本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種具有蠟酯合成活性和甘油三酯合成活性的雙功能酶及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甘油三酯(triacylglyceride、tag)與蠟酯(waxester、we)是一類中性油脂，分別由脂肪醇，二?；视团c長(zhǎng)鏈脂肪酸酯化作用形成。蠟酯的組成部分碳鏈長(zhǎng)度一般為中長(zhǎng)鏈或長(zhǎng)鏈，例如c16，c18，c20或者更長(zhǎng)的碳鏈。

蠟酯在自然界的來(lái)源廣泛，種類繁多。并以其良好的性能廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，例如在在食品營(yíng)養(yǎng)方面，工業(yè)，化妝品業(yè)以及制藥行業(yè)都有著很重要的應(yīng)用價(jià)值。

在植物，動(dòng)物，微生物體等體內(nèi)蠟酯廣泛存在，并且在生物體內(nèi)以及生物活動(dòng)中有著重要功能。首先蠟酯以儲(chǔ)存能量的形式存在于許多微生物以及原核生物體內(nèi)。在植物，一些昆蟲的體內(nèi)的蠟酯能保護(hù)植物防止其水分揮發(fā)導(dǎo)致的干旱，過(guò)強(qiáng)的紫外線照射造成的傷害以及病原微生物入侵。植物表面的角質(zhì)層的蠟酯成分，含量也因環(huán)境的變化而發(fā)生變化。在抹香鯨體內(nèi)提取的鯨油也存在著蠟酯和甘油三酯等中性油脂，鯨通過(guò)改變其中蠟酯以及甘油三酯的混合物的密度的變化從而有效改變其在水中的浮力；蠟酯在鯨魚的聲音傳遞過(guò)程中也起到重要作用。抹香鯨可以加熱或者冷卻頭部鼻腔中的蠟酯來(lái)調(diào)節(jié)浮力。一般生活在兩極的深海中的海生生物體內(nèi)蠟酯含量最為豐富，如鮭魚，珊瑚蟲等。很多海洋浮游動(dòng)物能夠利用海洋浮游植物為食，合成蠟酯。

蠟酯通常以固態(tài)以及液態(tài)兩種形態(tài)存在，昆蟲中的動(dòng)物蠟，如白蠟蟲分泌堅(jiān)硬的白色動(dòng)物蠟以及蜂蠟都是以長(zhǎng)碳鏈的飽和的脂肪酸與脂肪醇形成的多為固態(tài)蠟酯。而碳鏈長(zhǎng)度低，飽和度高的碳鏈形成的蠟酯則是液態(tài)，流動(dòng)性較好。

液體蠟酯是一種經(jīng)濟(jì)油脂，在工業(yè)中也有著重要應(yīng)用價(jià)值，例如食品行業(yè)，化妝品，醫(yī)藥以及化工產(chǎn)品，例如潤(rùn)滑油多以蠟酯為原料，一般來(lái)自于石油的蠟脂多為飽和的長(zhǎng)鏈單酯這使得其在低溫下流動(dòng)性差，不飽和長(zhǎng)鏈單酯的流動(dòng)性較好，熱穩(wěn)定性與氧化穩(wěn)定性也高于長(zhǎng)鏈飽和蠟酯。但由于天然蠟酯產(chǎn)物主要來(lái)自于動(dòng)植物及礦石，其中作為不飽和蠟酯的主要來(lái)源就是加州西蒙德木種子，主要由多為長(zhǎng)碳鏈的c20，c22，c24等多不飽和脂肪酸與脂肪醇形成。鯨魚體內(nèi)提取蠟酯也是獲得液體蠟酯的一種傳統(tǒng)方式，但自然資源十分有限，工業(yè)等需求量巨大，使其應(yīng)用受到了很大的限制，而液體蠟酯也被稱為液體黃金。目前，使用化學(xué)法合成蠟酯的成本十分高昂。

