由本領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)技術(shù)人員進行設(shè)計。

下文將描述編碼金黃色葡萄球菌(newman)(seqidno:27)lukb多肽的核酸序列(本申請中命名為seqidno:29)。編碼這一多肽的簡并序列(例如，考慮密碼子偏好性時，在選擇用于重組表達的宿主時有用)、以及編碼其他本領(lǐng)域內(nèi)熟知的lukb多肽的多核苷酸，或可以由本領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)技術(shù)人員進行設(shè)計。

luka-和lukb-編碼的多肽可以在宿主中表達后分離和純化，宿主例如細菌(e.coli)、植物和/或酵母?；蛘撸琹uka和lukb殺白細胞素可以按照標準技術(shù)從金黃色葡萄球菌中分離(例如，newman菌株)。這樣，就可以分離到這些殺白細胞素(從天然或非天然環(huán)境中)。它們也可被純化，如此它們基本上與其他蛋白和細胞組分分離，所述其他蛋白和細胞組分在天然狀態(tài)下(即，金黃色葡萄球菌細胞中存在的蛋白和細胞組分)或非天然狀態(tài)下(即，重組細胞宿主的蛋白和細胞組分)與金黃葡萄球菌luka和lukb相關(guān)。適合的純化方案，典型地包含至少兩個連續(xù)步驟的組合，且為本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。參見，deutscher，methodsinenzymology，182(1990)；以及scopes,proteinpurification:principlesandpractice,springer-verlag,n.y.(1982)，這些文獻使用兩個或多個標準技術(shù)組合的方法，標準技術(shù)例如親和柱層析和離子交換液相色譜。

抗-luka抗體和抗-lukb抗體

本發(fā)明的一些方面涉及特異結(jié)合luka的抗-luka抗體、和特異結(jié)合lukb的抗-lukb抗體、包含這些抗體的治療用組合物及其使用方法。本發(fā)明中，術(shù)語“抗體”包含單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段、以及這些抗體的基因工程形式、及其組合物。更具體的，術(shù)語“抗體”，可與“免疫球蛋白”替換使用，包含全長(即，天然存在的或常規(guī)免疫球蛋白基因片段重組方法形成的)免疫球蛋白分子(例如，igg抗體)及其免疫活性片段(即，包含全長免疫球蛋白分子的特異性結(jié)合部分)，同樣其可以是天然存在的或合成的。據(jù)此，術(shù)語“抗體片段”包括抗體的一個部分，例如f(ab')2、f(ab)2、fab'、fab、fv、scfv等。不論結(jié)構(gòu)如何，抗體片段可以結(jié)合全長抗體可以識別的相同抗原，在本發(fā)明中特別是指結(jié)合luka、lukb或lukab復(fù)合物。制備和檢測抗體片段的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。

在一些實施方式中，本發(fā)明的抗-luka抗體可能會和其他葡萄球菌殺白細胞素s亞單位，例如higc、luks-pvl、hlga、luks-i、luke、lukev和lukm有一定程度的交叉反應(yīng)。類似的，在一些實施方式中，本發(fā)明的抗-lukb抗體可能會和其他葡萄球菌殺白細胞素f亞單位，例如lukf’-pv、lukf-pv、lukdv、lukd、lukf-i和hlgb有一定程度的交叉反應(yīng)?？?luka和/或抗-lukb抗體可分別抑制和降低luka活性和lukb活性。在一些實施方式中，抗luka和/或抗lukb抗體分別中和(例如，基本消除)luka和lukb的活性。

天然存在的抗體通常有兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈，每條輕鏈通過鏈間的二硫鍵共價結(jié)合到重鏈上，以及通過多個二硫鍵進一步使重鏈彼此連接。各鏈可以折疊為具有相似大小的結(jié)構(gòu)域(110到125個氨基酸)和結(jié)構(gòu)，但功能可以不同。輕鏈由一個可變區(qū)(vl)和/或一個恒定區(qū)(cl)組成。重鏈也包括一個可變區(qū)(vh)和/或3個或4個恒定區(qū)(ch1、ch2、ch3和ch4)，這依賴于抗體的類型或同種型的不同而不同。人類中，同種型為iga、igd、ige、igg和igm，其中iga和igg還可進一步分為亞類或亞型(iga1-2個，igg1-4)。

通常來講，不同抗體間的可變區(qū)氨基酸具有很高的變異性，特別是在抗原結(jié)合位點。在每個vl和vh中都有三個稱為高變區(qū)或互補決定區(qū)(cdr)的區(qū)域，其由稱為框架可變區(qū)的低變區(qū)域支撐。發(fā)明的抗體包括igg單克隆抗體，但本發(fā)明的抗體也包含抗體片段或其工程形式。例如，它們是fv片段或蛋白，其中示例性抗體的cdr和/或可變區(qū)被構(gòu)建為單鏈的抗原結(jié)合蛋白。

組成vl和vh結(jié)構(gòu)域的抗體部分稱為fv(可變片段)并構(gòu)成了抗原結(jié)合位點。單鏈fv(scfv或sca)為在一條多肽鏈上包含vl和vh結(jié)構(gòu)域的抗體片段，其中一個結(jié)構(gòu)域的n端和另一個結(jié)構(gòu)域的c端通過柔性連接相連接。用于生成單鏈抗體的連接肽是典型的柔性肽，其被選擇用以保證vl和vh結(jié)構(gòu)域進行正確的三維折疊。連接體通常為10到50個氨基酸殘基，在某些情況下可以更短，例如，約10到30個氨基酸殘基，或12到30個氨基酸殘基，或者甚至是15到25個氨基酸殘基。這種連接肽的例子包括四個重復(fù)的甘氨酸殘基，其后接絲氨酸殘基。

單鏈抗體缺乏完整抗體的部分或全部的恒定結(jié)構(gòu)域。因此，他們能克服完整抗體使用中的一些相關(guān)問題。例如，重鏈恒定區(qū)和其他生物分子間的相互作用是不希望發(fā)生的，而單鏈抗體則易于克服這個問題。另外，單鏈抗體比完整抗體要小很多，可以比完整抗體有更強的滲透能力，使其可以更有效地定位和結(jié)合到目標抗原結(jié)合位點。另外，單鏈抗體比起完整抗體相對較小，使其不大可能在受體中引起不希望的免疫反應(yīng)。

fab(片段，抗原結(jié)合)指的是由vl、cl、vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段。木瓜蛋白酶消化后產(chǎn)生的片段可以簡單地稱為fab，且不保留重鏈鉸鏈區(qū)。胃蛋白酶消化后，可產(chǎn)生保留重鏈鉸鏈區(qū)的各種fab。保留了完整的鏈間二硫鍵的片段稱為f(ab')2，而二硫鍵未保留的為單fab'。f(ab')2片段比單價的fab片段對抗原有更高的親和力。

fc(片段結(jié)晶)是指包括配對的重鏈恒定區(qū)的抗體部分或片段。在igg抗體中，例如，fc包括ch2和ch3結(jié)構(gòu)域。iga或igm抗體的fc還包含ch4結(jié)構(gòu)域。fc與fc受體的結(jié)合、補體介導(dǎo)的細胞毒性和抗體依賴的細胞毒性(adcc)的活化相關(guān)。對于iga和igm等的抗體，其為多個igg樣蛋白的復(fù)合物，復(fù)合物的形成需要fc恒定區(qū)。

最后，鉸鏈區(qū)將抗體的fab和fc部分分離開，使fab之間和與fc間能相對運動，也包括用于兩條重鏈共價連接的多個二硫鍵。

抗體“特異性”指的是抗體對特定抗原表位的選擇性識別。術(shù)語“表位”包括任何的蛋白決定簇，其能夠特異結(jié)合免疫球蛋白或t細胞受體或與其他分子的相互作用。表位決定簇通常由分子，例如氨基酸或碳水化合物或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面基團組成，且通常有特定的三維結(jié)構(gòu)特點，以及特定的電荷特點。表位可以是“線性的”或“構(gòu)象性的”。在線性表位中，蛋白和相互作用分子(例如抗體)間相互作用的所有點都是沿著蛋白的主要氨基酸序列以線性方式出現(xiàn)的。在構(gòu)象表位中，相互作用點出現(xiàn)在蛋白的彼此不相鄰的各氨基酸殘基上，即，非相鄰的氨基酸通過蛋白的三級折疊并列在一起。相鄰氨基酸形成的表位通常在暴露于變形劑時會被保留，然而通過三級折疊形成的表位通常在用變形劑處理時會丟失。典型的表位在唯一的空間構(gòu)象中，包含至少3個、通常更多的、至少5個或8-10個氨基酸。設(shè)別相同表位的抗體可在簡單的免疫試驗中進行驗證，該試驗表明一個抗體具有阻止另一個抗體結(jié)合到目標抗原上的能力。

