本發(fā)明屬于載體構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒型載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

辛德畢斯病毒(sindbisvirussinv)屬于披膜病毒科甲病毒屬，為甲病毒屬的代表株，是由吸血的蚊蟲(chóng)等傳播的蟲(chóng)媒病毒，可引起“辛德畢斯綜合熱”，表現(xiàn)為發(fā)熱、倦怠、頭痛、關(guān)節(jié)痛和皮疹等，可自愈。

辛德畢斯病毒宿主廣泛，然而基因治療要求該病毒具有靶向性，對(duì)此，ohno等構(gòu)建了在刺突蛋白上嵌合有金黃色葡萄球菌蛋白a的sinv載體，該載體的靶向性可以通過(guò)改變針對(duì)各種細(xì)胞的igg來(lái)實(shí)現(xiàn)。由于sinv具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用及高效的外源基因表達(dá)能力，使其特別適用于癌癥基因治療。

辛德畢斯病毒載體的研發(fā)時(shí)間雖不長(zhǎng)，但因?yàn)槠渚哂懈弑磉_(dá)量，感染性強(qiáng)，安全性較好等特點(diǎn)而被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

辛德畢斯病毒載體主要用于腫瘤的靶向治療，辛德畢斯病毒持續(xù)性表達(dá)的構(gòu)建為該病毒載體在基因治療中的應(yīng)用開(kāi)辟了新道路。

辛德畢斯病毒作為疫苗載體的研究已在流感疫苗的研制方面取得較好的效果，它克服了核酸疫苗的缺點(diǎn)，是理想、安全、有效的疫苗載體。

常規(guī)的辛德畢斯病毒載體主要由一個(gè)主載體psinrep5和一個(gè)輔助載體dh-bb構(gòu)成。主載體psinrep5是一種能自我復(fù)制但不能自我包裝的復(fù)制子，該復(fù)制子不能編碼蛋白，沒(méi)有感染能力，需要輔助載體dh-bb表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白才能包裝病毒顆粒。在使用前需要將主載體和輔助載體分別體外轉(zhuǎn)錄成rna，然后再共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，此操作過(guò)程比較繁瑣而且rna不好保存，費(fèi)用較大，限制了它的推廣應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒型載體及其構(gòu)建方法，利用該載體能直接將dna轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，使表達(dá)外源基因的病毒載體的操作大大簡(jiǎn)化，既可以用于基因表達(dá)，也可以對(duì)其它病毒進(jìn)行改造，具有操作簡(jiǎn)單、安全性好、避免了重組野病毒的出現(xiàn)，成本較低、便于推廣應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒型載體，其為利用主載體psinrep5、輔助載體dh-bb和esp啟動(dòng)子構(gòu)建成的表達(dá)載體psinrep5-db-esp。

構(gòu)建所述辛德畢斯病毒的全長(zhǎng)質(zhì)粒型載體的方法，包括如下步驟：

1)設(shè)計(jì)esp引物

根據(jù)pegfp-esp質(zhì)粒上的esp啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并引入saci酶切位點(diǎn)；

2)pcr擴(kuò)增

以pegfp-esp質(zhì)粒為模板，步驟1)設(shè)計(jì)的引物對(duì)為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；

3)將esp啟動(dòng)子導(dǎo)入辛德畢斯病毒表達(dá)載體

用內(nèi)切酶saci分別對(duì)psinrep5質(zhì)粒和步驟2)的esppcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，再將酶切片段用連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中克隆培養(yǎng)，并進(jìn)行saci酶切鑒定，獲得表達(dá)載體psinrep5-esp；

4)插入結(jié)構(gòu)基因

根據(jù)dh-bb的結(jié)構(gòu)蛋白基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引入apaⅰ酶切位點(diǎn)，以dh-bb質(zhì)粒為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，用內(nèi)切酶apaⅰ分別對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白基因pcr產(chǎn)物和psinrep5-esp質(zhì)粒進(jìn)行酶切，再將酶切片段用連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中克隆培養(yǎng)，并進(jìn)行apaⅰ酶切鑒定，獲得辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒載體psinrep5-db-esp。

