本發(fā)明涉及食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及檢測食品中26種動物源性成分的基因微流體芯片及其應用。

背景技術(shù)：

食品中動物源性成分的鑒別是當今食品安全檢測當中的重要一環(huán)，2013年牛肉中摻雜馬肉的事件曾轟動整個歐洲，中國的市場上肉類產(chǎn)假現(xiàn)象也屢見不鮮，常有用鴨肉，雞肉等價格便宜的肉類冒充牛羊肉販賣的情況，甚至出現(xiàn)過在肉制品中摻雜被鼠藥毒死的鼠肉而引起消費者中毒的事件。這些事件嚴重擾亂了食品市場的秩序，侵害了消費者的利益，嚴重者還可能會引起民族問題破壞社會和諧。

隨著市場的不斷發(fā)展，肉類摻假的技術(shù)手段也在不斷的提高，許多拼接肉是使用三種以上的肉類拼接壓制而成的，而一些肉制品則通過摻入肉湯，油脂，添加劑等方式偽造牛羊肉的風味。另一方面，有些經(jīng)銷皮毛的不法商販將毛皮動物的肉類偽造成牛羊肉販賣，2013年山東省檢出牛羊肉中被摻混了狐貍?cè)猓粫r間造成了轟動，也使得對毛皮動物肉類的檢測成為了食品安全監(jiān)控中的重要一項。這也標志著目前肉類摻假所涉及的物種范圍更廣，僅僅檢測肉及肉制品中豬、牛、羊、雞、鴨的成分已經(jīng)不能滿足市場風險檢測的需要。目前，僅毛皮動物就包含了狐貍，水貂，鹿，兔子，駱駝等物種，若要以單個物種逐一進行基因檢測的傳統(tǒng)方法檢測需要耗費大量的時間以及人力物力，容易造成誤檢，漏檢等現(xiàn)象。

目前的物種鑒別技術(shù)主要分為蛋白質(zhì)鑒定和分子鑒定兩種。蛋白質(zhì)鑒定包括酶聯(lián)免疫分析，sds-page電泳，等電點聚焦技術(shù)等，這些方法主要依靠檢測不同物種間蛋白質(zhì)的差異來進行物種鑒別。但由于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差，遇高溫，酸、堿，及重金屬等化學制劑易變性所以不適宜做熟肉制品的鑒別分析，在使用上有比較大的局限性。相對于蛋白質(zhì)，dna具有較強的穩(wěn)定性，且中間差異大，所以在食品安全檢測領(lǐng)域較常用的方法是基于dna的分子鑒別技術(shù)，其中pcr技術(shù)以其快速靈敏特點得到了廣泛的使用。

在諸多的pcr技術(shù)中，常用于物種鑒定的有taqman探針熒光pcr技術(shù)。taqman探針熒光pcr技術(shù)是20世紀90年代誕生的的實時熒光pcr技術(shù)中的一種，是一種應用于核酸實時pcr檢測的專利技術(shù)。該技術(shù)使用根據(jù)靶標核酸設(shè)計合成的dna單鏈，并在單鏈的兩端分別偶聯(lián)上熒光報告基團和熒光淬滅基團，此結(jié)構(gòu)稱為taqman探針。相對于無差別嵌入到dna雙螺旋當中的sybr熒光染料，taqman探針具有序列特異性，只結(jié)合到互補區(qū)，而且熒光信號與擴增的拷貝數(shù)具有一一對應的關(guān)系，因此特異性強靈敏度高。而且dna在當前食品中動物源性成分的檢測標準中，有許多標準是基于taqman探針法的。雖然taqman探針法檢測的準確性較高，但是，這種方法只能針對單一物種設(shè)計探針進行檢測。食品中的肉類成分往往是復雜的，有可能存在的摻假成分也是未知的，若要檢測一個肉類產(chǎn)品中是否存在豬牛、羊、雞、鴨成分則需要經(jīng)過5次試驗才能夠?qū)崿F(xiàn)，通過這種方法對大量樣本進行檢測需要耗費檢測人員大量的時間。而對于一些未知物種的摻假，如貓肉，鼠肉，狗肉等則可能造成漏檢，從而造成一些不合格產(chǎn)品流向市場，對消費者造成危害。

