本發(fā)明涉及棉花品種鑒別領(lǐng)域，具體而言，涉及鑒定棉花閉花授粉材料的引物對(duì)、試劑盒以及方法。
背景技術(shù)：
：棉花是常異花授粉作物，一般天然異交率在3～20％，高的可達(dá)50％。目前，常規(guī)種和雜交種在生產(chǎn)上都得到大面積推廣。在常規(guī)種自交繁種和雜交種親本自交繁殖的過程中，由于棉花存在一定的異交率，很容易發(fā)生異交，造成生物學(xué)混雜，使優(yōu)良品種特征特性發(fā)生退化。鑒于此，育種家和種子公司每年需要投入大量的人力物力財(cái)力對(duì)棉花常規(guī)品種和雜交種親本進(jìn)行隔離繁殖或者人工自交保純。閉花授粉現(xiàn)象在現(xiàn)代棉花品種中非常罕見，早期曾有過零星記載。秘魯boza在海島棉坦奎斯品種的異交后代中選到閉花授粉的品系，蘇聯(lián)kaansh在(海島棉×草棉)×海島棉的自交后代中發(fā)現(xiàn)具有閉花授粉花朵的雜種，印度neelakantan和balasubrahmanyan在陸地棉×海島棉的f2代中亦觀察到閉花授粉變異體。80年代以后，埃及、蘇聯(lián)和法國等棉區(qū)又相繼發(fā)現(xiàn)閉花授粉棉花，并進(jìn)行了初步遺傳分析。1990年，國內(nèi)首次從陸海雜種后代中分離到穩(wěn)定的閉花授粉棉花材料1057-1，等等。與正常開花授粉棉花材料相比，棉花閉花授粉材料在開花期花朵開花散粉授粉當(dāng)天，花瓣緊閉，不開放，完成自我授粉。棉花閉花授粉材料的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，在棉花遺傳育種和良種繁育上具有廣闊的應(yīng)用前景。在育種過程中，不需要繁瑣的人工自交提純，通過棉花多代種植后，自我自交，就可以實(shí)現(xiàn)后代的純合，顯著地提高了效率。在制種過程中，可以使棉花常規(guī)種繁種和雜交種親本繁殖過程中，無需人工干涉，進(jìn)行自交，杜絕了品種生物學(xué)混雜退化。在棉花生產(chǎn)過程中，可有效地防止陰雨天氣，雨水進(jìn)入花內(nèi)致使花粉破裂而授粉受精不良，從而減少落鈴，提高產(chǎn)量。鑒于棉花閉花授粉材料的重要性，快速準(zhǔn)確地鑒定該材料對(duì)于品種選育和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)均有重要作用。然而，目前我國很多材料真?zhèn)蔚蔫b定大多依靠田間性狀表現(xiàn)，此法雖然直觀，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)工。而且，閉花授粉特性受環(huán)境影響較大，在某些生態(tài)區(qū)或環(huán)境條件下，與正常開花棉花材料一樣，花朵表現(xiàn)為全部開放。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從dna水平上進(jìn)行分子鑒定使得結(jié)果更準(zhǔn)確，方法更簡(jiǎn)便。目前，利用ssr分子標(biāo)記對(duì)材料進(jìn)行鑒定的方法已經(jīng)在各種作物中得到廣泛應(yīng)用。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供鑒定棉花閉花授粉材料的引物對(duì)，該引物對(duì)通過大量實(shí)驗(yàn)篩選得到，特異性強(qiáng)，能穩(wěn)定有效地鑒別棉花閉花授粉材料。本發(fā)明的第二目的在于提供鑒定棉花閉花授粉材料的試劑盒，該試劑盒為棉花閉花授粉材料的鑒定提供便利。本發(fā)明的第三目的在于提供鑒定棉花閉花授粉材料的方法，該方法通過分子水平進(jìn)行鑒定，方法簡(jiǎn)便快捷，鑒定結(jié)果穩(wěn)定可靠。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：鑒定棉花閉花授粉材料的引物對(duì)，包括以下引物對(duì)中的任一種或多種：nau2173引物對(duì)的上下游核酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示，nau2343引物對(duì)的上下游核酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示，nau7024引物對(duì)的上下游核酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示，tmb1638引物對(duì)的上下游核酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示，bnl3875引物對(duì)的上下游核酸序列如seqidno.9和seqidno.10所示，hau0979引物對(duì)的上下游核酸序列如seqidno.11和seqidno.12所示，nau1102引物對(duì)的上下游核酸序列如seqidno.13和seqidno.14所示，nau6601引物對(duì)的上下游核酸序列如seqidno.15和seqidno.16所示，nau2251引物對(duì)的上下游核酸序列如seqidno.17和seqidno.18所示，dpl0133引物對(duì)的上下游核酸序列如seqidno.19和seqidno.20所示。