本發(fā)明的單克隆抗體可以是鼠源的、人源的、人源化的或嵌合的。人源化的抗體是重組蛋白，其中一個物種來源的抗體cdr；物種例如，鼠、兔、狗、羊、馬、或雞的抗體(或任何其他合適的動物抗體)，從鼠抗體的重鏈和輕鏈的可變鏈轉(zhuǎn)移到人的重鏈和輕鏈可變區(qū)?？贵w分子的恒定區(qū)來源于人類抗體的恒定區(qū)。制備人源抗體的方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。嵌合抗體優(yōu)選地含有基本或完全來源于人抗體的恒定區(qū)，以及基本或完全來源于非人類的哺乳動物可變區(qū)序列的可變區(qū)。通過用人的對應(yīng)序列替代鼠源(其他非人哺乳動物)抗體的可變區(qū)，而不是高變區(qū)或互補決定區(qū)(cdr)，嵌合過程可被更有效的進行?？勺儏^(qū)，而非cdr，也被稱為可變框架區(qū)(fr)。然而，本發(fā)明的其他單克隆抗體是雙特異的，即他們對luka和lukb都有特異性。雙特異性的抗體優(yōu)選人的或人源化的。

上述抗體可以通過標準的技術(shù)流程而獲得。例如，luka、lukb(本發(fā)明中使用的這些術(shù)語，包括其非毒性的類似物，例如lukaδ10c)或可被給予至對象(例如，人或小鼠等哺乳動物)的luka、lukb免疫活性片段。殺白細胞素可以被單獨用作免疫原或可以連接到載體蛋白或其他物體，例如像凝膠珠之類的珠。哺乳動物產(chǎn)生抗體后，產(chǎn)生抗體的細胞的混合物，細胞例如脾臟細胞，被分離出來，從中可以獲得多克隆抗體。單克隆抗體的產(chǎn)生可從通過將單獨的抗體產(chǎn)生細胞從混合細胞中分離，并將其進行永生化處理，通過例如與骨髓瘤細胞等腫瘤細胞融合。生成的雜交瘤可保存于培養(yǎng)基中，且從培養(yǎng)上清中可以獲得單克隆抗體。

制備重組單克隆抗體的方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。重組多克隆抗體的制備可通過類似美國申請公開號2002/0009453中描述的使用luka、lukb或lukab為抗原的方法進行。

治療組合物

luka和lukb可制備成一種治療組合物，用作治療急性炎癥，包括局部急性炎癥的抗炎劑。luka和lukb也可被制備成治療組合物用作主動疫苗?？筶uka和抗lukb的抗體也可被制備成治療組合物用作被動疫苗。被動和主動疫苗可被預(yù)防性地用于抑制金黃色葡萄球菌感染的發(fā)生，或治療性地用于治療金黃色葡萄球菌感染，尤其對于像mrsa這樣的難于治愈的金黃色葡萄球菌感染、或者在特定對象身上傳統(tǒng)的抗生素療法已經(jīng)驗證難以治療的金黃色葡萄球菌感染。

在用作主動疫苗的治療組合物的實施方式中，luka和/或lukb可被改變以降低毒性。分子變化前文已有描述。像lukaδ10c這樣的非毒性類似物就可以使用。申請人認為，在應(yīng)答非毒性抗原時產(chǎn)生的抗體可以中和毒性的、天然的luka或lukb。其他以降低luka和lukb毒性為目的的變化包括化學(xué)處理(例如，特定氨基酸的修飾)或連接另外一個分子(例如，連接至其它細菌抗原，例如細菌多糖或細菌糖蛋白)。以滅活或脫毒(或減毒)為目的對其他金黃色葡萄球菌毒素進行的化學(xué)變化是熟知的。對于給定的變化是否會降低luka或lukb毒性的鑒定方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，和/或在本文中有描述。

本發(fā)明的治療用組合物可以通過luka和lukb、或者抗luka和抗lukb抗體的配置而制備，使用藥用的載體和輔料(如果需要)。本文中使用的術(shù)語“藥用的載體”和“藥用的輔料”(例如，像填充劑、免疫刺激劑、佐劑、抗氧化劑、防腐劑和增溶劑的添加劑)是指在使用的劑量和濃度下對暴露的細胞或哺乳動物無毒性的。例如藥用載體包括水，例如使用磷酸鹽、檸檬酸鹽和另外的有機酸進行緩沖的水?？捎糜诒景l(fā)明的藥用輔料的代表性實例包括像抗壞血酸這樣的抗氧化劑；低分子量(小于10個殘基)的多肽；像血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白這樣的蛋白；佐劑(選擇沒有誘導(dǎo)毒性的佐劑，例如美國專利6,355,625中描述的β-葡聚糖、或粒細胞集落刺激因子(gcsf))；親水性聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖，和其它碳水化合物(包括葡萄糖，甘露糖或糊精)，螯合劑如edta；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；反離子的鹽，如鈉；和/或非離子型表面活性劑，如聚乙二醇(peg)、和

與本文中其他所述一樣，本發(fā)明的治療組合物可以進一步包括至少一種其他的活性劑。

本發(fā)明的治療組合物的制備存儲可以通過將具有所需純度的一種或多種活性組分和藥學(xué)上可接受的載體，以及可選地，輔料和/或其他活性劑混合，制備成凍干制劑或水性溶液的形式。

治療組合物的用途---適應(yīng)癥

急性炎癥

炎癥通?？杀焕斫鉃楸Ｗo性生物學(xué)反應(yīng)以去除有害入侵刺激物，例如致病菌(例如，細菌和病毒)、損傷的細胞和刺激物，并啟動傷口愈合。炎癥還可被更具體的理解為針對創(chuàng)傷的血管化的活體組織的反應(yīng)。因此，炎癥是一個針對生理、化學(xué)或生物劑導(dǎo)致的創(chuàng)傷或異常刺激而產(chǎn)生的、受影響的血管和鄰近組織的細胞和化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)常規(guī)復(fù)合過程。炎癥通常會導(dǎo)致體液和血細胞在創(chuàng)傷部位的累積，這通常為一個愈合過程。如果沒有炎癥過程，傷口和感染將不能愈合，而且組織的漸進性損傷可能會威脅生命。急性炎癥指的是身體對入侵刺激物的初始響應(yīng)，這涉及血漿和白血球細胞(白血球)在創(chuàng)傷或感染組織部位的募集。長期炎癥，也稱為慢性炎癥，涉及炎癥部位存在的免疫細胞類型的漸進性變換，且其特點是炎癥過程中同時存在組織的破壞和愈合。

然而，炎癥有時會導(dǎo)致?lián)p傷，通常是炎癥正常過程的紊亂導(dǎo)致的。炎癥疾病是指那些與炎癥有關(guān)的、有炎癥特點的、導(dǎo)致炎癥的、由炎癥產(chǎn)生的、或受炎癥影響的疾病。本文中使用的術(shù)語“急性炎癥”，根據(jù)常規(guī)的醫(yī)療用語，指的是發(fā)生快速并伴有嚴重癥狀的炎癥。發(fā)病的持續(xù)時間，從患者的正常狀態(tài)到炎癥癥狀非常明顯的狀態(tài)，通常會持續(xù)達72小時。急性炎癥與慢性炎癥相反，慢性炎癥是一個長期的炎癥狀態(tài)，這指的是一種變化很小或進展緩慢的疾病。對醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)人員而言急性和慢性的區(qū)別是熟知的。

參與炎癥急性期以及急性炎癥疾病的主要免疫細胞包括單核細胞(例如，單核白細胞，其響應(yīng)炎癥反應(yīng)后分化成吞噬細胞)、樹突狀細胞、和中性粒細胞(其遷移到炎癥部位)。這些免疫細胞通過釋放免疫介質(zhì)，例如組胺、γ-干擾素、il-8、白三烯b4、一氧化氮等以及通過消化細菌、病毒和細胞碎片(稱為吞噬作用的過程)來促進炎癥反應(yīng)。在本領(lǐng)域內(nèi)這些細胞統(tǒng)稱為吞噬細胞。

申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)lukab能靶向并殺死人類吞噬細胞，而且這些lukab介導(dǎo)的細胞毒性基本針對這些細胞而不是其他的哺乳動物有核細胞。不限于任何特定的工作原理，申請人相信luka/lukb復(fù)合物可在浸潤吞噬細胞的質(zhì)膜形成孔洞，導(dǎo)致細胞死亡，從而減少炎癥反應(yīng)。因此，不管導(dǎo)致炎癥的原因如何，例如，任何的細菌或病毒感染，且在優(yōu)選的實施方式中為局部的急性炎癥，本發(fā)明的抗炎癥組合物在治療人類，例如哺乳動物中的急性炎癥是很有用的，。這一狀態(tài)的其他例子包括過敏性接觸性皮炎、急性超敏反應(yīng)、急性神經(jīng)炎癥損傷(例如，由急性感染所導(dǎo)致的)、急性心肌梗塞、心肺搭橋手術(shù)導(dǎo)致的急性神經(jīng)元損傷、以及由細菌或病毒感染導(dǎo)致的急性局部抗炎癥。