生物芯片的概念由fodor等人在1991年提出(fodor.sp,readjl.1991)，是指能夠快速并行處理多個樣品并對其所包含的各種生物信息進行解剖的微型器件，在生物芯片技術(shù)中，基因芯片是建立最早，研究最成熟的。基因芯片,又稱dna微陣列(dnamicroarray)，是把大量已知序列探針集成在同一個基片(如玻片、膜)上，經(jīng)過標記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點上的探針雜交,通過檢測雜交信號,對生物細胞或組織中大量的基因信息進行分析?；蛐酒闹苽浞椒ㄖ饕袃煞N：原位合成法和點樣法.原位合成法是指將把腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)四種不同堿基的核苷酸按不同次序化學偶聯(lián)在相應的位點,原位合成序列不同的寡核苷酸探針。點樣法一般首先按常規(guī)方法制備cdna(或寡核苷酸)探針庫,然后通過特殊的微噴頭，分別把不同的探針溶液按照預先排定的順序逐點點在片基表面，并通過物理和化學作用使探針固定于基片表面。這種芯片的固相載體一般為玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等。目前，有應用醛基化玻璃片作為固相載體制作基因芯片16種動物源性成分的報道(宗卉，2011申請?zhí)枺?01110110348.2)這種方法需要先進行pcr反應，再與芯片上的探針進行雜交，最后對雜交后的芯片進行熒光掃描和數(shù)據(jù)處理，步驟多，方法繁瑣。并且在反應時將所有探針置于同一液體環(huán)境下進行反應，探針容易受到環(huán)境干擾，從而降低靈敏性和特異性。將多個探針集成芯片后其特異性往往低于單一探針。另外，這種芯片易破損，不利于長期保存。

因此，建立廣泛物種的動物源性成分檢測，對提高突發(fā)事件應急處理能力，提升食品安全風險監(jiān)測水平和監(jiān)管能力具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種同時檢測26種動物源性成分的基因微流體芯片。

本發(fā)明的另一目的在于提供利用該基因微流體芯片檢測食品中動物源性成分的方法。

本發(fā)明首先提供用于同時檢測26種動物源性成分的引物探針組合，含有32對引物和探針組合，每個組合含有2條上、下游引物和1個taqman探針，其核苷酸序列如seqidno.1-96所示，所述26種動物為豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、貓、小鼠、狗、火雞、鹿、鴿子、狐貍、水貂、駱駝、鴕鳥、兔子、鵝、狍子、馬、鵪鶉、草魚、三文魚、鱸魚、虹鱒和鯽魚。

本發(fā)明進一步提供了同時檢測26種動物源性成分的基因微流體芯片，該芯片含有32對引物和探針組合，每個組合含有2條上、下游引物和1個taqman探針，其核苷酸序列如seqidno.1-96所示，所述26種動物為豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、貓、小鼠、狗、火雞、鹿、鴿子、狐貍、水貂、駱駝、鴕鳥、兔子、鵝、狍子、馬、鵪鶉、草魚、三文魚、鱸魚、虹鱒和鯽魚。

進一步地，本發(fā)明的基因微流體芯片是384孔板結(jié)構(gòu)的實時熒光定量pcr反應板，該反應板分16列，每兩列共享一個加樣通道，每通道包含48個體積為1μl的反應腔，反應腔中包埋核苷酸序列如seqidno.1-96所示的引物和taqman探針。本發(fā)明芯片中針對每一個探針包埋了三個平行重復孔，使食品樣品在每一次試驗中進行三重平行反應，能夠提高結(jié)果的準確性。