在當(dāng)今面臨著能源匱乏，石化資源枯竭，環(huán)境惡化等問(wèn)題與挑戰(zhàn)。因此開(kāi)發(fā)新型來(lái)源，可再生的生物能源具有重要意義。微生物生產(chǎn)功能油脂是生物柴油開(kāi)發(fā)的重要組成，利用微生物生產(chǎn)蠟酯具有眾多優(yōu)勢(shì)，例如：生產(chǎn)周期短，發(fā)酵原料豐富等。利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)微生物在蠟酯合成的方面作出有針對(duì)性的改良，產(chǎn)生新型，高產(chǎn)，可再生的蠟酯滿足工業(yè)需求是十分必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有蠟酯合成活性和甘油三酯合成活性的雙功能酶，該雙功能酶來(lái)海洋原生生物破囊壺菌(thraustochytriumroseum)，在底物存在的條件下，能夠催化底物合成蠟酯和/或甘油三酯。

本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述雙功能酶的基因。

本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述基因的載體。

本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述載體的重組細(xì)胞。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因在生產(chǎn)蠟酯和/或甘油三酯中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述雙功能酶或上述基因在生產(chǎn)蠟酯和/或甘油三酯中的應(yīng)用。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種具有蠟酯合成活性和甘油三酯合成活性的雙功能酶，所述雙功能酶來(lái)自破囊壺菌(thraustochytriumroseum)，其氨基酸序列如seqidno:1或seqidno:3所示。

編碼上述雙功能酶的基因。

含有上述基因的載體。

含有上述載體的重組細(xì)胞。

上述基因在生產(chǎn)蠟酯和/或甘油三酯中的應(yīng)用。

上述雙功能酶在生產(chǎn)蠟酯和/或甘油三酯中的應(yīng)用。

一種生產(chǎn)蠟酯和/或甘油三酯的方法，其特征在于，用上述雙功能酶催化底物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供的具有蠟酯合成活性和甘油三酯合成活性的雙功能酶，來(lái)自海洋原生生物破囊壺菌(thraustochytriumroseum)，其氨基酸序列如seqidno:1或seqidno:3所示。本發(fā)明的研究顯示seqidno:1所示的雙功能酶(trwsd4)和seqidno:3所示的雙功能酶(trwsd5)均是一種新的兼具蠟酯合成酶和甘油三酯合成酶活性的酶，二者均能合成蠟酯和和/或甘油三酯，其為蠟酯合成酶類的基礎(chǔ)研究提供了新的思路。此外，本發(fā)明提供的相應(yīng)的編碼基因能夠在宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)出雙功能酶，轉(zhuǎn)化該編碼基因的宿主能夠重新合成蠟酯，為后期進(jìn)行基因工程改造以及工業(yè)應(yīng)用生產(chǎn)蠟酯和/或甘油三酯奠定了基礎(chǔ)和提供了新的手段和思路。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的pet-23(b+)::trwsd4載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌rossettade3中的菌落pcr檢測(cè)結(jié)果；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2提供的trwsd4酶溶液的sds-page分析圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3提供的trwsd4酶對(duì)于不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪?；o酶a的米氏方程曲線圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4提供的溫度和鹽濃度對(duì)trwsd4酶活力的影響結(jié)果；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4提供的trwsd4酶的ws活性與dgat活性比較結(jié)果；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1提供的pmbpc::trwsd5載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌中的菌落pcr檢測(cè)結(jié)果和實(shí)施例5提供的trwsd5酶溶液的sds-page分析結(jié)果；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例6提供的trwsd5酶對(duì)于不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪?；o酶a的米氏方程曲線圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例7提供的溫度和鹽濃度對(duì)trwsd5酶活力的影響結(jié)果；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例7提供的trwsd5酶的ws活性與dgat活性比較結(jié)果；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例7提供的轉(zhuǎn)化trwsd4基因和trwsd5基因的酵母總油脂的薄層層析結(jié)果；

圖11為本發(fā)明實(shí)施例1提供的pet-23(b+)::trwsd4載體的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖12為本發(fā)明實(shí)施例1提供的pmbpc::trwsd5載體的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖13為本發(fā)明實(shí)施例8提供的pesc-ura::trwsd4載體的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖14為本發(fā)明實(shí)施例8提供的pesc-ura::trwsd5載體的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖15為本發(fā)明實(shí)施例8提供的trwsd4酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的蠟酯的gc-ms分析結(jié)果圖；

圖16為本發(fā)明實(shí)施例8提供的trwsd5酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的蠟酯的gc-ms分析結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的一種具有蠟酯合成活性和甘油三酯合成活性的雙功能酶及其編碼基因和應(yīng)用進(jìn)行具體說(shuō)明。

