本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種用于鑒別煙曲霉的專用引物、探針和基因芯片。
背景技術(shù)：
：乳制品是一種營養(yǎng)豐富，容易被消化和吸收的天然食品，隨著人們生活水平的提高，已經(jīng)成為生活中常見的食品。但是營養(yǎng)豐富的乳制品也是各種微生物青睞的溫床，這導(dǎo)致乳制品的貨架期非常有限，比如經(jīng)巴氏滅菌的乳制品保質(zhì)期一般不超過7天（巴氏鮮奶占全球液態(tài)奶70%的市場份額），近些年市場占有量越來越大的發(fā)酵酸奶，其保質(zhì)期一般也只有21天。另一方面，國家《食品安全法》和《企業(yè)生產(chǎn)乳制品許可條件審查細(xì)則（2010版）》中明確要求企業(yè)必須對所生產(chǎn)、加工的乳制品進(jìn)行出廠前微生物檢驗(yàn)，包括5種指示菌和5種致病菌的檢測。目前乳制品企業(yè)基本都是采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法來檢測微生物，這種方法的檢測周期一般在3-4天左右，但是有些致病菌不能僅憑菌落形態(tài)來判定，需要配合其他生化反應(yīng)試驗(yàn)做進(jìn)一步鑒定，這無疑又增加了檢測周期。因此，較長的檢測周期（完成國標(biāo)要求檢測的10種微生物需要5-6天）和較短乳制品保質(zhì)期（營養(yǎng)物質(zhì)沒有被破壞的巴氏滅菌乳制品的貨架期只有7天）之間形成了矛盾，這一矛盾已成為制約乳制品企業(yè)發(fā)展的重要瓶頸，也成為制約市場終端能獲取到營養(yǎng)最全面乳制品的重要因素?；蛐酒莇na識別技術(shù)的一種體現(xiàn)，利用芯片高通量的優(yōu)勢，可以在一張芯片上同時(shí)對多個(gè)物種的多個(gè)dna條形碼進(jìn)行檢測，不僅極大地提高了鑒定的準(zhǔn)確性，而且還大大縮短了檢測周期，即利用基因芯片可以在短時(shí)間內(nèi)對多種微生物類型進(jìn)行檢測。為了解決乳制品中微生物檢測所存在的上述問題，本發(fā)明研發(fā)了一種利用生物技術(shù)對煙曲霉進(jìn)行檢測的技術(shù)方案。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種煙曲霉特異性its分子標(biāo)記，以建立一種快速、靈敏、特異性好的煙曲霉鑒別方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述鑒別方法使用的專用探針和引物。本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，并結(jié)合基因芯片技術(shù)，首先獲得了煙曲霉itsdna片段中一段高度保守且特異性強(qiáng)的核酸序列，以作為特異性鑒別煙曲霉的分子標(biāo)記；進(jìn)而依據(jù)該分子標(biāo)記設(shè)計(jì)并合成了一組特異性引物和核酸探針，建立了特異性鑒別煙曲霉的方法，并對所建立的方法進(jìn)行了有效性評估試驗(yàn)。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明所提供的煙曲霉its特異性分子標(biāo)記的核苷酸序列如seqidno.1所示。本發(fā)明根據(jù)上述靶序列，依據(jù)引物與探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了一對具有seqidno.3和seqidno.4所述核苷酸序列的、用于擴(kuò)增所述its特異性分子標(biāo)記的引物，以及一種具有seqidno.7所述核苷酸序列的、用于檢測所述its特異性分子標(biāo)記的核酸探針。更具體地，本發(fā)明是在引物1的5'端作為修飾位點(diǎn)，最終人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探針：引物1:5’cy3—ctgcggaaggatcattaccgag—3’。引物2：5’—tcctctcctggcctattgatatg—3’。核苷探針：5’nh3—ttttttttttggaaccaagagatccgttgttgaaag—3’。本發(fā)明還提供了一種用于檢測煙曲霉的基因芯片。本發(fā)明所述的基因芯片采用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，并在所述基因芯片上固定有，在所述基因芯片上固定有seqidno.7所述的核酸探針。所述基因芯片采用的片基優(yōu)選常規(guī)的醛基片基，以與所述氨基化的探針配合。本發(fā)明也提供了一種用于鑒別煙曲霉的裝置，所述的裝置為試劑盒，在所述試劑盒中至少包含有上述的煙曲霉檢測用基因芯片或核酸探針，用于擴(kuò)增本發(fā)明所述煙曲霉its特異性分子標(biāo)記的專用引物和pcr擴(kuò)增試劑，以及其他必要的相關(guān)試劑。最后，本發(fā)明提供了一種鑒別煙曲霉的方法，本發(fā)明所述方法是利用上述煙曲霉its特異性分子標(biāo)記對煙曲霉進(jìn)行鑒定，利用pcr方法獲得的煙曲霉擴(kuò)增產(chǎn)物中應(yīng)包含有seqidno.1所示的核苷酸序列。具體地，本發(fā)明所述鑒別煙曲霉的方法包括：a)提取待檢測樣本的基因組總dna；b)以權(quán)利要求2所述引物對所述提取的總dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；c)將所述pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與權(quán)利要求3所述的核酸探針進(jìn)行原位雜交，以特異性鑒定出所述待檢測樣本中是否含有煙曲霉。