在優(yōu)選的實施方式中，急性炎癥是一種皮膚或軟組織的感染性創(chuàng)傷。適用于本發(fā)明治療的創(chuàng)傷可以是活組織的刺穿、切割或撕裂形式。皮膚傷口可以滲透到上皮、真皮或全層傷口、皮下組織。因此，可用本發(fā)明的治療組合物治療的傷口包括深層的胸骨傷口，例如，開放性心臟手術(shù)后的傷口和腹部及任何形式的手術(shù)后的術(shù)后傷口。其他傷口為槍擊、刀具、或任何其他能夠造成皮膚切口或撕裂的物體導(dǎo)致的創(chuàng)傷。本發(fā)明的治療適用于作為藥物副作用的傷口或各種病理癥狀的傷口(例如，卡波西氏肉瘤相關(guān)的褥瘡)，以及內(nèi)部傷口(如，肛裂和胃腸道傷口或損傷，例如胃部或腸道潰瘍)。

其他適合用本發(fā)明治療組合物治療的急性炎癥包括結(jié)膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、中心性視網(wǎng)膜炎、外耳炎、急性化膿性中耳炎、乳突炎、迷路炎、慢性鼻炎、急性鼻炎、鼻竇炎、咽炎、扁桃體炎、接觸性皮炎、皮膚神經(jīng)機能病(dermonecrosis)、糖尿病性多發(fā)性神經(jīng)炎、多肌炎、骨化性肌炎、退化性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肩周炎和變形性骨炎。

金黃色葡萄球菌感染

本發(fā)明還提供了一種通過給所需的哺乳動物對象給予抗體組合物而抑制金黃色葡萄球菌感染的發(fā)病或?qū)ζ溥M行治療的方法，本發(fā)明的目標對象人群包括哺乳動物，如感染或有感染金黃色葡萄球菌風(fēng)險的人類。在一些實施方式中，將接受治療的對象感染了金黃色葡萄球菌，包括mras，和/或已經(jīng)使用抗生素或其他治療制劑而治療失敗的對象。

治療有效量

在關(guān)于急性炎癥治療的描述中，luka和lukb的劑量是有治療有效的是指，治療能夠獲得任何一個或多個癥狀數(shù)量的減少、至少一種癥狀的嚴重程度降低、或至少一種癥狀的進一步惡化延遲、或甚至急性炎癥的總體緩解。

在關(guān)于治療組合物作為金黃色葡萄球菌感染的被動或主動疫苗的描述中，治療有效量的luka和lukb、或抗luka和抗lukb抗體也是預(yù)防性有效是指，給予這些組合物可以獲得下述中的一種或多種效果：在有風(fēng)險感染金黃色葡萄球菌，和感染了金黃色葡萄球菌的哺乳動物對象中金黃色葡萄球菌感染得到抑制或預(yù)防、癥狀數(shù)量的減少、至少一個癥狀嚴重程度的減輕、或至少一個癥狀惡化的延緩、或甚至感染總體得到減輕。

廣義上講，luka、lukb和抗luka和抗lukb抗體的治療有效量可以按照標準程序進行確定，這要將許多因素都考慮進來，包括，例如，組合物中的活性劑濃度、給予的方式和頻次、要治療(或預(yù)防)的急性炎癥或金黃色葡萄球菌感染的嚴重程度、以及對象的詳細情況，例如年齡、體重和總體健康和免疫情況。通用指南可以在，例如internationalconferenceonharmonization和remington'spharmaceuticalsciences(馬克出版公司1990)的出版中找到。醫(yī)務(wù)人員可以給予luka和lukb或抗luka和抗lukb抗體，直到這樣的劑量即能提供預(yù)期的或需要的預(yù)防或治療效果。這一治療過程通過常規(guī)實驗可以很容易地進行監(jiān)控。

治療有效量的luka和lukb的典型范圍可以是每次劑量或每天的luka和lukb均為1-400μg。優(yōu)選的，luka和lukb的量是基本相同的。治療有效量的抗體組合物典型地為每公斤體重至少50mg組合物(mg/kg)，這包括每次劑量或每天至少100mg/kg、至少150mg/kg、至少200mg/kg、至少250mg/kg、至少500mg/kg、至少750mg/kg和至少1000mg/kg。單克隆抗體組合物劑量可能會更低，例如大概是非單克隆抗體組合物的十分之一，例如至少約5mg/kg、至少約10mg/kg、至少約15mg/kg、至少約20mg/kg、或至少約25mg/kg。給予方式

給予前，本發(fā)明的治療組合物可以是無菌制劑，其可以在凍干和配制前后，通過無菌濾膜過濾而輕松實現(xiàn)。治療組合物可置于具有無菌接口的容器中，例如，具塞的靜脈注射溶液袋或瓶，塞可被皮下注射針頭刺穿。

抗炎組合物可以按照可接受的醫(yī)療實踐以任何數(shù)量的給予途徑進行給予。優(yōu)選的方式包括使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)進行靜脈、肌內(nèi)、皮下和經(jīng)皮給予。也可以考慮其他的給予途徑。在局部急性炎癥中，非系統(tǒng)性的給予可能是優(yōu)選的，這種情況下治療組合物給予急性炎癥部位或其周圍。

聯(lián)合治療

在一些實施方式中，治療組合物是作為和其它活性劑聯(lián)合治療的一部分進行給予的，這取決與急性感染的本質(zhì)或要治療的金黃色葡萄球菌感染的性質(zhì)。這些其它活性劑包括抗感染藥物、抗生素、和抗微生物藥物。本發(fā)明中有用的代表性抗感染藥物包括萬古霉素和溶葡球菌酶。本發(fā)明中有用的代表性抗生素和抗微生物藥物包括耐青霉素酶青霉素，頭孢菌素和碳青霉烯，包括萬古霉素，溶葡球菌酶，青霉素g，氨芐西林，苯唑西林，萘夫西林，鄰氯青霉素，雙氯青霉素，頭孢噻吩，頭孢唑林，頭孢氨芐，頭孢拉定，頭孢孟多，頭孢西丁，亞胺培南，美羅培南，慶大霉素，替考拉寧，林可霉素和氯林可霉素。這些抗生素的劑量在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。參見，例如，merckmanualofdiagnosisandtherapy,第13節(jié),第157章,100^thed(beers&berkow,eds.,2004)。抗炎癥、抗感染、抗生物和/或抗微生物劑可與本發(fā)明的創(chuàng)新性治療組合物在給予前進行組合合，或同時給予(作為相同組分或不同組分)或相繼給予。

在一些實施方式中，抗luka和/或抗lukb抗體組合物是多價的，這樣其也包含可特異結(jié)合其他細菌性抗原的抗體(以及可選地，可以中和其他細菌性抗原的抗體)?？贵w可特異性結(jié)合任何本發(fā)明在關(guān)于疫苗組合物中所述的抗原。因此，例如，其他抗體可特異結(jié)合多糖或糖蛋白，包括金黃色葡萄球菌5型、金黃色葡萄球菌8型、金黃色葡萄球菌336、殺白細胞素組分，例如pvl(包括單獨的pvl亞單位、luks-pv和lukf-pv)γ-溶血素亞單位(hlga、hlgb、和hlgc)、來自金黃色葡萄球菌的luke或lukd、來自金黃色葡萄球菌的lukm或lukf'-pv、脂磷壁酸(lta)和識別粘附性基質(zhì)分子(mscramm)蛋白的微生物表面組分。

治療方案

本發(fā)明的治療組合物可以單劑量給予、或按照多劑量的方案給予。例如，相對小劑量的治療組合物進行給予，如一次或兩次給予。在包括傳統(tǒng)抗生素治療的實施方式中，傳統(tǒng)治療通常包括數(shù)天或數(shù)周時間的多劑量，抗生素可以每天服用一次、兩次或三次或更多次，持續(xù)一段時間，如至少5天、10天或甚至14天或更多天，而抗體組合物通常僅給予一次或兩次。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以選擇和調(diào)整不同的給藥劑量、給藥時間和治療組合物和抗生素的相對量。

lukab介導(dǎo)的細胞毒性抑制劑的鑒定方法和毒性降低的luka和lukb的變化形式

抗-luka和抗-lukb抗體及其片段、以及其他潛在的治療部分(例如，有機小分子)可用于不同的方法(包括區(qū)分或篩選試驗)中，以評價其抑制lukab介導(dǎo)的細胞毒性的能力。如下所述，這些方法是設(shè)計用于鑒別某些物質(zhì)，所述物質(zhì)可以抑制導(dǎo)致lukab介導(dǎo)的細胞毒性或人類吞噬細胞裂解的級聯(lián)事件的某些方面。這些方法也設(shè)計用于鑒別luka和lukb的變化形式，這些變化形式相對于天然物質(zhì)具有較小的毒性。作為級聯(lián)反應(yīng)一部分的目標事件包括，例如，luka結(jié)合到吞噬細胞膜上、lukb結(jié)合到luka上(lukab寡聚化)、以及阻止lukab低聚體形成膜孔洞。區(qū)分試驗通常需要人類吞噬細胞(或lukab膜結(jié)合部分)、適宜的培養(yǎng)基、以及純化的luka或純化的luka和lukb。

技術(shù)人員應(yīng)理解，如下的實驗方案只是示例性的，且各種操作參數(shù)，例如反應(yīng)條件、檢測標記以及裝置(例如檢測和定量儀器)的選擇是可以進行適當(dāng)變化的。