蠟酯合成酶以及脂酰輔酶a:二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶ws/dgat首次是在貝氏不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)。蠟酯合成酶以及脂酰輔酶a:二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶ws/dgat能夠催化蠟酯以及甘油三酯形成的終反應(yīng)，蠟酯合成酶以及脂酰輔酶a:二?；D(zhuǎn)移酶分別以長(zhǎng)鏈脂肪酸以及長(zhǎng)鏈脂肪醇或者二?；视蜑榈孜?，通過(guò)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成蠟酯以及甘油三酯。

真核生物與原核生物的油脂甘油三酯(tag)以及蠟酯(waxesters，we)生物合成過(guò)程不同。這些油脂在微生物體內(nèi)的主要功能是能量存儲(chǔ)以及作為碳源，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的游離脂肪酸含量較高時(shí)，合成油脂，例如利用產(chǎn)生蠟酯這種無(wú)毒的物質(zhì)來(lái)存儲(chǔ)能量能夠利用游離脂肪酸，從而減少其對(duì)于細(xì)胞膜的破壞作用。

破囊壺菌(thraustochytriumroseum)是一種海洋類原生生物，異養(yǎng)，常分布于海洋，紅樹林根部。屬于不等毛門，網(wǎng)黏菌綱，破囊壺菌目，破囊壺菌科。破囊壺菌的含油量尤為豐富，其自身的含油量占細(xì)胞干重的比例的50％，而在破囊壺菌中主要富含兩種脂肪酸，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸dha(c22:6)與棕櫚酸(c16:0)，其中dha占到了總脂肪酸含量的60％以上。而這些脂肪酸大多是以甘油三酯tag的形式存在。dha具有較高的商業(yè)利用價(jià)值，在保健品的開(kāi)發(fā)利用方面有著巨大的潛力。因此，破囊壺菌相對(duì)于其他dha來(lái)源，具有較多的優(yōu)勢(shì)，比如生長(zhǎng)速度快，dha含量較高易于得到純品等。

本發(fā)明的發(fā)明人在長(zhǎng)期的研究過(guò)程中，以油脂含量豐富的海洋原生生物來(lái)自于破囊壺菌科的菌株基因組為模板，測(cè)得全基因序列，分析預(yù)測(cè)其基因組可能存在ws/dgat雙功能酶的基因，預(yù)測(cè)具有蠟酯合成以及甘油三酯合成的雙功能酶。通過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)，本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該菌存在蠟酯合成酶/脂酰輔酶a：二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(ws/dgats，也就是具有蠟酯合成活性和甘油三酯合成活性的雙功能酶)的基因有兩個(gè)，在現(xiàn)有文獻(xiàn)并未有見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，將其分別命名trwsd4基因(編碼trwsd4酶)和trwsd5基因(編碼trwsd5酶)。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了上述的trwsd4酶和trwsd5酶的蠟酯合成活性和甘油三酯合成活性的雙功能。

基于此，一方面，本發(fā)明提供了一種具有蠟酯合成活性和甘油三酯合成活性的雙功能酶，上述雙功能酶來(lái)自破囊壺菌(thraustochytriumroseum)，其氨基酸序列如seqidno:1或seqidno:3所示。trwsd4酶的氨基酸序列如seqidno:1所示，trwsd5酶的氨基酸序列如seqidno:3所示。

基于此，另一方面，本發(fā)明提供了編碼上述雙功能酶的基因。

根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，在氨基酸序列清楚的情況下，相應(yīng)的編碼上述雙功能酶的基因序列可有多種情況，其均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

可選地，本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述基因的核苷酸序列如seqidno:2、seqidno:4、seqidno:5或seqidno:6所示。用于編碼trwsd4酶的trwsd4基因的核苷酸序列如seqidno:2所示；用于編碼trwsd5酶的trwsd5基因的核苷酸序列如seqidno:4、seqidno:5或seqidno:6所示；其中，seqidno:5是在seqidno:4的基礎(chǔ)上優(yōu)化后的適于在大腸桿菌中表達(dá)的編碼序列，seqidno:6是在seqidno:4的基礎(chǔ)上優(yōu)化后的適于在酵母細(xì)胞中表達(dá)的編碼序列。

另一方面，本發(fā)明提供了含有上述基因的載體。

可選地，本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述載體為pmbpc載體、pmd-19t-simple載體、pet-23(b+)表達(dá)載體以及pesc-ura表達(dá)載體中的一種。