進(jìn)一步地，本發(fā)明所提供的煙曲霉abrⅱ的核苷酸序列如seqidno.2所示。本發(fā)明根據(jù)上述靶序列，依據(jù)引物與探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了一對具有seqidno.5和seqidno.6所述核苷酸序列，以及一種具有seqidno.8所述核苷酸序列的核酸探針。更具體地，本發(fā)明是在引物1的5'端作為修飾位點(diǎn)，最終人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探針：引物1:5’cy3—cttccttgcttggtgtcgctgc—3’。引物2：5’—tgaaccggtccataaagtccg—3’。核苷探針：5’nh3—ttttttttttttgccacagtgcactattccctcgacctg—3’。本發(fā)明還提供了一種用于檢測煙曲霉的基因芯片。本發(fā)明所述的基因芯片采用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，并在所述基因芯片上固定有上，在所述基因芯片上固定有seqidno.8所述的核酸探針。所述基因芯片采用的片基優(yōu)選常規(guī)的醛基片基，以與所述氨基化的探針配合。最后，本發(fā)明提供了一種鑒別煙曲霉的方法，步驟為：a)提取待檢測樣本的基因組總dna；b)以權(quán)利要求5所述引物對所述提取的總dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；c)將所述pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與權(quán)利要求6所述的核酸探針進(jìn)行原位雜交，以特異性鑒定出所述待檢測樣本中是否含有煙曲霉。本發(fā)明上述方法中，所述基因組總dna提取、pcr擴(kuò)增、原位雜交的方法也都是常規(guī)的。本發(fā)明pcr反應(yīng)條件為：42℃保溫30min，95℃預(yù)變性3min，重復(fù)95℃變性30sec，55℃復(fù)性30sec，72℃延伸30sec這變性—復(fù)性—延伸三個(gè)過程36個(gè)循環(huán)，最后在72℃保溫5min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）準(zhǔn)確性：基于dna和rna的檢測，結(jié)果更可靠；（2）時(shí)效性：相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定耗時(shí)3-4天，本發(fā)明只需要6小時(shí)即可完成對乳制品感染微生物的鑒定；（3）可靠性：每種污染微生物設(shè)計(jì)兩個(gè)檢測靶點(diǎn)，提供了檢測的準(zhǔn)確性。附圖說明圖1是煙曲霉鑒定結(jié)果圖。圖中：cl-its為羅倫氏隱球酵母的its檢測位點(diǎn)，cl-rpbⅰ為羅倫氏隱球酵母的rpbⅰ基因檢測位點(diǎn)；圖中af-its為煙曲霉的its檢測位點(diǎn)，af-abrⅱ為煙曲霉的abrⅱ基因檢測位點(diǎn)；圖中rg-its為粘紅酵母的its檢測位點(diǎn)，rg-tubb為粘紅酵母的tubb基因檢測位點(diǎn)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上對本發(fā)明作出的各種改動或修改，均應(yīng)同樣落于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。下述實(shí)施例所用方法如無特殊說明，均按照常規(guī)方法和條件進(jìn)行，或按照商品說明書選擇。所用引物、核酸探針和所用序列測定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。實(shí)施例1靶序列的確定根據(jù)報(bào)道的煙曲霉基因序列，選擇以下序列作為檢測的靶序列。煙曲霉its：ctgcggaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtaggcccggccggcgccagccgacacccaactttatttttctaaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataggccaggagaggaa煙曲霉abrⅱ：cttccttgcttggtgtcgctgcggtcgcccaagcagccacagtgcactattccctcgacctgacatgggaaacaggcagtccgaatggtgtcagccgggagatgatctttgtcaacggtcagtttcccggtccagccatcattctcaacgagggcgacgaggcgattgtaagtatatggcagcatggcagcatagaaagatcgggatactgatttagtagattgacgtcaccaaccacttgccattcaacacatccatccactttcacggcatcgagtaagtgctttcctgccaggggatgacagatctgacgtggtatagacagaaaaataccccgtgggccgacggagttgtcggtctctcgcaatgggccattcagcccggccaatcctacacctaccaatggcgagcagatacttatgggacttattggtaagcttgtttctcaaaatgtatctccaagctaacgtctcaggtaccatgctcatgacaaggctgaaattatggacggactttatggaccggttcatatcag經(jīng)過同源性比對檢索后，確定所選取的靶序列為特異性較高的dna序列，可以作為基因芯片檢測的靶序列。