下面的方法基本涉及l(fā)ukab細胞毒性抑制劑的鑒別方法，而不需要揭示出級聯(lián)過程中哪個具體的事件受到了影響。

為了鑒別lukab細胞毒性抑制劑，人類吞噬細胞(例如，pmn-hl60細胞)可以終體積為50μl的rpmi(gibco)中，5×10³個細胞/孔的密度鋪于384孔的黑色凈底組織培養(yǎng)處理平板(康寧)，補充10％的熱滅活胎牛血清(fbs)。細胞然后和測試化合物/分子接觸/混合/反應(yīng)/處理(～5μl/不同濃度下)，然后用luka和lukb攻毒，其在優(yōu)選的實施方式中基本被純化(5μl的～0.001–2μm的溶液)，優(yōu)選一起加入，在培養(yǎng)狀態(tài)下使luka和lukb攻毒吞噬細胞，例如5％co2、37℃進行1小時。作為對照，細胞可以用培養(yǎng)基處理(100％存活)，以及用0.1％v/vtritonx100(100％死亡)。

在這些實施方式中，上述處理的細胞隨后可以與染料進行孵育，以監(jiān)測細胞的存活，例如用celltiter(promega)(其能通過測定吸收值量化細胞代謝活性而計量培養(yǎng)基中存活細胞數(shù)目，從而確定細胞存活情況)，且額外孵育一段時間(例如，5％co2下37℃大約進行2小時)。然后可以確定細胞存活，例如通過讀板器，例如envision2103multi-labelreader(perkin-elmer)測定294nm處比色反應(yīng)。細胞存活百分比可通過如下公式進行計算：％存活率＝100×(ab492樣品-ab492tritonx)/(ab492組織培養(yǎng)液)。百分存活率的增加提示lukab細胞毒性的抑制。

將一檢測的變體被稱為膜破損實驗。在這些實施方式中，細胞使用如上方法處理(例如，按照或包括用測試化合物/分子處理細胞，然后使用純化的luka攻毒細胞，其后使用不能透過細胞的熒光染料如sytox綠孵育(0.1μm；invitrogen)(按照說明書)并孵育，例如在室溫避光繼續(xù)孵育15分鐘。熒光，作為膜破損的指示劑，可以使用讀板器，例如envision2103multilabelreader(perkin-elmer)在激發(fā)波長485nm、發(fā)射波長535nm處進行測定。熒光降低提示lukab細胞毒性受到抑制。

總之，這些試驗有助于抑制或減少lukab對人類吞噬細胞毒性作用的化合物鑒定。

還可單獨或和如上方法一起使用其他方法，特別是如果上述方法發(fā)現(xiàn)有抑制活性時，其可使本領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)人員更精確地確定生化級聯(lián)反應(yīng)中的哪個事件受到該物質(zhì)的影響或被靶向。這些級聯(lián)反應(yīng)事件包括，例如，luka結(jié)合到吞噬細胞膜上、lukb結(jié)合到luka上(lukab寡聚化)、以及阻止lukab低聚體形成膜孔洞。

luka結(jié)合目標細胞的抑制劑的篩選

為了篩選可以阻止或減少luka與目標細胞結(jié)合的抑制劑，這被認為是攻毒過程的第一步，人類吞噬細胞(例如，pmn-hl60細胞)可以終體積為50μl的rpmi(gibco)中2.5×10³個細胞/孔的密度鋪于384孔的黑色凈底組織培養(yǎng)處理平板(康寧)，補充10％的熱滅活胎牛血清(fbs)。然后細胞用測試化合物/分子(～5μl/不同濃度)進行處理，并使用純化的熒光標記的luka攻毒(例如，fitc、cy3、cy5、apc、pe)，5ul～0.01–2μm溶液在37℃、5％co2條件下處理1小時。為了評價測試化合物/分子的效力，可通過測定細胞相關(guān)熒光來作為luka與細胞結(jié)合的指示劑，，例如，使用用于高通量篩選和高含量分析能力的自動熒光顯微成像系統(tǒng)(例如，cellomicsarrayscanhcsreader(thermoscientific)(激發(fā)波長485nm,發(fā)射波長535nm))。

luka-lukb寡聚化/相互作用抑制劑的篩選

為了篩選可以阻止或減少luka/lukb相互作用的抑制劑，luka/lukb相互作用被認為是攻毒過程的第二步，人類吞噬細胞(例如，pmn-hl60細胞)可以終體積為50μl的rpmi(gibco)中2.5×10³個細胞/孔的密度鋪于384孔的黑色凈底組織培養(yǎng)處理平板(康寧)，補充10％的熱滅活胎牛血清(fbs)。然后細胞可使用測試化合物/分子進行處理，然后用純化的luka和純化的lukb的混合物進行攻毒，其中l(wèi)ukb熒光標記了熒光分子，如fitc、cy3、cy5、apc、和pe，且可使其持續(xù)到攻毒過程完成(例如，37℃，5％co2進行1小時)。為了評價測試化合物/分子的效力，可測定細胞引關(guān)的lukb-fitc熒光作為luka/lukb-fitc相互作用的指示劑，例如，使用用于高通量篩選和高含量分析的自動熒光顯微成像系統(tǒng)(例如，cellomicsarrayscanhcsreader(thermoscientific)(激發(fā)波長485nm,發(fā)射波長535nm))。

lukab孔洞形成的抑制劑篩選

為了篩選可以阻止或抑制lukab孔洞形成的抑制劑，也即是導(dǎo)致細胞裂解的效應(yīng)分子，人類吞噬細胞(例如，pmn-hl60細胞)可以終體積50μl的rpmi(gibco)中2.5×10³個細胞/孔的密度鋪于384孔的黑色凈底組織培養(yǎng)處理平板(康寧)，補充10％的熱滅活胎牛血清(fbs)。然后細胞使用測試化合物/分子進行處理(～5μl，包含不同濃度)，然后使用純化的lukab(～0.001–2μm)于37℃，5％co2條件下處理10分鐘。用培養(yǎng)基處理(陰性對照)以及用0.1％v/vtritonx100的處理(陽性處理)的pmn-hl60細胞作為對照。

為了評價宿主細胞表面的lukab孔洞，可以使用溴化乙錠(eb)流入實驗。eb是小分子陽離子染料，其不能滲透進入健康宿主細胞。當(dāng)lukab形成陽離子孔洞時，eb可進入細胞并結(jié)合到dna上，由此發(fā)出熒光。這種方式處理的細胞然后使用eb(5μm)在室溫下避光繼續(xù)孵育5分鐘。為了評價測試化合物/分子在抑制lukab孔洞形成方面的效力，可以使用讀板器測定熒光作為孔洞形成指示，讀板器例如envision2103multilabelreader(perkin-elmer)，激發(fā)波長為530nm，發(fā)射波長為590nm。該實驗有助于鑒定那些能阻止或抑制lukab孔洞形成的分子，這些分子將可緩解lukab介導(dǎo)的毒性。

為預(yù)測感染嚴重程度，測定lukab由臨床分離的金黃色葡萄球菌的產(chǎn)生的方法

本發(fā)明的另一方面還涉及預(yù)測或評價金黃色葡萄球菌感染嚴重程度的方法，該方法包括在感染對象獲得的生物樣品中，檢測luka和/或lukb的存在情況及數(shù)量或檢測其對應(yīng)基因。作為對照(例如金黃色葡萄球菌菌株usa100和usa400)，僅產(chǎn)生少量或無法檢測到的luka和/或lukb，如果相對于對照檢測到luka和/或lukb的存在與或檢測到相對高的量，或者檢測到其對應(yīng)的基因(如，金黃色葡萄球菌菌株newman、4645和mrsa菌株usa300和usa500)的存在，則提示存在嚴重的感染。對于luka和/或lukb存在或相對量的檢測，可參見圖4a的說明。該方法的示例性實施方式如下有述。

免疫印跡分析測定luka和lukb的水平

為了測定lukab的水平(即，lukab的量)，可從感染對象身上獲取生物樣品，例如體液(如，血液)或組織樣本，隨后讓樣本暴露于適宜的培養(yǎng)條件下，使得金黃色葡萄球菌生長，獲取培養(yǎng)上清，從中分離細菌蛋白，鑒別luka和/或lukb，以及隨后對luka和/或lukb進行定量。更具體地，在一個實施方式中，可以選擇臨床分離的菌株并使其生長于合適的培養(yǎng)基上，例如royalparkmemorialinstitute的培養(yǎng)基1640(rpmi；invitrogen)，補充1％的酪蛋白氨基酸(rpmi+cas)，在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，例如37^οc180rpm振搖培養(yǎng)12-18小時。然后通過離心使細菌沉底，并收集上清進行培養(yǎng)。培養(yǎng)上清(～30μl)然后和10μl的sds-laemmli緩沖液混合，在95℃下煮10分鐘。然后進行蛋白分離，例如，使用15％sds-page膠，然后轉(zhuǎn)移到固相支持物上，例如消化纖維素膜。然后將膜和抗luka或lukb的抗體(例如，兔多克隆抗體)進行孵育，可以通過使用結(jié)合到熒光團上的二抗(例如，結(jié)合alexafluor-680的抗兔抗體；invitrogen)檢測抗體-luka/抗體-lukb復(fù)合物方法，對是否存在luka和lukb進行觀察。然后，將膜進行干燥和掃描，例如使用odyssey紅外成像系統(tǒng)(li-corbiosciences)檢測luka和lukb的量。