本發(fā)明針對(duì)陸地棉26條染色體選擇180對(duì)引物(平均每條染色體上最少3對(duì)引物)進(jìn)行ssrpcr擴(kuò)增，將閉花授粉材料與多個(gè)普通棉花品種進(jìn)行比較，篩選得到這些特異性引物對(duì)。這些引物對(duì)特異性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠。普通棉花品種包括栽培棉花的兩個(gè)主要的棉種(海島棉和陸地棉)，特別選擇海島棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系(3-79)和陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系(tm-1)。另外，針對(duì)種植面積占絕大多數(shù)的陸地棉種，試驗(yàn)材料涵蓋三大棉區(qū)(黃河流域、長江流域、西北內(nèi)陸)，包括來源于不同血緣系譜的種質(zhì)資源和目前大面積推廣的品種，比如黃河流域棉區(qū)陸地棉品種魯棉研28號(hào)、西北內(nèi)陸陸地棉品種中棉所49。具體的棉花品種如下：海島棉品種：新海21號(hào)、海7124、吉扎76以及海島棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系3-79；陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系tm-1；黃河流域棉區(qū)陸地棉品種中棉所10號(hào)和魯棉研28號(hào)；長江流域棉區(qū)陸地棉品種蘇棉22號(hào)、川棉239和鄂抗棉9號(hào)；黃河流域和長江流域棉區(qū)陸地棉品種中棉所12；西北內(nèi)陸棉區(qū)陸地棉品種中棉所49、新陸中69號(hào)和新陸棉1號(hào)。以上這些棉花品種均可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所獲得。本發(fā)明提供的鑒定棉花閉花授粉材料的引物對(duì)，可以為上述引物對(duì)中的任意一種，也可以為任意兩種、任意三種、任意四種、任意五種、任意六種、任意七種、任意八種、任意九種以及這十種的組合，當(dāng)然，鑒定的時(shí)候采用的引物越多，則鑒定更為確切。進(jìn)一步地，所述棉花閉花授粉材料為棉花閉花授粉材料cj1548143。本發(fā)明還提供了鑒定棉花閉花授粉材料的試劑盒，含有權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)。該試劑盒中，可以含有上述引物對(duì)中的任一種或幾種。試劑盒為鑒定棉花閉花授粉材料的進(jìn)行提供便利。本發(fā)明還提供了鑒定棉花閉花授粉材料的方法，采用上述的引物對(duì)對(duì)待檢測(cè)棉花材料的基因組進(jìn)行檢測(cè)。該處的上述的引物對(duì)為上述引物對(duì)中的任一種或幾種。進(jìn)一步地，所述檢測(cè)為分子水平的檢測(cè)。如可以為雜交、基因芯片、pcr檢測(cè)等。pcr檢測(cè)簡(jiǎn)便易行，因此，優(yōu)選為pcr檢測(cè)。進(jìn)一步地，所述pcr檢測(cè)時(shí)，pcr擴(kuò)增所用的退火溫度為58±1℃。該退火溫度，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物特異性強(qiáng)，雜帶少。如pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4-95℃預(yù)變性3-5分鐘；94℃變性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸30秒；35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5-10分鐘；產(chǎn)物4℃保存。由于本發(fā)明提供的引物對(duì)針對(duì)棉花染色體上的ssr序列得到，因此，使用該引物得到的片段的長度較小，一般在200bp左右。pcr檢測(cè)時(shí)，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物一般采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，或者毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)選地，所述pcr檢測(cè)時(shí)，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明創(chuàng)新性地采用毛細(xì)管電泳分辨ssrpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，相對(duì)于傳統(tǒng)的利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨擴(kuò)增產(chǎn)物，提高了效率和準(zhǔn)確性。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨擴(kuò)增產(chǎn)物，包括制作聚丙烯酰胺凝膠、點(diǎn)樣、電泳1h和顯色等步驟，一般每次完成48個(gè)樣品，最多96個(gè)樣品的條帶采集。