本發(fā)明屬于疾病檢測(cè)試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種丙型肝炎病毒基因分型定量檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)中的丙型肝炎病毒檢測(cè)試劑盒多為abbottmolecular、上海星耀醫(yī)學(xué)、福州泰普、湖南圣湘和李艷等人的產(chǎn)品，其中，abbottmolecular的試劑盒采用熒光定量pcr，可以鑒定基因型1～6及亞型1a和1b，具有內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)體系和防污染系統(tǒng)，檢測(cè)時(shí)間為2h，不能進(jìn)行定量；上海星耀醫(yī)學(xué)的試劑盒采用熒光定量pcr，只能鑒定基因型1和2，具有內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)體系和防污染系統(tǒng)，檢測(cè)時(shí)間為2h，可以進(jìn)行定量；福州泰普的試劑盒采用pcr+雜交，可以鑒定基因型1a、1b、2a、2b、3a、3b和6a，具有內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)體系，無(wú)防污染系統(tǒng)，檢測(cè)時(shí)間為4～5h，不能進(jìn)行定量，由于pcr后需要開(kāi)管后取出pcr產(chǎn)物再進(jìn)行雜交，容易造成pcr污染從而增加了產(chǎn)生假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)；湖南圣湘的試劑盒采用熒光定量pcr，只能鑒定基因型1、2、3和6，具有內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)體系，無(wú)防污染系統(tǒng)，檢測(cè)時(shí)間為2h，不能進(jìn)行定量；李艷等人的試劑盒采用測(cè)序法，可以鑒定到亞型，但需要測(cè)序測(cè)序后比對(duì)獲得具體型別信息，無(wú)內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)體系和防污染系統(tǒng)，檢測(cè)時(shí)間為4～5h，不能進(jìn)行定量，操作復(fù)雜、成本高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種丙型肝炎病毒基因分型定量檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種丙型肝炎病毒基因分型定量檢測(cè)試劑盒，包括第一至第八檢測(cè)組件，每一檢測(cè)組件均包括pcr緩沖液、mgcl2、dntps、taq酶、ung酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、tmac、熒光檢測(cè)探針、檢測(cè)引物、內(nèi)標(biāo)熒光探針dip、內(nèi)標(biāo)正向引物dif和內(nèi)標(biāo)反向引物dir，第一至第八檢測(cè)組件的熒光定量pcr反應(yīng)程序均一致，dntps由等量的datp、dctp、dgtp和dutp組成，內(nèi)標(biāo)熒光探針dip包括如seqidno01所示的序列，內(nèi)標(biāo)正向引物dif包括如seqidno02所示的序列，內(nèi)標(biāo)反向引物dir包括如seqidno03所示的序列；

第一檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型1、基因型2和基因型3，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-1、p-2a/c、p-2b和p-3，檢測(cè)引物包括f-3、r-1和r-3；

第二檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型1a，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-1a/g，檢測(cè)引物包括f-1和r-1a；

第三檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型1b，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-1b，檢測(cè)引物包括f-1b和r-1b；

第四檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型2a/c和基因型3a，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-2a/c和p-3a，檢測(cè)引物包括f-1、f-4、r-3a和r-5；

第五檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型4a，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-4，檢測(cè)引物包括f-4和r-3b/4a；

第六檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型5a，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-5，檢測(cè)引物包括f-5和r-5；

第七檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型6a、基因型2b和基因型3b，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-3b、p-6a和p-2b，檢測(cè)引物包括f-1b、f-3b、r-3b/4a和r-2b/c；

第八檢測(cè)組件用以hcv陽(yáng)性，其中，熒光檢測(cè)探針包括cp3，檢測(cè)引物包括cf和cr2；

上述熒光檢測(cè)探針p-1、p-1a/g、p-1b、p-2a/c、p-2b、p-3、p-3a、p-3b、p-4、p-5、p-6a和cp3依次包括如seqidno04至15所示的序列；上述檢測(cè)引物f-1、f-1b、f-3b、f-4、f-5、r-1、r-1a、r-1b、r-2b/c、r-3、r-3a、r-3b/4a、r-5、cf和cr2依次包括如seqidno16～30所示的序列。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述內(nèi)標(biāo)熒光探針dip如seqidno01所示，內(nèi)標(biāo)正向引物dif如seqidno02所示，內(nèi)標(biāo)反向引物dir如seqidno03所示。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述熒光檢測(cè)探針p-1、p-1a/g、p-1b、p-2a/c、p-2b、p-3、p-3a、p-3b、p-4、p-5、p-6a和cp3依次如seqidno04至15所示。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述檢測(cè)引物f-1、f-1b、f-3b、f-4、f-5、r-1、r-1a、r-1b、r-2b/c、r-3、r-3a、r-3b/4a、r-5、cf和cr2依次如seqidno16～30所示。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，其熒光定量pcr反應(yīng)程序如下：95℃，5min；95℃，5s，60℃，35s，72℃，30s，15個(gè)循環(huán)；95℃，5s，60℃，35s，72℃，30s，35個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明采用分子信標(biāo)作為探針對(duì)各hcvrna基因型及亞型進(jìn)行熒光定量pcr閉管檢測(cè)，第一至第七檢測(cè)組件實(shí)現(xiàn)對(duì)多達(dá)6種基因型(多達(dá)10種亞型)的鑒定；第八檢測(cè)組件表征hcv陽(yáng)性并通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可進(jìn)行定量。