檢測luka和/或lukb基因存在的聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)

為了測定編碼lukab基因的存在，從感染對象身上獲得的生物樣品，暴露于適合的培養(yǎng)條件下，使得金黃色葡萄球菌生長，從培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中提取核酸，然后使用pcr或其他合適的擴增方法進行至少一輪的核酸擴增，其中使用luka和/或lukb特異引物，并檢測luka和/或lukb。因此，在一個示例性的實施方式中，初期的樣品制備后，將臨床分離的菌株在固體培養(yǎng)基，例如1.5％瓊脂凝固的胰化蛋白大豆培養(yǎng)基(tsb)上于37℃進行培養(yǎng)。然后挑選金黃色葡萄球菌進行酶消化，例如，使用tsm緩沖液(100mmtrisph7，500mm蔗糖，10mmmgcl2)中的2mg/ml溶葡球菌酶(ambiproductsllc)于37℃處理10分鐘。然后將樣品離心，棄上清，使用100μl的無菌水懸浮沉淀，然后在100℃煮沸5分鐘并離心。上清為擴增反應(yīng)，例如使用luka和/或lukb特異的引物的pcr提供了起始原料和dna模板。

本申請還涉及以下實施方式：

實施方式1.用于抑制金黃色葡萄球菌感染的發(fā)病或?qū)ζ溥M行治療的活性劑，所述活性劑包括至少以下一種：a)治療有效量的luka多肽，其具有seqidnos:1-14中任意一個所示的氨基酸序列，或者與seqidnos:1-14任意一個所示的氨基酸序列具有至少70％序列相似性的序列(“l(fā)uka”)；b)治療有效量的lukb多肽，其具有seqidnos:15-27任意一個所示的氨基酸序列，或者與seqidnos:15-27任意一個所示的序列具有至少70％序列相似性的序列(“l(fā)ukb”)；c)治療有效量的抗-luka抗體，其與luka特異性結(jié)合；或者d)治療有效量的特異性結(jié)合lukb的抗體。

實施方式2.根據(jù)實施方式1所述的活性劑，其中a)是成熟的luka多肽。

實施方式3.根據(jù)實施方式1所述的活性劑，其中a)包含缺乏氨基酸殘基的luka多肽，所述氨基酸殘基對應(yīng)于seqidnos:1-14任意一個的342-351位置。

實施方式4.根據(jù)實施方式1所述的活性劑，其中b)是成熟的lukb多肽。

實施方式5.抑制金黃色葡萄球菌感染的發(fā)病或?qū)ζ溥M行治療的治療組合物，所述治療組合物包括如實施方式1所述的活性劑，和藥學(xué)上可接受的載體。

實施方式6.根據(jù)實施方式5所述的治療組合物，所述治療組合物包括治療有效量的抗-luka抗體、治療有效量的抗-lukb抗體、或治療有效量的抗-luka抗體和抗-luk-b抗體。

實施方式7.抑制金黃色葡萄球菌感染的發(fā)病或?qū)ζ溥M行治療的方法，所述方法包括向所需的哺乳動物對象給予如實施方式5所述的治療組合物。

實施方式8.根據(jù)實施方式7所述的方法，其中所述炎癥是急性的。

實施方式9.根據(jù)實施方式8所述的方法，其中所述急性炎癥是局部的。

實施方式10.根據(jù)實施方式8所述的方法，其中所述急性炎癥是皮膚或軟組織感染性創(chuàng)傷。

實施方式11.根據(jù)實施方式7所述的方法，其中所述金黃色葡萄球菌感染是mrsa感染。

實施方式12.鑒定lukab-介導(dǎo)的細胞毒性的抑制劑的方法，所述方法包括a)在反應(yīng)介質(zhì)中將人吞噬細胞和至少一個濃度的測試化合物相接觸，隨后在允許luka和lukb對吞噬細胞進行攻毒的條件下加入luka和lukb；b)將a)中的吞噬細胞與可透過細胞或不可透過細胞的檢測標記相接觸；以及c)檢測吞噬細胞攝入的透過性標記的量，將所述量作為b)中的吞噬細胞活力的函數(shù)，其中所述標記的量相對于至少一種對照增加，表明細胞活力增強且測試化合物能抑制lukab介導(dǎo)的細胞毒性，或c')檢測吞噬細胞的膜損傷，將其作為不透過性標記的量的函數(shù)，其中所述標記的量相對于至少一種對照減少，表明所述測試化合物抑制lukab介導(dǎo)的細胞毒性。

實施方式13.鑒定luka抑制劑與人吞噬細胞結(jié)合的方法，所述方法包括a)在反應(yīng)介質(zhì)中將人吞噬細胞和至少一個濃度的測試化合物相接觸，隨后在允許luka與吞噬細胞結(jié)合的條件下加入帶有可檢測標記的luka；以及b)檢測所述標記的量，將所述量作為luka與吞噬細胞結(jié)合的函數(shù)，其中所述標記的量相對于至少一種對照減少，表明所述測試化合物抑制luka與人吞噬細胞結(jié)合。

實施方式14.鑒定lukab寡聚化的抑制劑的方法，所述方法包括：a)在反應(yīng)介質(zhì)中將人吞噬細胞和至少一個濃度的測試化合物接觸，隨后在允許luka與吞噬細胞結(jié)合以及允許luka和lukb寡聚化的條件下加入luka和帶有可檢測標記的lukb；以及b)檢測所述標記的量，將所述量作為luka和lukb寡聚化的函數(shù)，其中所述標記的量相對于至少一種對照減少，表明所述測試化合物抑制luka和lukb的寡聚化。

實施方式15.鑒定人吞噬細胞膜上lukab孔洞形成的抑制劑的方法，所述方法包括：a)在反應(yīng)介質(zhì)中將人吞噬細胞和至少一個濃度的測試化合物接觸，隨后在允許luka和lukb對吞噬細胞進行攻毒的條件下加入luka和lukb；b)使luka與吞噬細胞結(jié)合，以及l(fā)uka和lukb寡聚化；將a)中的吞噬細胞與可檢測標記接觸，所述可檢測標記不可透過非攻毒的吞噬細胞；以及c)檢測吞噬細胞攝入所述標記的量，將所述量作為在吞噬細胞膜上lukab介導(dǎo)孔洞形成程度的函數(shù)，其中所述標記的量相對于至少一種對照減少，表明所述測試化合物抑制人吞噬細胞膜上的lukab孔洞形成。

實施方式16.根據(jù)實施方式13-15中任意一項所述的方法，其中所述可檢測標記是熒光染料。

實施方式17.根據(jù)實施方式16所述的方法，其中所述熒光染料選自fitc、cy3、cy5、apc和pe。

實施方式18.根據(jù)實施方式15所述的方法，其中所述可檢測標記是溴化乙錠。

實施方式19.預(yù)測金黃色葡萄球菌感染嚴重程度的方法，所述方法包括：a)通過來自感染對象的體液或組織樣品，培養(yǎng)來自所述感染對象的金黃色葡萄球菌；以及b)從培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中的luka和/或lukb進行提取和定量；其中相對于幾乎不產(chǎn)生luka和/或lukb或產(chǎn)生的量不可檢測的對照而言，檢測到b)中的luka和/或lukb存在或檢測的量相對較高，提示對象感染嚴重。

實施方式20.含有活性劑的組合物，所述活性劑包括作為藥物的以下至少一種：a)治療有效量的luka多肽，其具有seqidnos:1-14任意一個所示的氨基酸序列，或者與seqidnos:1-14任意一個所示的序列具有至少70％序列相似性的序列(“l(fā)uka”)；b)治療有效量的lukb多肽，其具有seqidnos:15-27任意一個所示的氨基酸序列，或者與seqidnos:15-27任意一個所示的序列具有至少70％序列相似性的序列(“l(fā)ukb”)；c)治療有效量的抗-luka抗體，其與luka特異性結(jié)合；以及d)治療有效量的特異性結(jié)合lukb的抗體。

工作實施例

參考如下的非限制性實施例對發(fā)明進行描述。除非另有特別說明，所有部分均按重量計。

實施例1：自然條件下重組luka和lukb的表達和純化：pmal表達系統(tǒng)

使用taq聚合酶從金黃色葡萄球菌dna中擴增luka和lukb基因，使用標準的pcr設(shè)置，退火溫度為55℃，使用的引物如下：luka引物5’-ccc-gtcgac-tta-tccttctttataaggtttattgtc-3’(seqidno:30)和5'-ccc-gaaggatttcacatcatcatcatcatcacaattcagctcataaagactctc-3’(seqidno:31)，lukb引物5’-ccccgaaggatttcacatcatcatcatcatcacaagattaattctgaaatcaaacaag-3’(seqidno:32)和5’-ccc-gtcgac-tta-tttcttttcattatcattaagtactt-3’(seqidno:33)。luka和lukb基因產(chǎn)物使用nde1和sall(newenglandbiolabs)消化并連接到pmal-c4x載體上(newenglandbiolabs)。構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到e.coli菌株dh5α中，質(zhì)粒插入情況通過測序進行確認。轉(zhuǎn)化株在terrificbroth培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)直至培養(yǎng)物的a600為～0.5，terrificbroth培養(yǎng)基中含100ug/ml氨芐西林和t0.2％的葡萄糖。6-his-標記的mbp-luka或6-his-標記的mbp-lukb的表達使用0.3mm的異丙基β-d-1-硫代半乳糖苷于16℃過夜180rpm轉(zhuǎn)速下進行誘導(dǎo)表達。