利用毛細(xì)管電泳分辨擴(kuò)增產(chǎn)物僅需要在擴(kuò)增后的96孔pcr板中加入te緩沖液，電泳1h，直接用prosize2.0軟件觀察條帶，每次可以完成95個(gè)樣品的條帶采集，大大節(jié)約了時(shí)間，提高了效率。另外，毛細(xì)管電泳可以區(qū)分開相差2bp以上的條帶，而聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果只能憑借肉眼觀察，分辨率較低。優(yōu)選地，所述pcr檢測(cè)所用的pcr反應(yīng)體系為10-25μl。如pcr反應(yīng)體系為10μl，包括以下成分：基因組20-50ng,濃度為10μm上下游引物各0.5μl；taqmix5μl，無菌雙蒸水補(bǔ)齊至10μl。相應(yīng)地，若pcr反應(yīng)體系的體積更大，每個(gè)成分相應(yīng)的增加即可。為了獲得穩(wěn)定的檢測(cè)效果，優(yōu)選地，所述pcr反應(yīng)體系中的模板dna的含量不小于5ng,優(yōu)選為20-50ng。優(yōu)選地，待檢測(cè)棉花材料的基因組所用的提取材料為待檢測(cè)棉花材料的種仁。是將該棉花材料的種子去殼得到。本發(fā)明還提供了另一種鑒定棉花閉花授粉材料的方法，若待檢測(cè)棉花材料的花朵開花當(dāng)天花瓣緊閉，散粉正常，并且花粉活性正常，則判斷為棉花閉花授粉材料。該方法采用形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定，只要判斷待檢測(cè)棉花材料在花朵開花當(dāng)天花瓣緊閉，散粉正常，并且花粉活性正常，這三個(gè)特征同時(shí)存在的話，則判斷該待檢測(cè)棉花品種為閉花授粉材料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明提供的引物對(duì)，特異性強(qiáng)，能穩(wěn)定有效地鑒別棉花閉花授粉材料。(2)本發(fā)明提供的鑒定棉花閉花授粉材料的方法，能快速高效地、準(zhǔn)確地、穩(wěn)定地檢測(cè)出是否為閉花授粉材料。(3)本發(fā)明對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳分辨，大大節(jié)約了時(shí)間，提高了效率和準(zhǔn)確性。(4)本發(fā)明還提供了形態(tài)學(xué)鑒定閉花授粉材料的方法，適宜在棉株生長過程中鑒定。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中利用毛細(xì)管電泳分辨引物bnl3875的擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨引物bnl3875的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中正常開花材料的花朵開放動(dòng)態(tài)觀察圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中棉花閉花授粉材料的花朵開放動(dòng)態(tài)觀察圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中棉花閉花授粉材料與正常開花材料的散粉情況觀察圖；圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中棉花閉花授粉材料與正常開花材料的花粉活性觀察圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例11、材料取以下棉花品種的種子：海島棉品種：新海21號(hào)、海7124、吉扎76以及海島棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系3-79；陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系tm-1；黃河流域棉區(qū)陸地棉品種中棉所10號(hào)和魯棉研28號(hào)；長江流域棉區(qū)陸地棉品種蘇棉22號(hào)、川棉239和鄂抗棉9號(hào)；黃河流域和長江流域棉區(qū)陸地棉品種中棉所12；西北內(nèi)陸棉區(qū)陸地棉品種中棉所49、新陸中69號(hào)和新陸棉1號(hào)；棉花閉花授粉材料cj1548143。以上這些棉花品種均可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所獲得。2、dna提取取棉花閉花授粉材料與上述14個(gè)對(duì)照材料的種子，采用sds法提取基因組dna，具體提取步驟如下：(1)剝?nèi)ッ薹N種皮外殼，并盡量保證種仁的完整性。(2)置于放入鋼珠的2ml離心管中，在組織研磨儀上粉碎。(3)加入800μlsds提取液(組成成分:1wt％sds，0.01mol/ledta，0.705mol/lnacl，0.05mol/ltris，0.5wt％山梨醇，1wt％pvp，1wt％β-巰基乙醇)，漩渦充分后，65℃水浴30min，間隔10min左右輕搖一次。(4)加入等體積800μl酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，混勻至不分層，12000r/min離心10min。