本發(fā)明提供了上述引物探針組合或基因微流體芯片在檢測動物源性成分中的應用。

本發(fā)明提供了上述引物探針組合或基因微流體芯片在保障食品安全中的應用。

本發(fā)明提供了上述引物探針組合或基因微流體芯片在制備檢測食品中動物源性成分試劑盒中的應用。

本發(fā)明還提供了一種同時檢測26種動物源性成分的試劑盒，含有上述引物探針組合或基因微流體芯片。

本發(fā)明提供了一種同時檢測食品中動物源性成分的方法，使用本發(fā)明的上述基因微流體芯片，將待測食品的dna及pcr預混液加入基因微流體芯片的反應腔中，使用熒光定量pcr儀進行擴增，根據(jù)ct值判定結(jié)果。本發(fā)明的實施例中，使用appliedbiosystems公司的qpcrtaqman@mastermixpcr預混液。

在使用熒光定量pcr儀檢測之前，還需要對上樣后的基因微流體芯片離心進樣和封口。所述離心進樣是在離心機中，1200rpm離心1分鐘，即可完成。通過此步驟，pcr反應液均應地分配到384個pcr反應腔中。本發(fā)明實施例中使用的離心機是thermo公司生產(chǎn)的ts006445離心適配器。

在本發(fā)明的實施例中，使用quantstudio12k的實時熒光定量pcr儀器實現(xiàn)利用基因微流體芯片對動物源性成分的檢測。

進一步地，本發(fā)明方法中，其100μlpcr反應體系為：

進一步地，熒光定量pcr儀的工作程序為：50℃熱啟動2min；95℃預變性10min；95℃變性15s，60℃退火1min，40個循環(huán)。

本發(fā)明的基因微流體芯片中自帶陽性內(nèi)參(包埋動物universal引物探針，其序列如seqidno.94-96所示)，陽性質(zhì)控(將引物探針18s-hs99999901_s1，序列如seqidno.91-93所示，和陽性dna預先包埋在芯片中，用來質(zhì)控芯片效果)，在檢測中兩種對照為有效擴增時，樣本結(jié)果判斷標準如下：

ct值<30.0時樣品結(jié)果為陽性；

ct值≥30.0的樣品結(jié)果為陰性。

本發(fā)明提供的可用于26種動物源性成分檢測的基因微流體芯片及其檢測方法可以實現(xiàn)同時檢測4個樣本，并且其中每個樣本可以對上述26個物種的幾個或全部物種進行同時檢測。大大提高了動物源性成分檢測的通量。采用特異性引物對檢測樣品進行熒光標記擴增，相比使用通用引物擴增再用探針雜交的傳統(tǒng)基因芯片方法更加特異，使得檢測結(jié)果更加準確。本發(fā)明所用到的所有引物探針均為原創(chuàng)設(shè)計，以線粒體cox1基因為靶位點。線粒體普遍存在于動物細胞當中，相對于基因組，線粒體基因拷貝數(shù)高，易于檢出，并且線粒體的進化速度較慢，cox1基因保守性強，可以最大程度的保證探針不受個體變異和品種差異的影響。其中豬，牛，綿羊，雞、鴨五個物種均設(shè)計了兩組引物探針，加倍了這五個常見物種檢測的準確性。

本發(fā)明所用到的32對引物的設(shè)計均通過在ncbi數(shù)據(jù)庫中大量數(shù)據(jù)比對獲得，具有高度的種類保守性和種間特異性。本發(fā)明所設(shè)計的探針均能夠擴增出濃度為1pg的樣本dna模板，這證明了本發(fā)明所使用的探針靈敏度達到了皮克級，屬于高靈敏度探針。引物探針的擴增效率都在90％-110％之間，均能夠獲得良好的擴增曲線。

與普通10μl體系的taqmanpcr反應不同，本發(fā)明基因微流體芯片使用的是1μl反應體系。為保證探針的靈敏度不會因為反應體系的改變而改變，本發(fā)明將1μl反應體系中引物的靈敏度與擴增效率和10μl體系中引物的靈敏度與擴增效率做了比對，實驗結(jié)果證明，與10μl體系相同，在1μl體系中，32對引物的靈敏度均可達到1pg，擴增效率在90％-110％之間。獨立的1μl體系反應體系徹底避免了目前多靶標檢測方法中多對引物之間相互干擾的問題。