誘導(dǎo)后，通過4000rpm4℃離心20分鐘收集細胞，將其懸浮于冰冷的上柱緩沖液(columnbuffer)(20mmtris-hcl，200mmnacl和1mmedta)中，其中補充了不含edta的蛋白酶抑制劑(roche)。細菌細胞在冰上超聲1分鐘(脈沖10秒鐘)。樣品于10,000rpm4℃離心30分鐘，收集上清后上直鏈淀粉樹脂柱。用上柱緩沖液將柱洗兩次，純化后的6-his-標記的mbp-luka或6-his-標記的mbp-lukb用10等份補充了10mm麥芽糖的上柱緩沖液進行洗脫。

實施例2：重組活性luka、lukaδ10c、δ33nluka和lukb毒素的表達和純化：pet14b表達系統(tǒng)

使用vent聚合酶(newenglandbiolabs)從金黃色葡萄球菌dna中擴增luka、lukaδ10c、δ33nluka和lukb基因，使用標準的pcr設(shè)置，退火溫度為55℃，使用的引物如下：luka引物為5'-cccc-ctcgag-aattcagctcataaagactctcaag-3’(seqidno:34)和5'-cccc-ggatcc-tta-tccttctttataaggtttattgtc-3’(seqidno:35)；lukaδ10c引物為5'-cccc-ctcgag-aattcagctcataaagactctcaag(seqidno:34)和5'-cccc-ggatcc-tta-atatttatcaacgactttaactg(seqidno:36)；δ33nluka引物為5'-cccc-ctcgag-tcaacagcaccggatgatattg(seqidno:37)和5'-cccc-ggatcc-tta-tccttctttataaggtttattgtc(seqidno:35)。lukb引物為5'-cccc-ctcgag-aagattaattctgaaatcaaacaag-3’(seqidno:38)和5'-cccc-ggatcc-tta-tttcttttcattatcattaagtacttt-3’(seqidno:39)。基因產(chǎn)物使用xho1和bamh1(newenglandbiolabs)消化并連接到pet14b載體(novagen)上，將組氨酸標記的編碼序列融合到基因的5端。表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.coli菌株dh5α中，質(zhì)粒插入情況通過測序進行確認。質(zhì)粒純化后，轉(zhuǎn)化到e.coli表達菌株t7lysy/lq(newenglandbiolabs)中。

為了在變性條件下進行純化，轉(zhuǎn)化株在terrificbroth培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐西林)中于37℃生長，直至培養(yǎng)物的a600為～0.5。6-his-標記的luka或6-hislukb的表達使用0.4mmiptg在37℃、180rpm振搖條件下誘導(dǎo)3小時。誘導(dǎo)后，4000rpm4℃離心15分鐘收集菌體，然后懸浮于1xtbs(50mmtris，150mmnacl，ph7.5)中。細菌細胞在冰上超聲2分鐘(脈沖10秒鐘)。超聲后的細菌于50,000rpm超速離心30分鐘。沉淀重懸于裂解緩沖液(100mmnah2po4，10mmtris，8m尿素，ph8.0)中，并在旋轉(zhuǎn)混勻儀(rotisserie)中室溫孵育30分鐘。樣品于13,000rpm離心30分鐘，上清上ni-nta離子柱(qiagen)。柱子用沖洗緩沖液(100mmnah2po4、10mmtris、8m尿素、ph6.3)沖洗兩次，使用ph5.9和ph4.5的洗脫緩沖液(100mmnah2po4、10mmtris、8m尿素)將蛋白從柱上洗脫下來。收集含有純化蛋白的部分，純化蛋白通過sdspage測定，將其合并，在tris緩沖液(tbs；500mmtris、1.5mnacl、ph7.5)中1:1稀釋，tbs中4℃透析過夜除去尿素，并使其重新折疊。純化的6-his-標記的luka和lukb使用thermoscientificpiercebca蛋白檢測試劑盒進行定量。

為了在自然條件下進行純化，轉(zhuǎn)化株在luria-bertani肉湯培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐西林)中于37℃生長，直至培養(yǎng)物的a600為～0.5。6-his-標記的luka、6-his-標記的lukaδ10c、6-his-標記的δ33nluka或6-hislukb使用0.05-0.1mmiptg在25-30℃、220rpm振搖條件下誘導(dǎo)3小時。誘導(dǎo)后，4000rpm4℃離心15分鐘收集菌體，然后用1xtbs(50mmtris、600mmnacl、ph7.5)重懸，其中含10mm異吡唑和halt不含edta的蛋白酶抑制劑混合物(thermoscientific)。細菌細胞在冰上進行超聲。超聲后的細菌于20,000rpm超速離心20分鐘。上清與ni-nta樹脂(qiagen)在旋轉(zhuǎn)混勻儀(rotisserie)中4℃孵育1小時。樣品上柱，并使用含25mm的異吡唑的沖洗緩沖液1xtbs(50mmtris、600mmnacl、ph7.5)進行沖洗。使用50-500mm異吡唑的洗脫緩沖液1xtbs(50mmtris、600mmnacl、ph7.5)將蛋白從柱上洗脫下來。收集含有純化蛋白的部分，純化蛋白通過sdspage測定，將其合并，用1xtbs(50mmtris、150mmnacl、ph7.5)1:1進行稀釋，tbs中4℃透析過夜除去尿素。純化的6-his-標記的luka和lukb使用thermoscientificpiercebca蛋白檢測試劑盒進行定量。

實施例3：變性重組蛋白luka和lukb的表達和純化

使用vent聚合酶(newenglandbiolabs)從金黃色葡萄球菌dna中擴增luka和lukb基因，使用標準的pcr設(shè)置，退火溫度為55℃，使用的引物如下：luka引物為5’-ggg-catatg-aattcagctcataaagactctcaa-3’(seqidno:40)和5’-ccc-gtcgac-tccttctttataaggtttattgtc-3’(seqidno:41)，lukb引物為5’-ggg-catatg-aagattaattctgaaatcaaacaag-3’(seqidno:42)和5’-ccc-gtcgac-tttcttttcattatcattaagtactt-3’(seqidno:43)。luka和lukb基因產(chǎn)物使用nde1和sall(newenglandbiolabs)消化并連接到pet41b載體(novagen)上。構(gòu)建物先被轉(zhuǎn)化到dh5α細胞中，然后轉(zhuǎn)化到e.coli表達菌株er2566(newenglandbiolabs)中。轉(zhuǎn)化體在terrificbroth培養(yǎng)基(含有25ug/ml卡那霉素)中于37℃培養(yǎng)2.5小時，luka和lukb使用0.3mm的iptg在37℃、180rpm振搖條件下誘導(dǎo)表達2小時。沉淀細胞并重懸于1xtbs(500mmtris、1.5mnacl、ph7.5)，并在冰上超聲處理1分鐘(10秒脈沖)。超聲后的細菌用50,000rpm超速離心30分鐘。

為了在變性條件下純化c端6-his-標記luka和lukb，沉淀重懸于裂解液(100mmnah2po4、10mmtris、8m尿素、ph8.0)中，并在旋轉(zhuǎn)混勻儀(rotisserie)中室溫孵育30分鐘。樣品13,000rpm離心30分鐘，上清液上ni-nta柱。柱子用沖洗緩沖液(100mmnah2po2、10mmtris、8m尿素、ph6.3)沖洗兩次，使用ph5.9和ph4.5的洗脫緩沖液(100mmnah2po4、10mmtris、8m尿素)將luka和lukb從柱上洗脫下來。純化的6-his-標記的luka和lukb使用bioraddc蛋白檢測試劑盒進行定量。

實施例4：抗luka和抗lukb多克隆抗體的生產(chǎn)

在弗氏完全佐劑(fca)中乳化的變性重組luka(250μg)注射到新西蘭白兔體內(nèi)。在第21天和第49天用在弗氏完全佐劑(fca)中乳化的重組luka(125μg)對動物進行加強免疫。

在弗氏完全佐劑(fca)中乳化的變性重組lukb(250μg)注射到新西蘭白兔體內(nèi)。在第21天和第49天用在弗氏完全佐劑(fca)中乳化的重組lukb(125μg)對動物進行加強免疫。

實施例5：通過破壞細胞膜結(jié)構(gòu)的細胞毒素介導(dǎo)人類吞噬細胞殺傷主要由殺白細胞素a/b引起

所使用的細胞系

作為一個研究lukab如何靶向和殺傷人類吞噬細胞的模型，試驗使用了hl-60細胞(atccccl-240，人類早幼粒細胞細胞系)。hl-60細胞生長rpmi培養(yǎng)基(gibco)和37℃、5％co2的條件下，培養(yǎng)基中補充了10％熱滅活胎牛血清(fbs)。為了分化hl-60細胞為中性粒細胞樣細胞(pmn-hl60)，培養(yǎng)基中補充1.5％(v/v)的二甲亞砜(dmso)并生長4天。