進(jìn)一步，步驟1)中的引物對(duì)具體序列如下：

esp-f：5'-catccgagctcatgcattagttattaatagtaatcaattac-3'；

esp-r：5'-gcatcgagctccggtccgtaggcacgtct-3'。

進(jìn)一步，步驟2)中的pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系中各物質(zhì)的終濃度為：pegfp-esp質(zhì)粒模板0.1-10ng，mgso40.6-2mm，dntp50-200μm，引物esp-f、esp-r各0.5-2μm，kod酶1.0u-1.5u。

優(yōu)選地，步驟2)中，pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25μl，含有：濃度為0.01μg/μl的pegfp-esp質(zhì)粒模板0.5μl，10×buffer2.5μl，濃度為25mm的mgso42μl，濃度為2mm的dntp2.5μl，濃度為10μm的引物esp-f、esp-r各1μl，濃度為1.0u/μl的kod酶1μl，ddh2o補(bǔ)足至總體積25μl。

又進(jìn)一步，步驟4)中，dh-bb的結(jié)構(gòu)蛋白基因的引物對(duì)具體序列為：

dh-structure-f：5'-gaacatgggcccatgaatagaggattctttaacatgc-3'；

dh-structure-r：5'-gaacatgggcccggggcgtagcggtcatcttcg-3'。

進(jìn)一步，步驟4)中的pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系中各物質(zhì)的終濃度為：dh-bb質(zhì)粒模板0.1-10ng，mgso40.6-2mm，dntp50-200μm，引物dh-structure-f和dh-structure-r各0.5-2μm，kod酶1.0u-1.5u。

優(yōu)選地，步驟4)中，pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25μl，含有：濃度為0.01μg/μl的dh-bb質(zhì)粒模板0.5μl，10×buffer2.5μl，濃度為25mm的mgso42μl，濃度為2mm的dntp2.5μl，濃度為10μm的引物dh-structure-f和dh-structure-r各1μl，濃度為1.0u/μl的kod酶1μl，ddh2o補(bǔ)足至總體積25μl。

進(jìn)一步，步驟3)和步驟4)中所述的連接酶為t4連接酶。

本發(fā)明所述所述辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒載體應(yīng)用于在疫苗載體、基因表達(dá)或?qū)Σ《具M(jìn)行改造。

辛德畢斯病毒載體是rna復(fù)制子載體，要想改造成dna質(zhì)粒載體，需要插入真核啟動(dòng)子序列。啟動(dòng)子對(duì)外源基因的表達(dá)水平影響很大，是表達(dá)載體的一個(gè)重要組成部分，根據(jù)啟動(dòng)子的基因結(jié)構(gòu)，本發(fā)明采用強(qiáng)啟動(dòng)子esp，強(qiáng)啟動(dòng)子esp利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)天然的的ii類(lèi)rna聚合酶來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄，無(wú)需體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程制備rna，即可將dna直接轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。由此，本發(fā)明先構(gòu)建由esp強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控的辛德畢斯病毒質(zhì)粒載體psinrep5-esp。

通過(guò)對(duì)輔助載體dh-bb質(zhì)粒的組成元素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)基因可以編碼4個(gè)用于包裝重組rna的結(jié)構(gòu)蛋白，因此，本發(fā)明將輔助載體dh-bb質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)基因插入到構(gòu)建好的辛德畢斯病毒質(zhì)粒載體psinrep5-esp中，獲得辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒載體psinrep5-db-esp。此載體既能自我復(fù)制又能自我包裝，簡(jiǎn)化了辛德畢斯病毒載體組成元素，也使操作簡(jiǎn)單化。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

