本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及目標物捕獲體系，尤其涉及一種優(yōu)化的基于細菌細胞表面展示系統(tǒng)的目標物捕獲體系，目標物如病毒受體或特異性吸附配體等。

背景技術：

分析和鑒定病毒受體是探索研究病毒入侵細胞和宿主感染機制的關鍵步驟。目前，病毒受體分析主要依賴于免疫共沉淀方法和dna介導的轉化；再以體外培養(yǎng)并富集的大量病毒顆粒對病毒受體進行驗證；最后，獲得病毒受體的組分和結構。但是，很多病毒暫無成熟的體外增殖體系，這些方法不具有實際操作性。即，缺少病毒吸附介質的分離體系是阻礙深入研究病毒與宿主互作的主要瓶頸。因此，如何大量獲得易于后期試驗操作的病毒替代物，成為解析不可體外培養(yǎng)的病毒的受體的關鍵。以下以人源諾如病毒(humannoroviruses，hunovs)為例展開描述。

在桿狀病毒體系中，外源表達的hunovsvp1蛋白可以自動折疊并形成類病毒粒子(virus-likeparticles，vlps)；在原核表達體系中，只有p結構域的外源表達產物可以折疊成24個單位的p顆粒(pparticles)；vlps和p顆粒具有良好的免疫原性和與已知受體(如：組織血型抗原(histo-bloodgroupantigens，hbgas))結合的特性，常被用于研究hunovs與載體互作的替代物。但是，兩者的表達系統(tǒng)操作繁瑣且難以從復雜體系中分離獲得病毒衣殼蛋白與受體(吸附介質)的復合物。為了克服上述技術瓶頸，目前的研發(fā)技術通過建立細菌細胞表面展示系統(tǒng)來構建約百倍放大的假hunovs。

細菌細胞表面展示系統(tǒng)是指通過脫氧核糖核酸重組技術，將某外源蛋白的編碼基因與可錨定于受體細菌表面的編碼基因進行融合，通過融合蛋白在宿主細胞中表達、分泌，最終將融合蛋白跨膜錨定在宿主細胞的表面，達到研究融合蛋白功能或對融合蛋白進行應用的目的。冰晶核蛋白(ice-nucleationprotein，inp)可通過糖基磷脂酰肌醇而錨定在細菌表面，利于大分子蛋白的表面展示。inp的n端結構域(inaqn)也具有完整inp的表面展示功能。錨定于細胞表面的外源蛋白可以克服融合蛋白在胞內無法正確折疊等弊端。研究發(fā)現(xiàn)：假hunovs的承載體(大腸桿菌)會嚴重干擾病毒受體的分析。因此，需要開發(fā)優(yōu)化的假hunovs，用來構建新的細菌表面展示系統(tǒng)。

因此，本領域的技術人員致力于開發(fā)一種優(yōu)化的基于細菌細胞表面展示系統(tǒng)的目標物捕獲體系。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明人前期已經通過構建重組表達質粒pet28a-inaqn-p(gii.4)建立了一種基于細菌細胞表面展示系統(tǒng)的病毒受體捕獲體系，前期的發(fā)明內容由于應用中病毒受體(介質)分析容易受到所展示病毒衣殼蛋白承載體(大腸桿菌)的背景干擾，影響分析結果。本發(fā)明所要解決的技術問題是降低背景干擾，提高吸附效率并提供一種基于細菌細胞表面展示系統(tǒng)的目標物捕獲體系，在原有病毒受體捕獲體系的基礎上，通過簡單的誘導使病毒衣殼蛋白高效表達并錨定于宿主細菌的細胞表面，通過加入可被蛋白酶識別且作用的接頭蛋白，降低背景干擾、提升目標物分離效率，從而應用于病毒受體的捕獲、富集和分析，以及目標外源蛋白的分離純化。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一方面提供了一種基于優(yōu)化的細菌細胞表面展示系統(tǒng)的目標物捕獲體系，該目標物捕獲體系包括能錨定在宿主菌細胞表面的冰核蛋白n端結構域，與冰核蛋白n端結構域相連的接頭蛋白，以及與接頭蛋白相連的病毒的衣殼蛋白。