(5)取上清，加入1μlrnasea(10mg/ml)，37℃水浴30min。(6)重復(fù)抽提一次后離心取上清，加入0.7倍體積異丙醇，緩慢混勻至dna成團(tuán)析出，室溫靜置30min。(7)70％乙醇洗滌dna沉淀2次，無水乙醇洗滌1次。(8)倒置晾干，加入200μlddh2o充分溶解dna，備用，測(cè)定模板dna濃度為20-50ng/μl。3、ssr引物的擴(kuò)增和檢測(cè)以上述提取的基因組dna為模板，針對(duì)陸地棉26條染色體選擇180對(duì)引物(平均每條染色體上最少3對(duì)引物)進(jìn)行ssrpcr擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增程序如表1所示。表1pcr擴(kuò)增程序pcr擴(kuò)增反應(yīng)所用體系為10μl反應(yīng)體系，擴(kuò)增反應(yīng)體系如表2所示。表2pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系所用試劑用量taqmix5.0μl正向引物(10μm)0.5μl反向引物(10μm)0.5μl模板dna1.0μlddh2o3.0μl總體積10μlpcr產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用fa-96全自動(dòng)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)和配套的dnf-910試劑盒。操作過程如下：(1)將試劑盒中的5×buffer稀釋5倍，96孔分析托盤中每孔加1ml，放入毛細(xì)管電泳系統(tǒng)的b托盤中，每跑六板樣品更換一次。(2)在96孔平面pcr板的每個(gè)點(diǎn)樣孔中加入30μlmaker，上面覆蓋一滴mineraloil，放入毛細(xì)管電泳儀m托盤中。(3)每10mlgel和1μldye混合后加入毛細(xì)管電泳儀的gel1盛液瓶中。(4)將試劑盒中的5×conditioningsolution溶液稀釋5倍，加入毛細(xì)管電泳系統(tǒng)的conditioning盛液瓶中，并清空廢液瓶。(5)在96孔板的10μlpcr產(chǎn)物中加入14μl1×te，共24μl。最后一個(gè)點(diǎn)樣孔中加入24μlladder，然后按順序放在毛細(xì)管電泳系統(tǒng)的樣品托盤中。(6)打開fragmentanalyzer軟件按實(shí)際情況進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，每六板一個(gè)循環(huán)，第一板樣品選擇fc-dnf-900-33-dna35-500bp.mthds程序，剩下五板選擇gp-dnf-900-33-dna35-500bp.mthds程序。(7)在prosize2.0軟件中查看結(jié)果相關(guān)信息。通過毛細(xì)管電泳，最終鑒定出10對(duì)在閉花授粉材料中有特異性擴(kuò)增條帶的引物，具體如表3所示。表310對(duì)特異性ssr引物及其序列引物名稱正向引物反向引物nau2173gccaaataggtcacacacaaagcgagaaggagacagaaaanau2343gctttgctttggaatgagatatactgcaacccctcacactnau7024acataagacacaaagagaggaaggaggagagattaaagaatmb1638aaaaccaagaatcgaggaaaaatgcaatcctcgaaggtctttbnl3875catgtaggaacgagcatagtgaacacataccagtcccagtcghau0979cacccctaaagtaacaaacaaaatcttcctcagcactccaagnau1102atctctctgtctcccccttcgcatatctggcgggtataatnau6601tctattttacaacgcgaccatggcaaagtggtaaatgttgnau2251ttctccagtaaccaacaaaggaaaatatcatccccgtcaaadpl0133cagtttctctaccggtctcaaatcggtatcacaccacatactttcacg10對(duì)特異性引物的擴(kuò)增產(chǎn)物如下：引物nau2173的擴(kuò)增組中，閉花授粉材料有268bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而其它對(duì)照均無此大小的片段；引物nau2343的擴(kuò)增組中，閉花授粉材料有419bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而其它對(duì)照均無此大小的片段；引物nau7024的擴(kuò)增組中，閉花授粉材料有276bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而其它對(duì)照均無此大小的片段；引物tmb1638的擴(kuò)增組中，閉花授粉材料有219bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而其它對(duì)照均無此大小的片段；引物bnl3875的擴