利用本發(fā)明的全長(zhǎng)質(zhì)粒型辛德畢斯病毒載體psinrep5-db-esp，不必先將主載體psinrep5和輔助載體dh-bb分別體外轉(zhuǎn)錄成rna，再共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，而是能直接將dna轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，大大簡(jiǎn)化了表達(dá)外源基因的病毒載體的操作。

利用本發(fā)明的辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒載體，既可以做基因表達(dá)也可以對(duì)其它病毒進(jìn)行改造，具有操作簡(jiǎn)便、成本較低、便于推廣應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，有利于推進(jìn)辛德畢斯病毒載體作為疫苗載體的應(yīng)用范圍，為新型疫苗載體的研發(fā)提供了新的思路。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中esp基因pcr產(chǎn)物電泳圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中psinrep5-esp菌落pcr篩選結(jié)果，其中，m：dnamakerdl2000，1、2：菌落pcr產(chǎn)物。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中dh-bb機(jī)構(gòu)蛋白基因的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中，m：dnamakerdl2000，1：dh-bb結(jié)構(gòu)蛋白基因pcr產(chǎn)物。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中psinrep5-dh-esp酶切鑒定結(jié)果，其中，m：dnamakerd15000，1：psinrep5-dh-esp質(zhì)粒酶切。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中prrsv—gp5-m復(fù)合基因的pcr產(chǎn)物電泳圖，其中，1：prrsv-gp5-m復(fù)合基因的pcr產(chǎn)物，m：dnamakerdgl2000。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中psinrep5-db-esp-gp5酶切鑒定結(jié)果圖，其中，m：dnamakerd15000，1：psinrep5-db-esp-gp5質(zhì)粒酶切。

圖7-圖8為本發(fā)明實(shí)施例2中免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，圖7為psinrep5-db-esp-gp5轉(zhuǎn)染后免疫熒光結(jié)果，圖8為陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

大腸埃希氏菌(e.coli)種top10、bhk21細(xì)胞、真核表達(dá)載體psinrep5質(zhì)粒、輔助載體dh-bb質(zhì)粒和pegfp-esp質(zhì)粒均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所病毒課題組提供。

本實(shí)施例中的pegfp-esp質(zhì)粒由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所禽病室所構(gòu)建與保存(參照授權(quán)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利zl201010154777.5)。

小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自上海嘉儀生物有限公司，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine^tm2000購(gòu)自上海碩盟生物科技有限公司。

rtaqdna聚合酶、pfu酶、t4連接酶、dnamarkerdl2000、dnamarkerdl10000均購(gòu)自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。

實(shí)施例1構(gòu)建辛德畢斯病毒的全長(zhǎng)質(zhì)粒型載體psinrep5-db-esp

1.構(gòu)建esp強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控的辛德畢斯病毒質(zhì)粒載體psinrep5-esp

1)設(shè)計(jì)esp引物

根據(jù)pegfp-esp質(zhì)粒上的esp啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，使能擴(kuò)增esp啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列，并引入saci酶切位點(diǎn)，序列如下，斜體為酶切位點(diǎn)。

esp-f：5'-catccatgcattagttattaatagtaatcaattac-3'；

esp-r：5'-gcatcccggtccgtaggcacgtct-3'；

其中，斜體部分為酶切位點(diǎn)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2)pcr擴(kuò)增

以pegfp-esp質(zhì)粒為模板，步驟1)的引物對(duì)為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，最后取pcr產(chǎn)物8μl在1.0％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。

其中，pcr反應(yīng)體系：pegfp-esp質(zhì)粒模板(0.01μg/μl)0.5μl，10×buffer(buffer中無(wú)mg²⁺)2.5μl，mgso4(25mm)2μl，dntp(2mm)2.5μl，引物esp-f和esp-r(10μm)各1μl，kod酶(1.0u/μl)1μl，ddh2o14.5μl，總體積25μl；在冰上混合。

pcr反應(yīng)條件：95℃5min，94℃45s，56℃30s，68℃60s，35個(gè)循環(huán)，68℃再延伸10min。

電泳擴(kuò)增結(jié)果參見(jiàn)圖1，由圖1可見(jiàn)，以pegfp-esp質(zhì)粒為模板擴(kuò)增esppcr產(chǎn)物長(zhǎng)度約689bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

