本發(fā)明屬于數(shù)字pcr領(lǐng)域，特別涉及一種基于pdms材料的微室陣列式數(shù)字pcr芯片。

背景技術(shù)：

數(shù)字pcr是一種能夠?qū)na分子拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量的技術(shù)。該技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)：能夠?qū)ζ鹗紭悠愤M(jìn)行準(zhǔn)確定量，且不需要預(yù)先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；靈敏度高，檢測限能夠達(dá)到單個(gè)分子；可以定量核酸分子微小的濃度變化等。這些優(yōu)點(diǎn)都使數(shù)字pcr比傳統(tǒng)定量方法更準(zhǔn)確、更靈敏，從而更加適用于對dna分子的定量檢測。

數(shù)字pcr芯片也一直是微流控芯片領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前，數(shù)字pcr微流體系統(tǒng)主要分為乳滴式和陣列式兩類。首先是乳滴式數(shù)字pcr微流體系統(tǒng)，其原理是通過生成數(shù)萬至數(shù)百萬個(gè)油包水液滴，將pcr反應(yīng)液均勻的分成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元，每個(gè)反應(yīng)單元中的pcr過程將獨(dú)立的進(jìn)行。通過計(jì)數(shù)陽性反應(yīng)單元的數(shù)目即可計(jì)算出初始dna模板分子的數(shù)目。

陣列式數(shù)字pcr芯片系統(tǒng)，該類型的數(shù)字pcr系統(tǒng)在芯片上預(yù)先制作數(shù)萬個(gè)相互獨(dú)立的反應(yīng)室，然后通過將pcr反應(yīng)液均勻的分配到這些反應(yīng)室當(dāng)中實(shí)現(xiàn)對pcr反應(yīng)液的分液。每個(gè)反應(yīng)室的pcr過程獨(dú)立進(jìn)行，并在pcr過程結(jié)束后對陽性反應(yīng)室進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過泊松分布最終計(jì)算出初始dna模板分子的數(shù)目。

目前，乳滴數(shù)字pcr需要復(fù)雜的乳滴生成、操縱、讀出設(shè)備，所以基于乳滴數(shù)字pcr的商用儀器十分昂貴。而目前的陣列式數(shù)字pcr尚不成熟，或結(jié)構(gòu)復(fù)雜或使用操作繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于pdms材料的微室陣列式數(shù)字pcr芯片，該芯片外圍的水通道能夠防止pcr過程中pcr反應(yīng)液的蒸發(fā)；所設(shè)計(jì)的自動(dòng)計(jì)數(shù)軟件能夠?qū)π酒Y(jié)果進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)；能夠達(dá)到極高的檢測靈敏度，實(shí)現(xiàn)dna的單分子檢測。

本發(fā)明的一種基于pdms材料的微室陣列式數(shù)字pcr芯片，所述芯片的材料為pdms材料，包括進(jìn)樣口、微室陣列和出樣口，所述進(jìn)樣口包括樣品進(jìn)樣口和水進(jìn)樣口，所述出樣口包括樣品出樣口和水出樣口；所述水進(jìn)樣口和水出樣口連通位于芯片外圍的水微室陣列；所述樣品進(jìn)樣口和樣品出樣口通過微管道連通微室陣列中的各反應(yīng)室。

所述芯片外圍的水微室陣列為內(nèi)部pcr反應(yīng)微室陣列提供潮濕環(huán)境。

所述微室陣列平均分為若干個(gè)矩形區(qū)域，每個(gè)矩形區(qū)域的尺寸對應(yīng)顯微鏡視野大小。

采用k-means聚類算法將陽性反應(yīng)室與陰性反應(yīng)室進(jìn)行區(qū)分，并對陽性反應(yīng)室的數(shù)目進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)。

有益效果

(1)本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)dna分子的單分子檢測，表現(xiàn)出極高的檢測靈敏度；