進一步地，接頭蛋白能被蛋白酶處理而斷裂，使得病毒的衣殼蛋白脫離宿主菌的表面。

進一步地，病毒衣殼蛋白的編碼基因片段，其dna序列如seqidno:1所示。

進一步地，冰核蛋白n端結構域的編碼基因片段，其dna序列如seqidno:2所示。

進一步地，接頭蛋白的氨基酸序列如seqidno:3所示。

優(yōu)選地，宿主菌為大腸桿菌bl21。

本發(fā)明的另一方面提供了一種優(yōu)化的基于細菌細胞表面展示系統(tǒng)的目標物捕獲體系，包括以下步驟：

(1)將病毒的衣殼蛋白編碼基因片段與編碼冰核蛋白n端結構域的編碼基因片段之間插入接頭蛋白的編碼基因片段，獲得融合基因片段；

(2)驗證所述融合基因片段的脫氧核糖核酸序列；

(3)將融合基因片段插入誘導型原核表達質粒，獲得重組誘導型表達質粒；

(4)將重組誘導型表達質粒轉化入宿主菌，獲得病毒的衣殼蛋白的細菌細胞表面展示系統(tǒng)；

(5)在誘導劑的誘導下使病毒的衣殼蛋白展示在宿主菌細胞表面，獲得目標物捕獲體系。

進一步地，步驟(1)中的病毒的衣殼蛋白編碼基因片段，其序列如seqidno:1所示。

進一步地，步驟(1)中的編碼冰核蛋白n端結構域的編碼基因片段，其序列如seqidno:2所示。

進一步地步驟(1)中的接頭蛋白，其氨基酸序列如seqidno:3所示。

其中，接頭蛋白的編碼基因片段用于優(yōu)化的細菌細胞表面展示系統(tǒng)的構建。

進一步地，步驟(4)中的宿主菌為大腸桿菌(escherichiacoli)bl21。

進一步地，步驟(5)中誘導包括以下誘導步驟：

(a)將轉化有重組誘導型表達質粒的宿主菌接種于液體培養(yǎng)基中，在30℃～39℃條件下震搖培養(yǎng)8h～16h；

(b)將步驟(a)中的細菌培養(yǎng)物以1.0％～20.0％接種量，轉接于新鮮培養(yǎng)基中，在30℃～39℃條件下震搖培養(yǎng)；

(c)待步驟(b)中的細菌培養(yǎng)物od600為0.6～1.0時，無菌條件下加入誘導劑后，15℃～30℃繼續(xù)震搖培養(yǎng)8h～24h；

(d)收集步驟(c)中細菌培養(yǎng)物的菌體，將菌體重懸至無菌磷酸鹽緩沖液中，得到菌懸液，即獲得目標物捕獲體系。

進一步地，步驟(c)中的誘導劑為異丙基硫代-β-d-半乳糖苷(isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside，iptg)，誘導終濃度為0.1mmol/l～2.0mmol/l。

進一步地，步驟(d)中無菌磷酸鹽緩沖液的ph＝7.2。

進一步地，步驟(d)獲得的菌懸液的od600為0.6～1.0。

進一步地，步驟(d)獲得的菌懸液的保存溫度為1℃～6℃。

另一方面，本發(fā)明還提供了上述基于優(yōu)化的細菌細胞表面展示系統(tǒng)的目標物捕獲體系的應用，用于捕獲和分離病毒受體，或用于目標外源蛋白的分離純化。

當細菌細胞表面展示的外源蛋白與細胞外環(huán)境中的特定反應物直接接觸，并捕獲環(huán)境中的特定反應物，再通過蛋白酶處理接頭蛋白并輔以簡單的低速離心即可獲得特定反應物與衣殼蛋白的復合物；在分析該特定反應物前剔除大腸桿菌，大大降低了背景干擾，為發(fā)掘hunovs新(類)受體及目標物分離純化提供技術支撐。

本發(fā)明通過基因工程手段將病毒衣殼蛋白錨定并展示在細菌細胞的表面，免去了純化病毒衣殼蛋白的繁雜步驟，這不僅大大降低了獲取病毒衣殼蛋白的成本，大幅縮短病毒衣殼與病毒受體復合物的回收周期，并且避免了展示體系承載體對分析捕獲的病毒受體(介質)時的背景干擾，更容易分離環(huán)境中相應的病毒受體，具有高效、節(jié)約、環(huán)保的效果。

相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有以下技術優(yōu)點：

1、以細菌細胞表面展示體系將病毒衣殼蛋白錨定在大腸桿菌表面。所展示的衣殼蛋白可以與病毒(類)受體結合。通過蛋白酶消化輔以低速離心即可獲得衣殼蛋白和病毒(類)受體的復合物，并進行病毒(類)受體的分析、鑒定；