使用的方法/試驗

細胞毒性實驗

為了評價金黃色葡萄球菌殺白細胞素ab(lukab)攻毒哺乳動物細胞后的細胞存活情況，將pmn-hl60細胞在終體積為100ul的rpmi(gibco)(補充了10％熱滅活胎牛血清(fbs))中以1×10⁵個細胞/孔的細胞密度鋪于96-孔平底組織培養(yǎng)平板(康寧)上。細胞在37℃、5％co2的條件下用20％到0.16％v/v范圍的金黃色葡萄球菌newman培養(yǎng)物濾液的2倍系列梯度稀釋液攻毒2小時，各濃度重復(fù)三份。實驗使用來自野生株的胞外蛋白和來自lukab缺陷株(突變株)的胞外蛋白。100％存活的對照中包括20％v/v的組織培養(yǎng)基(rpmi+10％熱滅活的胎牛血清)，以及20％v/v金黃色葡萄球菌生長培養(yǎng)基(rpmi+酪蛋白氨基酸)。使用0.1％v/vtritonx100作為100％細胞死亡的對照組。攻毒后，每個孔中加入10μl的celltiter(promega)并在37℃、5％co2中繼續(xù)孵育3小時。celltiter可監(jiān)測有代謝活躍的細胞(顏色變化)，死亡的細胞中沒有該特點。使用perkinelmerenvision2103multilabelreader測定492nm處的比色反應(yīng)。百分存活細胞使用如下公式進行計算：％存活率＝100x(ab492樣品-ab492tritonx)/(ab492組織培養(yǎng)基)。

膜破損實驗

測定lukab介導(dǎo)細胞毒性的一個替代性實驗是評價宿主細胞膜的完整性。為此，使用sytox綠(invitrogen)滲透性實驗。sytox綠對健康細胞不具有滲透能力，可是一旦細胞膜完整性受到破壞該染料就具有了滲透能力。在細胞內(nèi)，sytox綠可結(jié)合到dna上，并發(fā)出很強的熒光。

為了評價用lukab攻毒后或體外感染金黃色葡萄球菌后的宿主細胞的完整性，將pmn-hl60細胞在終體積為100ul的rpmi(gibco)(補充10％熱滅活胎牛血清(fbs))中以1x10⁵細胞/孔的密度鋪于96-孔平底組織培養(yǎng)平板(康寧)上。細胞既可以用20％到0.16％v/v范圍的金黃色葡萄球菌株newman培養(yǎng)物濾液的稀釋液進行攻毒，也可以使用1-100范圍的感染復(fù)數(shù)(moi)感染，試驗在5％co2，37℃條件下進行2小時，每個樣品制備三復(fù)孔。實驗使用野生株和lukab缺陷株(突變株)。背景熒光對照中包括20％v/v的組織培養(yǎng)基(rpmi+10％熱滅活的胎牛血清)，以及20％v/v金黃色葡萄球菌生長培養(yǎng)基(rpmi+酪蛋白氨基酸)。攻毒或感染后，細胞被轉(zhuǎn)移到96孔v底平板(康寧)中，并1500rpm離心5分鐘。去除上清，沉淀用100ul的pbs+sytox綠(0.1μm；invitrogen)重懸。隨后細胞被轉(zhuǎn)移到96孔凈底黑色組織培養(yǎng)物處理板(康寧)上，避光室溫孵育10分鐘。用perkinelmerenvision2103multilabelreader(激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長535nm)測定熒光。

結(jié)果

lukab靶向和殺傷人類主要吞噬細胞

用金黃色葡萄球菌株newman過濾的培養(yǎng)物上清攻毒人類主要外周血單核細胞(pbmc)(圖3a)、單核細胞、吞噬細胞、樹突狀細胞(圖3b)和多形核粒細胞(pmn)(圖3c)，這導(dǎo)致了顯著的細胞死亡，正如細胞毒性試驗(圖3a-c)所測結(jié)果。使用缺失溶血素(hla)、γ-溶血素(hlg)、殺白細胞素e/d(luked)或殺白細胞素a/b(lukab)的金黃色葡萄球菌newman的過濾培養(yǎng)物上清對這些細胞攻毒，結(jié)果表明hla-、hlg-、和luked-陰性菌株的胞外蛋白同newman野生型(wt)菌株一樣都有細胞毒性(如細胞毒性試驗所測結(jié)果)，提示newman產(chǎn)生的前述白細胞毒素都不會導(dǎo)致細胞介導(dǎo)的這些細胞的殺傷(圖3a-c)。相對的，當(dāng)細胞用newmanlukab缺陷型(δlukab)菌株的胞外蛋白攻毒時，很少觀察到細胞死亡。newmanlukab缺陷型菌株缺失的細胞毒性可以通過質(zhì)粒上的反式lukab回補(δlukab/plukab)(圖3c)。重要的是，使用純化重組蛋白luka和lukb攻毒pmn的測定結(jié)果說明，該表型完全依賴lukab。單獨的亞單位對pmn沒有表現(xiàn)出可檢查到的細胞毒性(圖3d)。相反，兩個亞單位的組合會導(dǎo)致對這些細胞產(chǎn)生顯著的、劑量依賴性的細胞毒性(圖3d)?？傊?，這些結(jié)果表明金黃色葡萄球菌靶向和殺傷人類主要吞噬細胞、保護宿主免受感染劑影響所需的關(guān)鍵性免疫細胞是由lukab引起。lukab優(yōu)先殺死人類吞噬細胞

用金黃色葡萄球菌newman菌株的過濾的培養(yǎng)物上清攻毒中性粒細胞樣細胞系(pmn-hl60)和吞噬細胞樣細胞系(thp1+pma)，可以導(dǎo)致顯著的細胞死亡，如細胞毒性試驗所示(圖3)。使用金黃色葡萄球菌wt和同型細胞毒素突變株(hla、hlgabc、luked、和lukab)的過濾的培養(yǎng)上清對這些細胞的攻毒表明，lukab是金黃色葡萄球菌能夠殺死這些細胞的原因，如細胞毒性試驗所測結(jié)果(圖4a和4b)。newmanlukab缺陷型菌株缺失的細胞毒性可以通過向newmanlukab缺陷菌株轉(zhuǎn)化表達lukab的質(zhì)粒(δlukab/plukab)而恢復(fù)(圖4c)。這一菌株的胞外蛋白對pmn-hl60細胞和thp-1+pma細胞具有極強的毒性，這也是lukab是能靶向和殺傷人類細胞的強力的葡萄球菌毒素的強有力的證據(jù)。

為了進一步排除金黃色葡萄球菌培養(yǎng)上清中其他因子的作用，使用純化的重組luka和lukb對pmn-hl60細胞進行攻毒。單獨的亞單位對pmn-hl60沒有表現(xiàn)出可檢查到的細胞毒性(圖3d)。相反，兩個亞單位的組合會導(dǎo)致對這些細胞產(chǎn)生顯著的、劑量依賴性的細胞毒性(圖3d)。除了pmn-hl60和thp-1+pma細胞，其他多種人類細胞系，包括分化出pmn-hl60的髓樣前體細胞(hl60)、分化出thp-1+pma的單核細胞祖細胞(thp-1)、淋巴細胞(hut和jurkat細胞)以及上皮細胞(293t和hepg2)也用重組lukab進行攻毒(圖4e)。這些結(jié)果表明lukab優(yōu)先靶向和殺死人類吞噬細胞，且對人類淋巴細胞或上皮細胞沒有影響。總結(jié)起來，這些結(jié)果表明lukab在金黃色葡萄球菌介導(dǎo)的吞噬細胞殺傷作用中扮演著重要角色。

lukab由臨床相關(guān)的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生

lukb多克隆抗體的免疫印跡分析表明，一系列的葡萄球菌都可產(chǎn)生lukb，包括醫(yī)院-和社區(qū)獲得性感染相關(guān)的mrsa菌株(usa300、400、和500；圖5a)。重要的是，lukb水平和這些菌株的毒性表型有關(guān)(圖5a和5b)。產(chǎn)生lukb水平比較高的菌株(例如，newman、4645、usa500、和usa300)比產(chǎn)生lukb水平較低或檢查不到的菌株(例如，usa100和usa400)，對pmn-hl60具有更高的細胞毒性(圖5b)。為了研究lukab在mrsa菌株中的作用，在臨床分離的usa型300la克隆中構(gòu)建了lukab同型突變株(圖5c)。與菌株newman相同，缺失lukab的菌株usa300的胞外蛋白比其親代菌株細胞毒性明顯更低(圖5d)。這些數(shù)據(jù)表明lukab是mrsa菌株產(chǎn)生的重要細胞毒素。

lukab破壞人類吞噬細胞細胞膜

用金黃色葡萄球菌的胞外蛋白攻毒pmn-hl60，會導(dǎo)致細胞變圓和核腫脹，其為lukab依賴的表型(圖6a)。如細胞膜破損實驗測定結(jié)果所示(圖6b和6c)，這一細胞變圓和腫脹表型同細胞膜滲透性增加是有關(guān)的。重要的是，lukab陰性菌株的胞外蛋白對細胞膜滲透性的影響很小甚至無影響，這一表型可以通過產(chǎn)生lukab的質(zhì)粒進行回補(圖6b)，而且導(dǎo)致劑量依賴型的細胞膜損傷的是重組的lukab而不是單個的毒性亞單位(圖6c)。另外，受甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(mssa)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)usa300菌株感染原代人類pmn，都能導(dǎo)致lukab依賴的細胞膜損傷(圖6d)。這一結(jié)果表明體外感染中，lukab會損傷宿主細胞膜。