本發(fā)明無需在pcr反應后再進行芯片雜交，而是同時在一張384孔微流體芯片平板中進行384個獨立的pcr反應，在反應的同時記錄熒光信號值，極大地簡化了基因芯片的操作程序，提高了檢測效率。本發(fā)明通過pcr儀所讀取的熒光信號的有無和強弱判斷檢測樣品中是否含有對應于特異探針的物種。這些物種包含了常見的哺乳類動物，禽類及魚類能夠滿足對食品市場上常見肉類，經(jīng)濟魚類，及毛皮動物等動物源性成分風險監(jiān)測的需求。檢測者在拿到taqman微流體芯片時，只需加入由待檢測樣品的核酸及pcr預混液配置而成的溶液即可在一次pcr擴增過程中，完成多個樣品，多個靶標的檢測。這種芯片的優(yōu)點在于每個探針都在一個相對封閉的微環(huán)境中與樣品模板發(fā)生反應，減小了外界環(huán)境對探針效率的影響，同時也避免了探針與探針之間的相互影響，提高了芯片的特異性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明基因微流體芯片384個加樣孔的排列分布圖，其中1為加樣通道，2為反應腔。

圖2為利用本發(fā)明基因微流體芯片檢測動物源性成分的特異性實驗結(jié)果。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1引物的設(shè)計與基因微流體芯片的制備

通過三個步驟進行引物探針的設(shè)計:

1、針對26種動物為豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、貓、小鼠、狗、火雞、鹿、鴿子、狐貍、水貂、駱駝、鴕鳥、兔子、鵝、狍子、馬、鵪鶉、草魚、三文魚、鱸魚、虹鱒和鯽魚，選取線粒體上的cox1，nd1，nd2，16s等基因為靶基因，通過引物和探針分析軟件設(shè)計引物，有效地篩選出能夠在芯片同一反應條件下獲得好的擴增效率的引物探針。所得候選探針需在ncbi上進行blast分析，選擇物種間特異性最好的探針用于芯片設(shè)計。本發(fā)明設(shè)計了32對引物和對應的taqman探針，核苷酸序列分別如seqidno.1-96所示并且其中的30條探針序列的5’標記fam，3’標記tamra，另外還有2條針對牛和馬源成分檢測的探針3’標記mgb，這兩條探針的序列分別如seqidno.12和seqidno.75所示。

2、陽性物種庫的建立。獲取陽性物種的肉類樣品，并且通過基因條形碼技術(shù)對真實性進行驗證，利用通用引物對陽性物種的特定序列進行擴增，并將擴增產(chǎn)物測序，測序結(jié)果與ncbi數(shù)據(jù)庫中的物種基因信息進行比對后，證實了所得的物種的真實性，并將其作為陽性對照驗證所設(shè)計的引物探針。

3、引物擴增效率的計算。引物的擴增效率標志著引物是否能引導一個對模板以2的指數(shù)倍進行擴增的pcr反應，一個好的引物擴增效率應在90％-110％之間，過高或過低的擴增效率都不能使熒光pcr反應的結(jié)果得到一條標準的s型擴增曲線，從而影響對結(jié)果的判讀。經(jīng)過對梯度實驗結(jié)果的計算，本發(fā)明中所設(shè)計的引物探針的擴增效率都在90％-110％之間，均能夠獲得良好的擴增曲線。

4、將本發(fā)明設(shè)計的32對引物探針序列交appliedbiosystemsbylifetechnologies公司，完成引物探針包埋與固相載體的工作，制得基因微流體芯片。

本發(fā)明的基因微流體芯片是384孔板結(jié)構(gòu)的實時熒光定量pcr反應板，該反應板分16列，每兩列共享一個加樣通道，每通道包含48個體積為1μl的反應腔，如圖1所示。反應腔中包埋核苷酸序列如seqidno.1-96所示的引物和taqman探針。本發(fā)明芯片中針對每一個探針包埋了三個平行重復孔，使食品樣品在每一次試驗中進行三重平行反應，能夠提高結(jié)果的準確性。