(2)本發(fā)明操作簡便，抗蒸發(fā)設(shè)計(jì)能夠較好的抵抗pcr過程中反應(yīng)倉的水分損失；

(3)本發(fā)明使用基于k-means聚類算法的軟件能夠?qū)㈥栃苑磻?yīng)室與陰性反應(yīng)室進(jìn)行區(qū)分，并對陽性反應(yīng)室的數(shù)目進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)，能夠直接數(shù)出dna分子數(shù)目，不需要預(yù)先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)了對dna分子的絕對定量。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明的抗水分損失能力示意圖；

圖3(a)為陽性反應(yīng)室與陰性反應(yīng)室的顯微照片，(b)為沿線的熒光強(qiáng)度分布；

圖4為陽性反應(yīng)室與陰性反應(yīng)室的平均熒光強(qiáng)度，誤差棒代表500次重復(fù)測量的標(biāo)準(zhǔn)差；

圖5為陽性反應(yīng)室與陰性反應(yīng)室的熒光強(qiáng)度分布直方圖；

圖6為本發(fā)明的實(shí)物圖；

圖7為不同濃度基因組dna的數(shù)字pcr結(jié)果，其中(a)為5×10⁴copy/μl；(b)為10⁴copy/μl；(c)為10³copy/μl；(d)為10²copy/μl；(e)為10copy/μl；(f)為未加入任何基因組dna的對照組；

圖8為實(shí)施例測得的dna目標(biāo)片段濃度與dna目標(biāo)片段實(shí)際濃度線性關(guān)系曲線，誤差棒代表三次獨(dú)立復(fù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)差。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

(1)芯片結(jié)構(gòu)

如圖1所示，本實(shí)施例提供了一種基于pdms材料的微室陣列式數(shù)字pcr芯片，所述芯片的材料為pdms材料，包括進(jìn)樣口、微室陣列和出樣口，所述進(jìn)樣口包括樣品進(jìn)樣口(圖中標(biāo)有sample的進(jìn)樣口)和水進(jìn)樣口(圖中標(biāo)有water的進(jìn)樣口)，所述出樣口包括樣品出樣口和水出樣口；所述水進(jìn)樣口和水出樣口連通位于芯片外圍的水微室陣列；所述樣品進(jìn)樣口和樣品出樣口通過微管道連通微室陣列中的各反應(yīng)室。其中，樣品進(jìn)樣口用于pcr反應(yīng)液的進(jìn)樣，而水進(jìn)樣口用于芯片外圍水微室陣列中水的進(jìn)樣。

微管道寬約20-60μm，高約10-30μm，反應(yīng)室的直徑約100μm，高度約100μm。整個(gè)芯片共有反應(yīng)室10368個(gè)，可將pcr反應(yīng)液分成10368份，每一份反應(yīng)液可以在反應(yīng)室內(nèi)獨(dú)立的進(jìn)行pcr擴(kuò)增。由于芯片尺寸過大，無法通過一次顯微鏡拍照將整張芯片拍攝完全，所以將芯片的10368個(gè)反應(yīng)室平均分成24個(gè)矩形區(qū)域，每個(gè)區(qū)域的尺寸正好是一個(gè)4倍顯微鏡視野大小。這樣，通過24次拍攝就能夠?qū)⒄麖埿酒乃蟹磻?yīng)室拍攝完畢。

(2)芯片制作

首先向硅基模具上澆筑pdms預(yù)聚體與交聯(lián)劑的混合物；然后經(jīng)靜置、加熱等過程，使pdms固化；將固化后的pdms從模具上剝離，并與載玻片鍵和，芯片便制作完成。

(3)芯片的抗水分揮發(fā)設(shè)計(jì)