(kuò)增組中，閉花授粉材料有133bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而其它對(duì)照均無此大小的片段；引物hau0979的擴(kuò)增組中，閉花授粉材料有258bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而其它對(duì)照均無此大小的片段；引物nau1102的擴(kuò)增組中，閉花授粉材料有186bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而其它對(duì)照均無此大小的片段；引物nau6601的擴(kuò)增組中，閉花授粉材料有177bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而其它對(duì)照均無此大小的片段；引物nau2251的擴(kuò)增組中，閉花授粉材料有162bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而其它對(duì)照均無此大小的片段；引物dpl0133的擴(kuò)增組中，閉花授粉材料有210bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而其它對(duì)照均無此大小的片段。具體地，bnl3875的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳的結(jié)果如圖1所示。圖1中，從下至上的曲線依次代表以下的f1-g3；f1：新海21號(hào)；f2：3-79；f3：海7124；f4：吉扎76；f5：tm-1；f6：中棉所10號(hào)；f7：中棉所12；f8：魯棉研28號(hào)；f9：蘇棉22號(hào)；f10：川棉239；f11：鄂抗棉9號(hào)；f12：中棉所49；g1：新陸中69號(hào)；g2：新陸棉1號(hào)；g3：閉花授粉材料。紅色箭頭指示特異性條帶；35bp和1500bp處峰分別指示最低和最高分子量標(biāo)準(zhǔn)。另外，對(duì)應(yīng)于圖1中的pcr產(chǎn)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，具體結(jié)果見圖2。圖2中，1：新海21號(hào)；2：3-79；3：海7124；4：吉扎76；5：tm-1；6：中棉所10號(hào)；7：中棉所12；8：魯棉研28號(hào)；9：蘇棉22號(hào)；10：川棉239；11：鄂抗棉9號(hào)；12：中棉所49；13：新陸中69號(hào)；14：新陸棉1號(hào)；15：閉花授粉材料；m：分子量標(biāo)準(zhǔn)。紅色箭頭指示特異性條帶。綜合考慮，優(yōu)選采用毛細(xì)管電泳分辨ssrpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，相對(duì)于傳統(tǒng)的利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨擴(kuò)增產(chǎn)物，提高了效率和準(zhǔn)確性。聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨擴(kuò)增產(chǎn)物，包括制作聚丙烯酰胺凝膠、點(diǎn)樣、電泳1h和顯色等步驟，一般每次完成48個(gè)樣品，最多96個(gè)樣品的條帶采集。毛細(xì)管電泳分辨擴(kuò)增產(chǎn)物僅需要在擴(kuò)增后的96孔pcr板中加入te緩沖液，電泳1h，直接用prosize2.0軟件觀察條帶，每次可以完成95個(gè)樣品的條帶采集，大大節(jié)約了時(shí)間，提高了效率。另外，毛細(xì)管電泳可以區(qū)分開相差2bp以上的條帶，而聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果只能憑借肉眼觀察，分辨率較低。實(shí)施例2對(duì)已知棉花品種進(jìn)行鑒定，取以下棉花品種在不同種植地或者不同時(shí)期采集到的種子，每個(gè)棉花品種采用10個(gè)種子：海島棉品種：新海21號(hào)、海7124、吉扎76以及海島棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系3-79；陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系tm-1；黃河流域棉區(qū)陸地棉品種中棉所10號(hào)和魯棉研28號(hào)；長江流域棉區(qū)陸地棉品種蘇棉22號(hào)、川棉239和鄂抗棉9號(hào)；黃河流域和長江流域棉區(qū)陸地棉品種中棉所12；西北內(nèi)陸棉區(qū)陸地棉品種中棉所49、新陸中69號(hào)和新陸棉1號(hào)；棉花閉花授粉材料cj1548143。采用實(shí)施例1的dna提取方式提取基因組；對(duì)提取到的基因組測(cè)定濃度，濃度均在5ng/μl以上；進(jìn)行pcr擴(kuò)增，采用的引物為表3中所示，pcr擴(kuò)增程序和擴(kuò)增體系同實(shí)施例1；擴(kuò)增產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳，電泳結(jié)果顯示，這10對(duì)特異性引物均在閉花授粉材料中得到了同實(shí)施例1中的大小的特異性條帶；并且，不同地方或者不同時(shí)期采集得到的閉花授粉材料均得到了一致大小的特異性條帶；而在其他棉花品種中均未得到相應(yīng)大小的特異性條帶。