本發(fā)明基因微流體芯片各物種引物和探針的排布情況見表1。

實施例2利用實施例1制得的基因微流體芯片檢測26種動物源性成分的方法建立

1、提取樣品dna

(1)分別取26種動物(豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨、貓、小鼠、狗、火雞、鹿、鴿子、狐貍、水貂、駱駝、鴕鳥、兔子、鵝、狍子、馬、鵪鶉、草魚、三文魚、鱸魚、虹鱒和鯽魚)的肌肉樣本0.2g，盡量剪碎。置于1.5ml離心管中加入1ml的細胞裂解緩沖液，20μl蛋白酶k(500μg/ml)，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機以12,000rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。

(2)加入等體積的酚:氯仿混合液(1:1)，振蕩混勻，12,000rpm離心10min。

(3)取上清液至另一管，加入等體積的氯仿，振蕩混勻，12,000rpm離心10min。

(4)取上清液至另一管，加入1/10體積的3mol/l乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀10min，12,000rpm離心10min。

(5)棄上清，用1ml75％乙醇洗滌沉淀，12,000rpm離心5min。

(6)重復步驟5。

(7)棄上清，將沉淀至室溫干燥5min。

(8)加50μlte或ddh2o溶解沉淀，然后置于4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、向基因微流體芯片的加樣孔中分別加入由待檢測樣品的核酸及pcr預混液配置而成的溶液，即可在一次pcr擴增過程中，完成多個樣品，多個靶標的檢測。

基因微流體芯片的工作流程分為上樣、離心進樣、封口、pcr擴增檢測四個步驟，手工操作僅需要5分鐘。

(1)上樣：將樣品核酸和pcr預混液混合后，用移液器將100μl該溶液直接加入taqman微流體芯片的加樣孔即可。每張芯片，根據(jù)定制的格式不同，可以加入1至8個樣品的反應液。100μl上樣體系為：

(2)離心進樣。將基因微流體芯片放入專用的離心適配器(thermots006445)中，在1200rpm下離心1分鐘即可完成離心進樣。通過此步驟，pcr反應液均勻地分配到384個pcr反應腔中。

(3)封口。taqman基因微流體芯片配備專用的封口器為appliedbiosystemsbylifetechnologies公司arraycardstaker/sealer，可對進樣后的芯片進行封閉處理：將芯片上各反應腔體的通路封閉，形成384個彼此獨立的反應室。把待封口的芯片按照指定朝向放入封口器，手握封口器把手，平緩地把把手由起始位置推到封口結(jié)束位置，隨后將芯片取下，用剪刀將芯片突出的加樣部分剪除即可完成對芯片的封口處理。

(4)上機運行。taqman基因微流體芯片的運行需要配合兼容的pcr模塊(block)，和熱蓋(heatcover)，發(fā)明使用儀器為quantstudio12k。

工作程序為：50℃熱啟動2min；95℃預變性10min；95℃變性15s，60℃退火1min，40個循環(huán)。

本發(fā)明的基因微流體芯片中自帶陽性內(nèi)參(包埋動物universal引物探針)，陽性質(zhì)控(將引物探針18s-hs99999901_s1和陽性dna預先包埋在芯片中，用來質(zhì)控芯片效果)，在檢測中兩種對照為有效擴增時，樣本結(jié)果判斷標準如下：

ct值<30.0時樣品結(jié)果為陽性；

ct值≥30.0的樣品結(jié)果為陰性。

將本發(fā)明的基因微流體芯片中涉及的26個物種分為4組，作為4個樣品采用本實施例的方法對上述26個物種進行檢測。擴增結(jié)束后，扣除本底熒光信號后取同一閾值分析數(shù)據(jù)，確定各樣本的ct值。實驗結(jié)果表2，目標物種ct值均<30，說明該實驗證明本試劑盒具有良好的物種特異性。