2、無需特殊試劑和設備即可完成病毒(類)受體的分離；

3、以蛋白酶消化輔以低速離心即可剝離衣殼蛋白和病毒(類)受體的復合物與其承載體(大腸桿菌)，大幅降低了承載體對病毒(類)受體分析的干擾；

4、該細菌細胞表面展示體系僅需普通培養(yǎng)和誘導過程，周期短。

以下將結合附圖對本發(fā)明的構思、具體結構及產生的技術效果作進一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明hunovsgii.4重組衣殼蛋白e.coli細胞表面展示重組菌sds-page檢測結果示意圖。

其中1：pet28a誘導菌體；2：重組菌pet28a-inaqn-p誘導菌體；3：重組菌pet28a-inaqn-tb-p誘導菌體；4：蛋白酶酶切pet28a-inaqn-tb-p菌體：5：酶切上清p結構域蛋白；6：濃縮后的p結構域蛋白；m：pagerulerprestainedproteinladder(sm0671)。

圖2是本發(fā)明的一個較佳實施方式中的優(yōu)化的細菌細胞表面展示體系吸附相應病毒受體的能力的示意圖。

具體實施方式

以下結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進行更詳細地說明。

發(fā)明人前期已經構建了重組表達質粒pet28a-inaqn-p(gii.4)，其構建方法如下：

1)序列擴增：

根據(jù)人源諾如病毒主要衣殼蛋白編碼基因(orf2)，其序列如seqidno:4所示，設計擴增orf2及orf2的3’端基因片段(即p基因片段)的引物對p1和p2、p5和p6，以人源諾如病毒腹瀉臨床樣本rna進行rt-pcr擴增orf2，以orf2為模板、用引物對p5和p6進行pcr擴增獲得p基因片段。根據(jù)如seqidno：2所示的基因序列設計擴增inaqn基因片段的引物對p3和p4，以丁香假單胞菌基因組dna為模板進行pcr擴增，得到inaqn基因片段。引物信息如下：

p1(5’→3’)：ggaagatctatgaagatggcgtcg

p2(5’→3’)：ccggaattcttataaagcacgtctg

p3(5’→3’)：ccatggatggatctcgacaaggcg

p4(5’→3’)：agatctggtctgcaaattctgcgg

p5(5’→3’)：agatcttcaagaactaaaccattctc

p6(5’→3’)：gaattcttatagtgcacgcctacgcc

引物p1、p4和p5含有bglii酶切位點，引物p2和p6含有ecori酶切位點，引物p3含有ncoi酶切位點。

orf2的rt-pcr反應條件為：42℃反轉錄10min；95℃變性1min；95℃預變性5min；95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，32個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保溫。

inaqn的pcr反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，32個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保溫。

orf2的3’端(即p基因片段)pcr反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，32個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保溫。

經序列測定證實，獲得了正確的orf2的3’端基因片段(即p基因片段)和inaqn基因片段。

2)pet28a-inaqn-p(gii.4)的構建

將上述獲得的orf2的3’端基因片段(即p基因片段)和inaqn基因片段分別連接至pmd19-t載體，將連接產物以42℃熱激法轉入大腸桿菌dh5α，進行藍白斑篩選后，挑取白斑單菌落，將所挑取出的單菌落進行培養(yǎng)后從中提取質粒，得到重組質粒pmd19-p和pmd19-inaqn。

用bglii/ecori對pmd19-p進行雙酶切處理，用bglii/ncoi對pmd19-inaqn進行雙酶切處理，并分別經過1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析，回收約為960bp和525bp的dna片段，并對誘導型表達質粒pet-28a進行ecori/ncoi雙酶切。將上述回收的基因片段(inaqn+p+pet-28a)在t4dna連接酶的作用下進行連接，酶連接后的產物轉化大腸桿菌dh5α。在含有kan的lb平板上篩選陽性克隆子，并進行培養(yǎng)，提取質粒。進行雙酶切驗證及測序正確后，即得到質粒pet28a-inaqn-p。

本具體實施方式中的病毒的衣殼蛋白3’端片段(p)、編碼冰核蛋白n端結構域的編碼基因片段來自于重組表達質粒pet28-inaqn-p(gii.4)，這兩個基因的脫氧核糖核酸(下文稱為dna)序列，分別如序列表seqidno:1、seqidno:2所示，用于插入在這二者之間的接頭蛋白編碼基因(以下簡稱為tb)來源于人工合成的核酸片段，接頭蛋白編碼基因編碼的氨基酸序列如seqidno:3所示，用于優(yōu)化的細菌表面展示系統(tǒng)的構建。