說明，本發(fā)明提供的鑒定棉花閉花授粉材料的方法，鑒定結(jié)果穩(wěn)定可靠。實(shí)施例3棉花閉花授粉材料cj1548143閉花授粉特性的形態(tài)學(xué)鑒定將棉花閉花授粉材料cj1548143種植在河南省安陽市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，以正常開花材料為對(duì)照。在開花期對(duì)當(dāng)天即將開放花朵的動(dòng)態(tài)觀察，與正常開花材料(圖3)明顯不同，棉花閉花授粉材料花朵開花當(dāng)天花瓣緊閉，不開放(圖4)。但是，與正常開放花朵相比，散粉正常(圖5)，花粉活性正常(圖6)。持續(xù)的觀察也表明，閉花授粉的花朵能發(fā)育成棉鈴，完成吐絮，收獲纖維和種子。這些結(jié)果表明，棉花閉花授粉材料能夠自主閉花完成自我授粉。將這些種植得到的對(duì)照組以及閉花授粉材料的種子各收集50個(gè)，采用實(shí)施例2相同的方法進(jìn)行pcr檢測(cè)。pcr產(chǎn)物結(jié)果進(jìn)行毛細(xì)管電泳，閉花授粉材料的50個(gè)樣本均在10對(duì)特異性引物中擴(kuò)增得到了同實(shí)施例1中閉花授粉材料的相應(yīng)大小的特異性條帶；而對(duì)照組的50個(gè)樣本中均未得到這些特異性條帶。盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所<120>鑒定棉花閉花授粉材料的引物對(duì)、試劑盒以及方法<160>20<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gccaaataggtcacacacaa20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2agcgagaaggagacagaaaa20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gctttgctttggaatgagat20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4atactgcaacccctcacact20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5acataagacacaaagagagg20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6aaggaggagagattaaagaa20<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7aaaaccaagaatcgaggaaaaa22<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8tgcaatcctcgaaggtcttt20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9catgtaggaacgagcatagtg21<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10aacacataccagtcccagtcg21<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11cacccctaaagtaacaaacaaa22<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12atcttcctcagcactccaag20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13atctctctgtctcccccttc20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14gcatatctggcgggtataat20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15tctattttacaacgcgacca20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16tggcaaagtggtaaatgttg20<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列<400>17ttctccagtaaccaacaaagg21<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18aaaatatcatccccgtcaaa20<210>19<211>24<212>dna<213>人工序列<400>19cagtttctctaccggtctcaaatc24<210>20<211>24<212>dna<213>人工序列<400>20ggtatcacaccacatactttcacg24當(dāng)前第1頁12