樣品一：牛+豬+綿羊+山羊+鴿子+狐貍+水貂+駱駝

樣品二：牛+雞+鴨+貓+鴕鳥+兔子+鵝+狍子

樣品三：牛+狗肉+火雞+馬+草魚+鱸魚

樣品四:鹿+虹鱒+鯽魚+鵪鶉+小鼠

實施例3特異性試驗

采用實施例2的方法對上述26個物種以及大鼠，中華草蝦，石斑魚基因組dna進行檢測，其實驗結(jié)果為：陽性質(zhì)控的ct值為24.54，陽性內(nèi)參的ct值為25.49，26個物種的ct值均小于30，大鼠、中華草蝦、石斑魚的ct值均大于30，該實驗證明本發(fā)明基因微流體芯片具有良好的物種特異性。

實施例4靈敏度試驗

為驗證本芯片的靈敏度，將實施例2得到的26個物種的基因組dna梯均度稀釋為：1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl的稀釋液，并以這些稀釋液作為陽性對照，以無核酸雙蒸水為陰性對照，利用實施例2建立的方法，驗證本發(fā)明方法的靈敏度。擴增結(jié)束后，扣除本底熒光信號后取同一閾值分析數(shù)據(jù)，確定各樣本的ct值。每個稀釋梯度設(shè)3個平行樣本，實驗結(jié)果為3個樣本ct值的平均值。實驗結(jié)果見表2。結(jié)果顯示本發(fā)明的檢測食品中各動物源性成分的熒光定量pcr方法可檢測到低于1pg的動物源性成分。說明本發(fā)明方法具有良好的靈敏度。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