由于pdms材料為多孔結(jié)構(gòu)，所以在pcr過程中，反應(yīng)室中的液體會(huì)受熱揮發(fā)，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)水分的損失，芯片邊緣部分的反應(yīng)室會(huì)因水分損失而被完全蒸干。如圖2所示，為了防止這一現(xiàn)象影響到pcr反應(yīng)，在芯片邊緣加上了如圖所示的抗水分揮發(fā)設(shè)計(jì)。圖中芯片外圍的水微室陣列，其在數(shù)字pcr熱循環(huán)過程中作為蒸發(fā)犧牲層，為內(nèi)部的pcr微室陣列提供潮濕環(huán)境，以防止pcr反應(yīng)液的蒸發(fā)。如圖所示，使用胭脂紅染料的水溶液測試芯片的抗蒸發(fā)能力。經(jīng)40個(gè)pcr熱循環(huán)過程，只有最外圍水通道的部分反應(yīng)室被蒸干，而內(nèi)部的pcr微室陣列，沒有明顯的水分損失。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該芯片的抗蒸發(fā)設(shè)計(jì)能夠較好的抵抗pcr過程中反應(yīng)室的水分損失。

(4)自動(dòng)計(jì)數(shù)的設(shè)計(jì)

數(shù)字pcr過程中，含有目的dna片段的反應(yīng)室會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，稱為陽性反應(yīng)室。而沒有目的dna片段存在的反應(yīng)室則不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，稱為陰性反應(yīng)室。為了對目的dna片段進(jìn)行定量，首先必須對芯片的陽性反應(yīng)室數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。

為了實(shí)現(xiàn)對陽性反應(yīng)室的自動(dòng)計(jì)數(shù)，首先應(yīng)對陽性反應(yīng)室與陰性反應(yīng)室進(jìn)行區(qū)分。圖3(a)中所示為陽性反應(yīng)室(右)與陰性反應(yīng)室(左)的熒光顯微照片；圖3(b)中所示為沿線的熒光強(qiáng)度分布。如圖所示，陽性反應(yīng)室的熒光強(qiáng)度比陰性反應(yīng)室的熒光強(qiáng)度有顯著升高。

使用image-proplus軟件(美國mediacybernetics公司)對隨機(jī)選取的500個(gè)陽性反應(yīng)室與500個(gè)陰性反應(yīng)室的顯微照片進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4所示。陽性反應(yīng)室的平均熒光強(qiáng)度明顯高于陰性反應(yīng)室的平均熒光強(qiáng)度。

圖5為陽性反應(yīng)室與陰性反應(yīng)室的熒光強(qiáng)度分布直方圖。如圖所示，直方圖的x軸表示每個(gè)反應(yīng)室的平均熒光強(qiáng)度，y軸表示反應(yīng)室的數(shù)目。從圖中可以看出，陰性反應(yīng)室的熒光強(qiáng)度主要分布于0到30的范圍內(nèi)(單位為相對單位a.u.)，而陽性反應(yīng)室的熒光強(qiáng)度主要分布在100到140的范圍內(nèi)。這些數(shù)據(jù)說明兩者的熒光強(qiáng)度數(shù)值有很大差異，可以通過聚類算法將兩者自動(dòng)區(qū)分開并對陽性反應(yīng)室的數(shù)目進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)。

因此，根據(jù)上述結(jié)果，可以采用k-means聚類算法將陽性反應(yīng)室與陰性反應(yīng)室進(jìn)行區(qū)分，并對陽性反應(yīng)室的數(shù)目進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)。

(5)本實(shí)施例芯片的實(shí)際測試

1.試劑與儀器：

試劑：lightcycler480probesmaster(德國roche公司)；實(shí)驗(yàn)用水為depc處理水(sangonbiotech)；cpgmethylatedjurkatgenomicdna(香港newenglandbiolabs公司)。

儀器：bx51熒光顯微鏡(日本olympus公司)；mastercyclernexusflat原位pcr儀(德國eppendorf公司)；真空干燥器(上海越磁電子科技有限公司)。

dna序列：實(shí)驗(yàn)中所用dna序列見表1。標(biāo)記有熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的taqman探針序列由上海占標(biāo)生物科技有限公司合成。pcr引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并由該公司經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳法(page)進(jìn)行純化。