2、本發(fā)明的試劑盒均為閉管操作，盡可能地避免了pcr污染。

3、本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，只需將提取好的hcvrna核酸依次加入到第一至第八檢測(cè)組件中，放入熒光定量pcr中反應(yīng)并檢測(cè)即可讀取分析結(jié)果，判斷基因型及亞型。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的第一檢測(cè)組件的檢測(cè)結(jié)果圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1的第二檢測(cè)組件的檢測(cè)結(jié)果圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1的第三檢測(cè)組件的檢測(cè)結(jié)果圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1的第四檢測(cè)組件的檢測(cè)結(jié)果圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1的第五檢測(cè)組件的檢測(cè)結(jié)果圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1的第六檢測(cè)組件的檢測(cè)結(jié)果圖

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1的第七檢測(cè)組件的檢測(cè)結(jié)果圖

圖8為本發(fā)明實(shí)施例1的第八檢測(cè)組件的檢測(cè)結(jié)果圖

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明和描述。

實(shí)施例1：

一種丙型肝炎病毒基因分型定量檢測(cè)試劑盒，包括第一至第八檢測(cè)組件，每一檢測(cè)組件均包括pcr緩沖液、mgcl2、dntps、taq酶、ung酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、tmac、熒光檢測(cè)探針、檢測(cè)引物、內(nèi)標(biāo)熒光探針dip、內(nèi)標(biāo)正向引物dif和內(nèi)標(biāo)反向引物dir，第一至第八檢測(cè)組件的熒光定量pcr反應(yīng)程序均一致，dntps由等量的datp、dctp、dgtp和dutp組成，內(nèi)標(biāo)熒光探針dip如seqidno01所示，內(nèi)標(biāo)正向引物dif如seqidno02所示，內(nèi)標(biāo)反向引物dir如seqidno03所示；

第一檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型1、基因型2和基因型3，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-1、p-2a/c、p-2b和p-3，檢測(cè)引物包括f-3、r-1和r-3；

第二檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型1a，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-1a/g，檢測(cè)引物包括f-1和r-1a；

第三檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型1b，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-1b，檢測(cè)引物包括f-1b和r-1b；

第四檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型2a/c和基因型3a，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-2a/c和p-3a，檢測(cè)引物包括f-1、f-4、r-3a和r-5；

第五檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型4a，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-4，檢測(cè)引物包括f-4和r-3b/4a；

第六檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型5a，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-5，檢測(cè)引物包括f-5和r-5；

第七檢測(cè)組件用以檢測(cè)基因型6a、基因型2b和基因型3b，其中，熒光檢測(cè)探針包括p-3b、p-6a和p-2b，檢測(cè)引物包括f-1b、f-3b、r-3b/4a和r-2b/c；

第八檢測(cè)組件用以hcv陽(yáng)性，其中，熒光檢測(cè)探針包括cp3，檢測(cè)引物包括cf和cr2；

上述熒光檢測(cè)探針p-1、p-1a/g、p-1b、p-2a/c、p-2b、p-3、p-3a、p-3b、p-4、p-5、p-6a和cp3依次如seqidno04至15所示；上述檢測(cè)引物f-1、f-1b、f-3b、f-4、f-5、r-1、r-1a、r-1b、r-2b/c、r-3、r-3a、r-3b/4a、r-5、cf和cr2依次如seqidno16～30所示。

具體的探針和引物的序列如下表所示：

將上述第一至第八檢測(cè)組件分別置于第一直第八管中進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，具體反應(yīng)體系如下：

1、第一管

2、第二管

3、第三管

4、第四管

5、第五管

6、第六管

7、第七管

8、第八管

上述第一至第八關(guān)的反應(yīng)程序均如下表所示：

上述第一至第八管的檢測(cè)的熒光信號(hào)如下表所示，結(jié)果依次如圖1至圖8所示：

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。

<110>英科新創(chuàng)（蘇州）生物科技有限公司

<120>一種丙型肝炎病毒基因分型定量檢測(cè)試劑盒

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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