3)將esp啟動(dòng)子導(dǎo)入辛德畢斯病毒表達(dá)載體

用內(nèi)切酶saci分別對(duì)psinrep5質(zhì)粒和步驟2)的esppcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切，回收酶切后的目的片段，用t4連接酶連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞e.colitop10。之后進(jìn)行菌落pcr篩選，由圖2可以看出，所得到片段大小與esp基因相符，證明已篩選出陽(yáng)性克隆。

對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行大量培養(yǎng)后，抽提質(zhì)粒并進(jìn)行saci酶切鑒定，鑒定正確的克隆命名為psinrep5-esp，此菌落經(jīng)lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后送往北京六合華大基因科技股份有限公司上海分公司測(cè)序。

2.插入結(jié)構(gòu)基因

1)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)dh-bb的結(jié)構(gòu)蛋白基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引入apaⅰ酶切位點(diǎn)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列如下：

dh-structure-f：5'-gaacatgggcccatgaatagaggattctttaacatgc-3'；

dh-structure-r：5'-gaacatgggcccggggcgtagcggtcatcttcg-3'。

2)pcr擴(kuò)增

以dh-bb質(zhì)粒為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)體系：dh-bb質(zhì)粒模板(0.01μg/μl)0.5μl，10×buffer(buffer中無(wú)mg²⁺)2.5μl，mgso4(25mm)2μl，dntp(2mm)2.5μl，引物dh-structure-f和dh-structure-r(10μm)各1μl，kod酶(1.0u/μl)1μl，ddh2o14.5μl，總體積25μl；在冰上混合。

pcr反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，58℃退火30s，68℃延伸90s，循環(huán)30次，最后68℃延伸10min。

取7μl擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠中100v電壓電泳30-40min，用紫外燈凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察擴(kuò)增條帶，參見(jiàn)圖3，由圖3可見(jiàn)，擴(kuò)增出的pcr產(chǎn)物大小約3735bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

3)將結(jié)構(gòu)基因?qū)雙sinrep5-sep質(zhì)粒

用內(nèi)切酶apaⅰ分別對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白基因pcr產(chǎn)物和psinrep5-sep質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收酶切后的目的片段，用t4連接酶連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞e.colitop10，之后進(jìn)行菌落pcr篩選，篩選出的陽(yáng)性克隆對(duì)其大量培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒并進(jìn)行apaⅰ酶切鑒定，酶切鑒定結(jié)果參見(jiàn)圖4。

由圖4可見(jiàn)，酶切得到大約9.95kb和3735bp大小的2個(gè)片段，分別與載體和去掉核定位信號(hào)區(qū)dh-bb結(jié)構(gòu)蛋白基因長(zhǎng)度一致，說(shuō)明辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒載體psinrep5-db-esp構(gòu)建成功，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

實(shí)施例2驗(yàn)證辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒型載體的功能

通過(guò)對(duì)prrsv各基因結(jié)構(gòu)分析后，選擇gp5-m復(fù)合基因作為外源基因，對(duì)辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒型載體的功能進(jìn)行驗(yàn)證，具體如下：

1.prrsv-gp5基因引物的設(shè)計(jì)與合成及prrsv總rna的提取

根據(jù)genebank上公布的gp5-m基因序列設(shè)計(jì)引物，并引入xbai，stui及kozak序列，標(biāo)記為gp5-f、gp5-r，引物序列如下：

gp5-f：5'-cacctctagagccaccatgttggggaagtgcttgaccg-3'；

gp5-r：5'-gcataggccttcgaggctgcttgccgttgttat-3'；

引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

按照trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行prrsv總rna的提取。

2.rt-pcr反應(yīng)