首先，利用重組表達質粒pet28a-inaqn-p(gii.4)，進行雙酶切回收目的基因片段：約5.3kb的pet28載體核酸片段和960bp的p蛋白編碼基因核酸片段；人工合成的543bp的tb蛋白編碼基因片段(含inaqn片段)。將三種dna片段通過t4連接酶連接后得到重組誘導型表達質粒pet28-inaqn-tb-p(gii.4)，通過序列測定來驗證重組表達質粒的真實性和準確性。將上述重組的誘導型表達質粒轉化入大腸桿菌宿主菌，攜帶上述重組誘導型表達質粒的大腸桿菌便成為重組病毒衣殼蛋白的細菌細胞表面展示系統(tǒng)。

本領域技術人員可知，上述構建方法僅是舉例說明，還可以通過其他方法構建獲得重組誘導型表達質粒pet28-inaqn-tb-p(gii.4)或其他病毒衣殼蛋白細菌的細胞表面展示體系。

在添加誘導劑的條件下誘導在上述細菌表面展示系統(tǒng)表達tb-p所編碼的蛋白質。

上述細菌表面展示系統(tǒng)誘導表達的誘導步驟如下。

(1)將攜帶有重組的誘導型表達質粒的大腸桿菌單菌落接種于培養(yǎng)基例如luria-bertani培養(yǎng)基(lb培養(yǎng)基)中，在30℃～37℃條件下震搖培養(yǎng)8h～16h，獲得細菌培養(yǎng)物。根據(jù)重組質粒所攜帶的抗生素標記基因，培養(yǎng)基中須含有相應的抗生素例如卡那霉素(kan)。

(2)從步驟(1)的細菌培養(yǎng)物中取菌液轉接到含卡那霉素的新鮮培養(yǎng)基中，接種量優(yōu)選為占培養(yǎng)基體積的1.0％～20.0％，繼續(xù)在30℃～39℃條件下震搖培養(yǎng)。

(3)當步驟(2)的培養(yǎng)物的od600＝0.6～1.0時，加入誘導劑例如異丙基硫代-β-d-半乳糖苷，添加后的終濃度為0.1mmol/l～2.0mmol/l，將培養(yǎng)溫度降至15℃～30℃，繼續(xù)震搖培養(yǎng)8h～24h，此時即可使重組病毒衣殼蛋白表達后錨定在大腸桿菌的細胞表面。

(4)通過低速離心收集菌體細胞，將菌體細胞重懸至無菌磷酸鹽緩沖液(ph＝7.2)中，得到菌懸液，即獲得所述的優(yōu)化的病毒受體捕獲體系。其中，菌懸液的od600＝0.6～1.0，1℃～6℃保存?zhèn)溆谩?/p>

上述得到的菌懸液就是優(yōu)化的基于細菌細胞表面展示系統(tǒng)的病毒受體捕獲體系，可直接用于病毒受體的吸附和分離，以及目標外源蛋白的分離純化。

實施例1

誘導型表面展示病毒衣殼蛋白原核表達質粒載體的構建：

將人工合成的inaqn-tb融合基因片段，其序列如seqidno:5所示，連接至原核克隆載體puc57中，連接產物以熱激法轉入大腸桿菌dh5α，在含有氨芐青霉素(amp)的lb平板上篩選陽性克隆子，將所挑取出的單菌落進行培養(yǎng)后從中提取質粒，得到重組質粒puc57-inaqn-tb。

用ncoi/ecori和bglii/ecori分別對pet28a-inaqn-p(gii.4)進行雙酶切處理，再用ncoi/bglii對puc57-inaqn-tb進行雙酶切，分別回收約5.3kb、960bp、543bp的dna片段。將上述三個片段在t4dna連接酶的作用下進行連接，酶連接后的產物轉化大腸桿菌dh5α。在含有卡那霉素(kan)的lb平板上篩選陽性克隆子，培養(yǎng)，并抽提重組質粒。首先對重組質粒進行雙酶切驗證，之后，對重組質粒進行測序，測序結果表明讀碼框正確。即得到誘導型表面展示病毒衣殼蛋白的原核表達質粒pet28-inaqn-tb-p(gii.4)。