表1實(shí)驗(yàn)所用dna序列

2.pcr反應(yīng)體系：

為了測試該芯片的線性范圍與檢測靈敏度，對cpgmethylatedjurkat基因組dna進(jìn)行了梯度稀釋，配制了一系列不同濃度的基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品(濃度從5×10⁴copy/μl到10copy/μl)。實(shí)驗(yàn)前，取1μl標(biāo)準(zhǔn)品與pcr反應(yīng)各組分配成13μlpcr反應(yīng)預(yù)混液。將預(yù)混液在數(shù)字pcr芯片上進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)。數(shù)字pcr反應(yīng)預(yù)混液的體系如表2所示，熱循環(huán)參數(shù)如表3所示。pcr熱循環(huán)過程在mastercyclernexusflat原位pcr儀上進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)中選擇抑癌基因pcdhgb6的啟動(dòng)子作為pcr擴(kuò)增的目的片段。

表2數(shù)字pcr體系

表3數(shù)字pcr熱循環(huán)參考值

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

在pcr循環(huán)完成后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，隨著所加入基因組dna濃度的逐漸減小，陽性反應(yīng)室的數(shù)目也相應(yīng)減少。同時(shí)，在未加入任何基因組dna的對照組中，沒有觀察到任何陽性反應(yīng)室。通過陽性反應(yīng)室的數(shù)目，能夠計(jì)算出待檢測標(biāo)準(zhǔn)品中dna分子的拷貝數(shù)。具體計(jì)算方法為：

設(shè)芯片總陽性反應(yīng)室數(shù)目為n，設(shè)芯片反應(yīng)室數(shù)目設(shè)為n。由于dna分子在反應(yīng)室中的個(gè)數(shù)x滿足泊松分布，則根據(jù)泊松分布的分布函數(shù)：

公式3.1中λ為泊松分布的期望，而p(x)為每個(gè)反應(yīng)室中dna分子數(shù)目為x時(shí)的概率。由于陰性反應(yīng)室中含有0個(gè)目標(biāo)dna分子，則有：

通過公式3.2可以推出泊松分布的期望值λ的計(jì)算公式：

當(dāng)反應(yīng)室中分子數(shù)x≥1時(shí)，該反應(yīng)室將產(chǎn)生熒光而成為陽性反應(yīng)室，所以有下面式子：

將公式3.4帶入式3.3中，即可得出：

λ是泊松分布中的期望，即單個(gè)反應(yīng)室里面出現(xiàn)分子數(shù)目的期望值，所以只需要用λ乘以總反應(yīng)室的數(shù)目n即可得出目的dna分子的總拷貝數(shù)copy_number：

copy_number＝λ×n(3.6)

將總拷貝數(shù)copy_number除以初始樣本的體積v，即可得到目標(biāo)dna分子的初始濃度：

至此，通過數(shù)學(xué)計(jì)算，精確地得到了樣品中目的dna分子的拷貝數(shù)與濃度。

圖8為實(shí)驗(yàn)測得的目標(biāo)dna分子濃度與其實(shí)際濃度的線性關(guān)系曲線，如圖所示，檢測的線性范圍為10copy/μl到5×104copy/μl(r²＝0.9999)。該結(jié)果顯示出，芯片對dna分子的定量準(zhǔn)確，并且線性度好。同時(shí)，最低檢測限達(dá)到了10個(gè)分子。以上結(jié)果證明，該芯片可以用于目標(biāo)dna分子的絕對定量檢測。

sequencelisting

<110>中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所

<120>一種基于pdms材料的微室陣列式數(shù)字pcr芯片

<130>1

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<170>patentinversion3.3

<210>1

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<213>人工序列

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gatgtacacctgcattttcg20

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cgttcgctcgggttctcgct20

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

acgccggggatccgtcagcctctgg25