實(shí)施例2引物與探針的設(shè)計(jì)和合成靶序列確定后，根據(jù)引物與探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物與探針如下：煙曲霉its：引物1:5’cy3—ctgcggaaggatcattaccgag—3’。引物2：5’—tcctctcctggcctattgatatg—3’。核苷探針：5’nh3—ttttttttttggaaccaagagatccgttgttgaaag—3’。煙曲霉abrⅱ：引物1:5’cy3—cttccttgcttggtgtcgctgc—3’。引物2：5’—tgaaccggtccataaagtccg—3’。核苷探針：5’nh3—ttttttttttttgccacagtgcactattccctcgacctg—3’。經(jīng)過同源性比對檢索后，確定所選取的靶序列為一段特異性較高的dna序列，可以作為基因芯片檢測的靶序列。實(shí)施例3模板提取將2ml乳品置于-80℃速凍15min，取出后置于研磨中，在液氮環(huán)境下將其整體研磨成粉末狀，用ctab方法提取粉末中的核酸。實(shí)施例4rt-pcr擴(kuò)增及熒光標(biāo)記用已經(jīng)熒光標(biāo)記的引物對所提取的模板進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增，采用天根生化科技有限公司的一步法rt-pcr進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：成分用量2×rt-pcrmastermix25μl25×rt-pcrenzymemix2μl模板3μl引物1（cy3標(biāo)記5’端）10pm1.0μl引物210pm0.8μlddh2o補(bǔ)充至50μlpcr反應(yīng)條件為：42℃保溫30min，95℃預(yù)變性3min，重復(fù)95℃變性30sec，55℃復(fù)性30sec，72℃延伸30sec這變性—復(fù)性—延伸三個(gè)過程36個(gè)循環(huán)，最后在72℃保溫5min。實(shí)施例5芯片制備將氨基化的探針按一定濃度點(diǎn)在醛基片基上，室溫放置過夜，先后用洗脫液?。?×ssc,1%sds）、洗脫液ⅱ(0.25×ssc,1%%sds)各洗脫5min，將沒有固定上的探針洗脫掉，然后離心甩干備用。分子雜交：將pcr產(chǎn)物與制備好的芯片進(jìn)行原位雜交，在42℃下保持40min，用洗脫液?。?×ssc,1%sds）、洗脫液ⅱ(0.25×ssc，1%sds)各洗脫5min。結(jié)果分析：用激光共聚焦掃描儀檢測雜交結(jié)果，結(jié)果參如圖1所示。序列表〈110〉山西維爾生物乳制品有限公司〈120〉一種鑒別煙曲霉的探針、引物和基因芯片〈160〉4〈170〉patentinversion3.2〈210〉1〈211〉589〈212〉dna〈213〉煙曲霉its〈400〉1ctgcggaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtcc40aacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcg80ggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgccc120ccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgt160tctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagtt200aaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatg240aagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcaga280attcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccc320cctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgc360tgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccc400tctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgc440gtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctg480taggcccggccggcgccagccgacacccaactttattttt520ctaaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaac560ttaagcatatcaataggccaggagaggaa589〈210〉2〈211〉535〈212〉dna〈213〉煙曲霉abrⅱ〈400〉2cttccttgcttggtgtcgctgcggtcgcccaagcagccacagtgcactat50tccctcgacctgacatgggaaacaggcagtccgaatggtgtcagccggga100gatgatctttgtcaacggtcagtttcccggtccagccatcattctcaacg150agggcgacgaggcgattgtaagtatatggcagcatggcagcatagaaaga200tcgggatactgatttagtagattgacgtcaccaaccacttgccattcaac250acatccatccactttcacggcatcgagtaagtgctttcctgccaggggat300gacagatctgacgtggtatagacagaaaaataccccgtgggccgacggag350ttgtcggtctctcgcaatgggccattcagcccggccaatcctacacctac400caatggcgagcagatacttatgggacttattggtaagcttgtttctcaaa450atgtatctccaagctaacgtctcaggtaccatgctcatgacaaggctgaa500attatggacggactttatggaccggttcatatcag535〈210〉3〈211〉22〈212〉dna〈213〉正向引物〈400〉3ctgcggaaggatcattaccgag22〈210〉4〈211〉23〈212〉dna〈213〉反向引物〈400〉4tcctctcctggcctattgatatg23〈210〉5〈211〉22〈212〉dna〈213〉正向引物〈400〉5cttccttgcttggtgtcgctgc22〈210〉6〈211〉21〈212〉dna〈213〉反向引物〈400〉6tgaaccggtccataaagtccg21〈210〉7〈211〉36〈212〉dna〈213〉探針〈400〉7ttttttttttggaaccaagagatccgttgttgaaag36〈210〉8〈211〉39〈212〉dna〈213〉探針〈400〉8ttttttttttttgccacagtgcactattccctcgacctg39sequencelisting〈110〉山西維爾生物乳制品有限公司〈120〉一種鑒別煙曲霉的探針、引物和基因芯片〈160〉4〈170〉patentinversion3.2〈210〉1〈211〉589〈212〉dna〈213〉煙曲霉its〈400〉1ctgcggaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtcc40aacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcg80ggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgccc120ccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgt160tctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagtt200aaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatg240aagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcaga280attcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccc320cctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgc360tgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccc400tctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgc440gtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctg480taggcccggccggcgccagccgacacccaactttattttt520ctaaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaac560ttaagcatatcaataggccaggagaggaa589〈210〉2〈211〉535〈212〉dna〈213〉煙曲霉abrⅱ〈400〉2cttccttgcttggtgtcgctgcggtcgcccaagcagccacagtgcactat50tccctcgacctgacatgggaaacaggcagtccgaatggtgtcagccggga100gatgatctttgtcaacggtcagtttcccggtccagccatcattctcaacg150agggcgacgaggcgattgtaagtatatggcagcatggcagcatagaaaga200tcgggatactgatttagtagattgacgtcaccaaccacttgccattcaac250acatccatccactttcacggcatcgagtaagtgctttcctgccaggggat300gacagatctgacgtggtatagacagaaaaataccccgtgggccgacggag350ttgtcggtctctcgcaatgggccattcagcccggccaatcctacacctac400caatggcgagcagatacttatgggacttattggtaagcttgtttctcaaa450atgtatctccaagctaacgtctcaggtaccatgctcatgacaaggctgaa500attatggacggactttatggaccggttcatatcag535〈210〉3〈211〉22〈212〉dna〈213〉正向引物〈400〉3ctgcggaaggatcattaccgag22〈210〉4〈211〉23〈212〉dna〈213〉反向引物〈400〉4tcctctcctggcctattgatatg23〈210〉5〈211〉22〈212〉dna〈213〉正向引物〈400〉5cttccttgcttggtgtcgctgc22〈210〉6〈211〉21〈212〉dna〈213〉反向引物〈400〉6tgaaccggtccataaagtccg21〈210〉7〈211〉36〈212〉dna〈213〉探針〈400〉7ttttttttttggaaccaagagatccgttgttgaaag36〈210〉8〈211〉39〈212〉dna〈213〉探針〈400〉8ttttttttttttgccacagtgcactattccctcgacctg39當(dāng)前第1頁12