sequencelisting

<110>北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心

<120>一種同時檢測26種動物源性成分的基因微流體芯片及其應用

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<400>17

gttagatctactgaggctcctgcat25

<210>18

<211>27

<212>dna

<213>綿羊cox1335probe

<400>18

tcctagcatcctctatggttgaggccg27

<210>19

<211>25

<212>dna

<213>山羊cox148p1

<400>19

attttcaaccaaccacaaagacatc25

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>山羊cox148p2

<400>20

ttcggcgcgaattagtaagc20

<210>21

<211>27

<212>dna

<213>山羊cox148probe

<400>21

caccctctaccttctgttcggtgcctg27

<210>22

<211>22

<212>dna

<213>雞cox1881p1

<400>22

cacagtcggaatggacgtagac22

<210>23

<211>26

<212>dna

<213>雞cox1881p2

<400>23

ggttgctagtcagctgaagactttaa26

<210>24

<211>26

<212>dna

<213>雞cox1881probe

<400>24

cagccacaataatcatcgccatccca26

<210>25

<211>24

<212>dna

<213>雞cox175p1

<400>25

gcacagcacttagccttctaatcc24

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>雞cox175p2

<400>26

aaagcatgggctgtgacgat20

<210>27

<211>26

<212>dna

<213>雞cox175probe

<400>27

cgcagaactaggacagcccggaactc26

<210>28

<211>27

<212>dna

<213>鴨cox11427p1

<400>28

tagtggccgtaatcatactaatgttca27

<210>29

<211>19

<212>dna

<213>鴨cox11427p2

<400>29

gcagccgtggattcactca19

<210>30

<211>27

<212>dna

<213>鴨cox11427probe

<400>30

ccttctcagccaaacggaaagtcctcc27

<210>31

<211>23

<212>dna

<213>鴨cox1313p1

<400>31

agcattcccacgaataaacaaca23

<210>32

<211>22

<212>dna

<213>鴨cox1313p2

<400>32

gttgcctgctagaggtgggtat22

<210>33

<211>30

<212>dna

<213>鴨cox1313probe

<400>33

ctcctcccaccatcattcctccttctactc30

<210>34

<211>22

<212>dna

<213>貓nd1129p1

<400>34

ctatatgcaactccgcaaagga22

<210>35

<211>22

<212>dna

<213>貓nd1129p2

<400>35

gtcggagaggctctttggtaaa22

<210>36

<211>28

<212>dna

<213>貓nd1129probe

<400>36

cggcctacttcaacctatcgcagatgct28

<210>37

<211>24

<212>dna

<213>小鼠cox11273p1

<400>37

cgccatcatattcgtaggagtaaa24

<210>38

<211>24

<212>dna

<213>小鼠cox11273p2

<400>38

ggtgtaagcatctgggtagtctga24

<210>39

<211>27

<212>dna

<213>小鼠cox11273probe

<400>39

ttcttccctcaacatttcctgggcctt27

<210>40

<211>19

<212>dna

<213>家犬nd2268p1

<400>40

ctccggccaatgggtaatc19

<210>41

<211>25

<212>dna

<213>家犬nd2268p2

<400>41

gaagtggaatggagataggcctagt25

<210>42

<211>28

<212>dna

<213>家犬nd2268probe

<400>42

tcaaaccccatcgcatccatcatgataa28

<210>43

<211>25

<212>dna

<213>火雞nd1536p1

<400>43

cactaagtaccctagccaccactca25

<210>44

<211>20

<212>dna

<213>火雞nd1536p2

<400>44

tttgtttcggcgagggtaga20

<210>45

<211>28

<212>dna

<213>火雞nd1536probe

<400>45

tctacctcatcttccccgcatgaccttt28

<210>46

<211>25

<212>dna

<213>鹿cox1390p1

<400>46

gcaggaacaggctgaactgtatatc25

<210>47

<211>26

<212>dna

<213>鹿cox1390p2

<400>47

ggagacacctgctaagtgtaaagaaa26

<210>48

<211>27

<212>dna

<213>鹿cox1390probe

<400>48

ccctctagctggcaacttagctcacgc27

<210>49

<211>18

<212>dna

<213>鴿子16s808p1

<400>49

acccaggagcgcatgcta18

<210>50

<211>21

<212>dna

<213>鴿子16s808p2

<400>50

tcgtttggctgaaggctatgt21

<210>51

<211>27

<212>dna

<213>鴿子16s808probe

<400>51

aactaggcaaatctccaaggcccgact27

<210>52

<211>22

<212>dna

<213>狐貍cox1446p1

<400>52

tggagcatcagtggaccttaca22

<210>53

<211>26

<212>dna

<213>狐貍cox1446p2

<400>53

ggcgggaggttttatattgataatag26

<210>54

<211>20

<212>dna

<213>狐貍cox1446probe

<400>54

ccctgcacctggccggagtc20

<210>55

<211>25

<212>dna

<213>貂cox1261p1

<400>55

ggaaactgactcatccctctgataa25

<210>56

<211>19

<212>dna

<213>貂cox1261p2

<400>56

cgcctgcctctaccattga19

<210>57

<211>27