通過靶向至和殺傷吞噬細胞，lukab保護金黃色葡萄球菌免受宿主殺傷作用。

金黃色葡萄球菌wt、δlukab和具有l(wèi)ukab表達質(zhì)粒的δlukab(δlukab/plukab)對pmn-hl60細胞的感染表明，在葡萄球菌-吞噬細胞相互作用過程中，lukab對于金黃色葡萄球菌擾亂吞噬細胞細胞膜的能力是必需的(圖7a)，正如膜破損實驗結(jié)果所示。重要的是，金黃色葡萄球菌過度表達lukab(δlukab/plukab)可以表現(xiàn)出比wt菌株更強的膜損傷能力(圖7a)，這表明lukab可以強效破壞宿主細胞膜。人全血(圖7b)和純化的原代人中性粒細胞(pmn；圖7c)的感染表明，lukab陰性葡萄球菌比wt菌株更容易被殺滅(圖7b和7c)。重要的是，δlukab-陰性葡萄球菌減弱的表型可以用lukab表達質(zhì)粒得到回補(圖7b和7c)。用金黃色葡萄球菌wt、δlukab、和包含lukab表達質(zhì)粒的δlukab突變株的培養(yǎng)物濾液對原代人pmn細胞的攻毒表明，lukab靶向和殺死原代人pmn細胞(圖7d)。這些數(shù)據(jù)強力表明lukab是強效的葡萄球菌細胞毒素，其通過膜擾亂靶向至和殺死pmn，因此保護了金黃色葡萄球菌免受pmn介導(dǎo)的殺傷。

lukab參與金黃色葡萄球菌體內(nèi)的發(fā)病

小鼠眼球后感染金黃色葡萄球菌，該菌包含融合了lukab啟動子的熒光素酶報告構(gòu)建子(plukab-xen1)，在腎臟膿腫中表現(xiàn)出lukab啟動子活性，其中無啟動子的報告基因(pxen1)沒有表現(xiàn)出活性(圖8a)。這些數(shù)據(jù)表明，lukab的體內(nèi)表達主要在腎臟膿腫感染模型中。另外，小鼠眼球后感染金黃色葡萄球菌wt的顯示出廣泛的腎臟定植，而缺失lukab的金黃色葡萄球菌則沒有。在lukab陰性菌株中觀察到的定植缺陷通過給予反式lukab可以恢復(fù)到wt的水平(圖8b)。這些數(shù)據(jù)一起表明，lukab是重要的葡萄球菌細胞毒素，其有助于細菌的發(fā)病機理。

聚乙二醇可以阻止lukab在靶細胞膜上形成孔洞

用重組lukab(rlukab)對pmn-hl60的攻毒表明，rluka和rlukb都能結(jié)合到靶細胞上，其通過luka和lukb特異性抗體的免疫印跡進行測定(圖9a)。6his-標記rlukab對pmn-hl60細胞的結(jié)合也使用熒光激活的細胞分選(facs)和組氨酸特異性抗體而得到確認(圖9b)。用重組蛋白攻毒后通過免疫印跡，在pmn-hl60細胞膜上也可被檢測到rlukab寡聚物，這表明lukab在靶細胞膜表面形成了高度有序的結(jié)構(gòu)(圖9c)。更重要的是，用rlukab對pmn-hl60攻毒表明，lukab在靶細胞的細胞膜上形成了溴化乙錠可滲透的孔洞，其能被聚乙二醇(peg)阻止(圖9d)，并且阻止lukab孔洞可提高細胞存活情況(圖9e)。另外，peg可特異性地阻止lukab孔洞，因為皂素在pmn-hl60細胞膜上形成孔洞不受peg阻止，這樣不能保護這些細胞免受孔洞介導(dǎo)的死亡。這些數(shù)據(jù)表明lukab孔洞可被小分子阻止，并且阻止lukab孔洞可以保護細胞免受lukab介導(dǎo)的殺傷。

α-luka多克隆抗體對金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物濾液細胞毒性的中和作用

在對pmn-hl60攻毒前，將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物濾液與從兩只兔子產(chǎn)生的不同數(shù)量的α-luka多克隆抗體預(yù)孵育，結(jié)果為培養(yǎng)物濾液毒性呈劑量依賴性降低(圖10)。當(dāng)使用免疫前血清預(yù)孵育培養(yǎng)物濾液時，沒有發(fā)現(xiàn)這種中和作用。重要的是，兩只兔子產(chǎn)生的抗體的結(jié)果相似，且抗體的中和能力隨著抗體成熟而增加，通過比較前期取血和后期取血的抗體中和作用可以觀察到這一現(xiàn)象(圖10)。這些數(shù)據(jù)表明，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物濾液的細胞毒性可以被α-luka多克隆抗體所中和。

仍能被α-luka多克隆抗體識別的無毒性luka截斷突變的鑒定

luka不同于其他的葡萄球菌白細胞毒性s亞單位，在于其在n-和c-端都有一個擴展部分。所述擴展部分在n端由33個氨基酸組成，c端由10個氨基酸組成(圖11a)。用缺少n端擴展部分的純化重組luka(rδ33nluka)和純化的rlukb一起對pmn-hl60細胞攻毒，結(jié)果對細胞表現(xiàn)出強效的細胞毒性，近乎于純化的rluka+rlukb的細胞毒性(圖11b)。然而，使用純化的缺少c端擴展部分的重組luka(rlukaδ10c)和rlukb一起對pmn-hl60攻毒，沒有表現(xiàn)出細胞毒性作用(圖11b)。這些數(shù)據(jù)表明，n端擴展部分對于luka的細胞毒性是非必要的，而c端擴展部分對于毒性是必不可少的。重要的是，中和lukab作用的α-luka多克隆抗體(圖10)，仍能識別6xhis-標記的非細胞毒性rlukaδ10c突變體，和α-his多克隆抗體相同(圖11c)。這些數(shù)據(jù)表明rlukaδ10c可被用來在體內(nèi)產(chǎn)生多克隆抗體這樣的中和抗體。因此，rlukaδ10c可被用作主動疫苗組分。

所有專利文獻和非專利文獻都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。所有這些公開在本文中都被相同程度地參考，即每個單獨的公開都被具體地或分別通過參考并入本文。

盡管本發(fā)明通過特定的實施方式進行說明，應(yīng)當(dāng)理解的是這些實施方式僅僅是本發(fā)明的原理和應(yīng)用的一個示例性說明。因此應(yīng)當(dāng)理解的是，在不脫離本發(fā)明的權(quán)利要求書中所確定的精神和范圍的情況下，可以對示例性實施方式進行多種修改，并可以設(shè)計出其他的排列方式。

序列表

<110>v·j·托雷斯

a·l·杜蒙特

<120>金黃色葡萄球菌殺白細胞素及其治療組合物和用途

<130>nyu3.0-001andnyu3.4-001

<140>待定

<141>待定

<150>us61/331,550

<151>2010-05-05

<160>49

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>351

<212>prt

<213>金黃色葡萄球菌

<220>

<221>misc_feature

<222>(63)..(63)

<223>xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(342)..(351)

<223>這些殘基對應(yīng)的氨基酸可以缺失/刪除。

<400>1

metlysasnlyslysargvalleuilealaserserleusercysala

151015

ileleuleuleuseralaalathrthrglnalaasnseralahislys

202530

aspserglnaspglnasnlyslysgluhisvalasplysserglngln

354045

lysglulysargasnvalthrasnlysasplysasnserthrxaapro

505560

aspaspileglylysasnglylysilethrlysargthrgluthrval

65707580

tyraspglulysthrasnileleuglnasnleuglnpheasppheile

859095

aspaspprothrtyrasplysasnvalleuleuvallyslysglngly

100105110

serilehisserasnleulysphegluserhislysgluglulysasn

115120125

serasntrpleulystyrproserglutyrhisvalasppheglnval

130135140

lysargasnarglysthrgluileleuaspglnleuprolysasnlys

145150155160

ileserthralalysvalaspserthrphesertyrserserglygly

165170175

lyspheaspserthrlysglyileglyargthrserserasnsertyr

180185190

serlysthrilesertyrasnglnglnasntyraspthrilealaser

195200205

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lyslys

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<212>prt

<213>金黃色葡萄球菌

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<213>金黃色葡萄球菌

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<213>金黃色葡萄球菌

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260265270

lysilelysserilethrprolys

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<212>prt

<213>金黃色葡萄球菌

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