實施例2

誘導型表面展示病毒衣殼蛋白原核表達質粒的表達及表面展示系統(tǒng)的功能鑒定：

將實施例1中制備的原核表達質粒pet28-inaqn-tb-p(gii.4)轉化大腸桿菌bl21，攜帶該誘導型表面展示病毒衣殼蛋白原核表達質粒pet28-inaqn-tb-p(gii.4)的大腸桿菌bl21命名為il-2.4p。挑取其單菌落，接種于含有100μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h～14h后，以1.0％接種量接種于新鮮的培養(yǎng)基中，繼續(xù)震搖培養(yǎng)至od600nm為0.6時，添加終濃度為0.4mmol/l的iptg，在26℃條件下繼續(xù)震搖培養(yǎng)16h。4℃，5000rpm離心10min收集菌體，然后將菌體重懸于ph7.2的無菌pbs緩沖液中，od600nm調至1.0，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

如圖1所示，通過重組菌sds-page檢測，空載pet28a誘導菌中沒有出現(xiàn)目標條帶；重組菌pet28a-inaqn-p(gii.4)誘導菌體、重組菌pet28a-inaqn-tb-p(gii.4)誘導菌體中出現(xiàn)了目標蛋白。通過蛋白酶酶切后，酶切上清中出現(xiàn)了背景干擾小的p結構域蛋白。

以包被液(ph9.60.05mol/lna2co3-nahco3)溶解豬胃黏膜(porcinegastricmucin，以下簡稱：pgm；含hunovs受體hbgas)至終濃度為1.0mg/ml，將誘導菌液與等體積不同稀釋度的pgm溶液于37℃孵育0.5h，離心去上清；pbs洗滌3次后，用100u/ml蛋白酶(按照切割質量比1:2000)37℃振蕩水浴酶切處理3h后。然后4℃，10,000rpm離心5min，收集上清。對照組不與pgm孵育，其他處理一致；pet28a作為陰性對照。

將上述樣品各取100μl加入酶標板，4℃包被過夜；棄液后pbs洗滌三次，120μl/孔1.0％bsa進行封閉，37℃孵育1h；棄液后pbs洗滌三次，100μl/孔添加一抗(hbgas單克隆抗體bg2，1:1000稀釋，signetlaboratories，dedham，ma，usa)，37℃孵育60min。棄液后tbst洗滌三次，100μl/孔二抗[hrp-羊抗鼠igg(h+l)購于上海翊圣生物科技有限公司]稀釋液(1:3000稀釋于含1.0％bsa的tbst溶液中)，經37℃孵育60min。棄液后tbst洗滌三次，100μl/孔tmb[福因德科技(武漢)有限公司]混勻后避光反應10min。每孔加入50μl終止液(2mol/lh2so4)，15min內于450nm處測定od值。

如圖2所示，通過測定od值，結果證明優(yōu)化的假hunovs酶切上清對pgm具有極其顯著的吸附能力；優(yōu)化的假hunovs酶切上清對pgm的吸附能力極其顯著大于假hunovs酶切上清。說明本設計構建的優(yōu)化的病毒受體捕獲體系對對應的病毒有極其顯著的吸附能力，且本設計的吸附能力顯著高于已有的病毒受體捕獲體系。

以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構思做出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發(fā)明的構思在現(xiàn)有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。

序列表

<110>上海交通大學

<120>一種優(yōu)化的基于細菌細胞表面展示系統(tǒng)的目標物捕獲體系

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>960

<212>dna

<213>諾如病毒衣殼蛋白3'端結構域編碼基因p基因

<400>1

tcaagaactaaaccattctctgtcccagttttaactgttgaggagatgaccaattcaaga60

ttccccattcctttggaaaagttgttcacgggtcccagcagtgcctttgttgtccaacca120

caaaacggtaggtgcacgactgatggcgtgctcctaggcgccacccaactgtctcctgtc180

aacatctgcaccttcagaggagatgtcacccatatcacaggtagtcgtaactacacaatg240

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aaccagttttacacgcttgcccccatgggaaatggaacggggcgtaggcgtgcactataa960

<210>2

<211>525

<212>dna

<213>冰核蛋白n端結構域編碼基因inaqn

<400>2

atggatctcgacaaggcgttggtgctgcgtacctgtgcaaataacatggccgatcattgc60

ggccttatatggcccgcttctggcacggtggaatccaaatactggcagtcaaccaggcgg120

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ccggtaaataccctgccggtgacgacgccgcagaatttgcagacc525

<210>3

<211>6

<212>prt

<213>人工蛋白

<400>3

leuvalproargglyser

15

<210>4

<211>1623

<212>dna

<213>諾如病毒衣殼蛋白編碼基因orf2

<400>4

atgaagatggcgtcgagtgacgccaacccatctgatgggtccgcagccaacctcgtccca60

gaggtcaataatgaggttatggctctggagcccgttgttggtgccgccattgcggcacct120

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