首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從rna反轉(zhuǎn)錄合成cdna，再以cdna為模板，pcr擴(kuò)增合成目的片段。

反轉(zhuǎn)錄體系：3μl提取的病毒rna，1μldntpmixture(10mmol/l)，gp5-r1μl(10μmol/l)，在冰上混合后65℃5min，冰上急冷2min。繼續(xù)加入2μl5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(primescriptreversetranscriptasebuffer)，0.5μlrnase抑制劑，0.5μl反轉(zhuǎn)錄酶(primescriptreversetanscriptase)(5u/μl)，2μldepc處理水。

在冰上混合后，42℃1h后再75℃處理5min。

pcr反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄模板3μl，10×kodbf(含mg²⁺)5μl，dntp(2mm)5μl，引物gp5-f、gp5-r(10μm)各1.5μl，東洋紡的kod-plus酶2μl，最后加入ddh2o至總體積50μl。

pcr反應(yīng)條件：95℃5min，94℃45s，56℃30s，68℃60s，35個(gè)循環(huán)，68℃再延伸10min。最后取pcr產(chǎn)物8μl在1.0％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳圖參見(jiàn)圖5。

由圖5可見(jiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小為1138bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

3.將prrsvgp5-m基因引入辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒載體

用xbai，stui分別對(duì)prrsvgp5-m基因的pcr產(chǎn)物和psinrep5-db-esp質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收酶切后的目的片段，用t4連接酶連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colitop10。之后進(jìn)行菌落pcr篩選，篩選出的陽(yáng)性克隆對(duì)其大量培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒并進(jìn)行xbai，stui雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果參見(jiàn)圖6。

由圖6可知，雙酶切所得片段與預(yù)期一致，說(shuō)明外源基因已成功插入辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒載體內(nèi)。

鑒定正確的克隆命名為psinrep5-db-esp-gp5，此菌落經(jīng)lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后送往北京六合華大基因科技股份有限公司上海分公司測(cè)序。

4.體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染及免疫熒光試驗(yàn)(ifa)

將導(dǎo)入gp5-m5基因的辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒載體psinrep5-db-esp-gp5質(zhì)粒純化后利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染bhk21細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后48h的上清液，將此上清液感染marc-145細(xì)胞，培養(yǎng)24～36h后，將上清棄掉，用pbs洗兩次，用于免疫熒光檢測(cè)，丙酮固定，一抗二抗孵育后，熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可以看出，psinrep5-db-esp-gp5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后36h，可以檢測(cè)出特異性熒光，且熒光亮度較強(qiáng)，說(shuō)明gp5基因得到了表達(dá)。

<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>一種辛德畢斯病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒型載體及其構(gòu)建方法

<130>1711163

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>seqidno.1

<211>14376

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

attgacggcgtagtacacactattgaatcaaacagccgaccaattgcactaccatcacaa60

tggagaagccagtagtaaacgtagacgtagacccccagagtccgtttgtcgtgcaactgc120

aaaaaagcttcccgcaatttgaggtagtagcacagcaggtcactccaaatgaccatgcta180

atgccagagcattttcgcatctggccagtaaactaatcgagctggaggttcctaccacag240

cgacgatcttggacataggcagcgcaccggctcgtagaatgttttccgagcaccagtatc300

attgtgtctgccccatgcgtagtccagaagacccggaccgcatgatgaaatacgccagta360

aactggcggaaaaagcgtgcaagattacaaacaagaacttgcatgagaagattaaggatc420

tccggaccgtacttgatacgccggatgctgaaacaccatcgctctgctttcacaacgatg480

ttacctgcaacatgcgtgccgaatattccgtcatgcaggacgtgtatatcaacgctcccg540

gaactatctatcatcaggctatgaaaggcgtgcggaccctgtactggattggcttcgaca600

ccacccagttcatgttctcggctatggcaggttcgtaccctgcgtacaacaccaactggg660

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