<212>dna

<213>貂cox1261probe

<400>57

cggtgcacctgatatagcatttccacg27

<210>58

<211>20

<212>dna

<213>駱駝nd2427p1

<400>58

ctagcccccctctccgtact20

<210>59

<211>21

<212>dna

<213>駱駝nd2427p2

<400>59

cgcctcagcctccaactataa21

<210>60

<211>28

<212>dna

<213>駱駝nd2427probe

<400>60

taccaaatcgccccgtcaatcaatctaa28

<210>61

<211>25

<212>dna

<213>鴕鳥cox187p1

<400>61

atcacaaagacattggcaccctata25

<210>62

<211>23

<212>dna

<213>鴕鳥cox187p2

<400>62

ggttgtcctaattctgcacgaat23

<210>63

<211>22

<212>dna

<213>鴕鳥cox187probe

<400>63

agtgggcacagccctcagcctg22

<210>64

<211>17

<212>dna

<213>兔cox1997p1

<400>64

ctgcatggcggcaacat17

<210>65

<211>24

<212>dna

<213>兔cox1997p2

<400>65

aattcctgtaagaccgcctactgt24

<210>66

<211>26

<212>dna

<213>兔cox1997probe

<400>66

aaatgatcccccgctatgctctgagc26

<210>67

<211>17

<212>dna

<213>鵝cox1402p1

<400>67

gccggcacaggctgaac17

<210>68

<211>26

<212>dna

<213>鵝cox1402p2

<400>68

gtgagaagatagccaggtctactgaa26

<210>69

<211>20

<212>dna

<213>灰雁cox1402probe

<400>69

aggtgaccttgcccacgccg20

<210>70

<211>25

<212>dna

<213>狍子cytb147p1

<400>70

agcaatacattacacatccgacaca25

<210>71

<211>22

<212>dna

<213>狍子cytb147p2

<400>71

aaatattgatgctccgtttgca22

<210>72

<211>30

<212>dna

<213>狍子cytb147probe

<400>72

agcattctcctctgttactcacatctgccg30

<210>73

<211>24

<212>dna

<213>馬cox1938p1

<400>73

gacgttgacacacgagcatacttc24

<210>74

<211>21

<212>dna

<213>馬cox1938p2

<400>74

cagggtggctagtcagctgaa21

<210>75

<211>20

<212>dna

<213>馬cox1938probe

<400>75

ctatccctactggtgtaaaa20

<210>76

<211>21

<212>dna

<213>鵪鶉cox11325p1

<400>76

gctggaataccccgacgatac21

<210>77

<211>23

<212>dna

<213>鵪鶉cox11325p2

<400>77

attagggagccgattgaggatag23

<210>78

<211>30

<212>dna

<213>鵪鶉cox11325probe

<400>78

cagactacccagatgcctacacgctttgaa30

<210>79

<211>20

<212>dna

<213>草魚cox1499p1

<400>79

cctggcaggtgtgtcatcaa20

<210>80

<211>23

<212>dna

<213>草魚cox1499p2

<400>80

cagctcaaacgaagagaggtgtt23

<210>81

<211>30

<212>dna

<213>草魚cox1499probe

<400>81

acaaccattaacatgaaaccaccagccatc30

<210>82

<211>20

<212>dna

<213>三文魚cox11328p1

<400>82

cctaggcctcgcagggatac20

<210>83

<211>25

<212>dna

<213>三文魚cox11328p2

<400>83

tactaaggagacaagggatccgatt25

<210>84

<211>26

<212>dna

<213>三文魚cox11328probe

<400>84

acccggacgcctacacgctatgaaac26

<210>85

<211>20

<212>dna

<213>鱸魚cox1412p1

<400>85

ctggcactgggtggactgtt20

<210>86

<211>23

<212>dna

<213>鱸魚cox1412p2

<400>86

acaccagcaaggtgaagagagaa23

<210>87

<211>25

<212>dna

<213>鱸魚cox1412probe

<400>87

tgcaggagcatccgtcgacctaacc25

<210>88

<211>22

<212>dna

<213>虹鱒魚cox1918p1

<400>88

gacgtggacactcgtgcttact22

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<211>22

<212>dna

<213>虹鱒魚cox1918p2

<400>89

catttgattgagcctccgtgta22

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<211>28

<212>dna

<213>虹鱒魚cox1918probe

<400>90

atctgccaccatgattatcgctatcccc28

<210>91

<211>24

<212>dna

<213>鯽魚cox11479p1

<400>91

cgctaaacgagaagtgctatctgt24

<210>92

<211>23

<212>dna

<213>鯽魚cox11479p2

<400>92

aaatgctggttcctcgtatgtgt23

<210>93

<211>25

<212>dna

<213>鯽魚cox11479probe

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atgactccatggctgccctcctcct25

<210>94

<211>21

<212>dna

<213>universal-f

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<211>20

<212>dna

<213>universal-r

<400>95

agatagaaaccgacctggat20

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<211>26

<212>dna

<213>universal-probe

<400>96

ccggtctgaactcagatcacgtagga26