另一方面，本發(fā)明提供了含有上述載體的重組細(xì)胞。

可選地，本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述重組細(xì)胞為酵母菌或大腸桿菌。

另一方面，本發(fā)明提供了一種制備上述雙功能酶的方法，其包括：培養(yǎng)上述重組細(xì)胞。

另一方面，本發(fā)明提供了上述基因在生產(chǎn)蠟酯和/或甘油三酯中的應(yīng)用。

例如，將trwsd4和trwsd5兩個(gè)基因分別構(gòu)建到用于釀酒酵母的表達(dá)載體pesc-ura上，并將表達(dá)載體分別通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化到釀酒酵母saccharomvcescerevisiae-h1246中，h1246是一株甘油三酯以及蠟酯合成的缺陷型酵母。經(jīng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)后，提取酵母胞內(nèi)油脂，并且通過(guò)薄層層析tlc分析發(fā)現(xiàn)缺該陷型酵母產(chǎn)生了蠟酯。說(shuō)明trwsd4與trwsd5兩個(gè)基因都能夠合成蠟酯，發(fā)揮功能，為后續(xù)有效利用微生物產(chǎn)生蠟酯奠定了基礎(chǔ)。

此外，在本發(fā)明實(shí)施例中，將這兩個(gè)基因trwsd4與trwsd5分別在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，并且通過(guò)層析純化后得到相應(yīng)目的蛋白(trwsd4酶和trwsd5酶)，在體外測(cè)定兩種蛋白的酶活性，結(jié)果顯示這兩種蛋白都表現(xiàn)出了較高的蠟酯合成酶活性和較低的二?；视王；D(zhuǎn)移酶活性(即甘油三酯合成酶活性)。

另一方面，本發(fā)明提供了上述基因在具有蠟酯合成活性和甘油三酯合成活性的雙功能酶中的應(yīng)用。

另一方面，本發(fā)明提供了上述雙功能酶在生產(chǎn)蠟酯和/或甘油三酯中的應(yīng)用。

可選地，本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用上述雙功能酶接觸底物。

可選地，本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述底物包括碳鏈長(zhǎng)度為8-20的偶數(shù)碳鏈?；鵦oa，例如c8:0-coa，c10:0-coa，c12:0-coa，c14:0-coa，c16:0-coa，c18:0-coa。

可選地，本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述底物為碳鏈長(zhǎng)度為10的飽和酰基coa(c10:0-coa)或者為碳鏈長(zhǎng)度為12的飽和?；鵦oa(c12:0-coa)。

體外活性實(shí)驗(yàn)顯示：本發(fā)明提供的trwsd4酶和trwsd5酶可以催化不同碳鏈長(zhǎng)度的酰基coa和脂肪醇例如棕櫚醇底物形成蠟酯和/或甘油三酯。

trwsd4對(duì)于碳鏈長(zhǎng)度為12的飽和?；鵦oa(c12:0-coa)的km值最低，并且酶催化效率參數(shù)kcat/km值最大，trwsd4對(duì)于中長(zhǎng)鏈飽和?；鵦oa均表現(xiàn)出較高的底物親和性。

trwsd4的最適反應(yīng)鹽濃度測(cè)試結(jié)果顯示：以37℃，0mmnacl時(shí)測(cè)得的酶反應(yīng)初速率為100％，在nacl濃度為400mm時(shí)，其相對(duì)酶活力接近100％，當(dāng)鹽濃度范圍超過(guò)400mm時(shí)，相對(duì)酶活力逐漸降低，當(dāng)鹽濃度為1600mm時(shí)，相對(duì)酶活力降低至30％左右，當(dāng)反應(yīng)體系中的nacl濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)對(duì)該酶活力影響較大。trwsd4酶的最適鹽濃度為0-400mm。

trwsd4的最適反應(yīng)溫度測(cè)試結(jié)果顯示：以37℃測(cè)得的酶反應(yīng)初速率為100％，在溫度范圍為7℃～47℃時(shí)，相對(duì)酶活力隨著溫度的增加而增加；在47℃時(shí)，相對(duì)酶活力達(dá)到最高；當(dāng)溫度大于47℃時(shí)，為57℃時(shí)，酶活力降低，相對(duì)酶活力可僅為50％多左右；trwsd4的最適溫度為47℃。

trwsd5對(duì)于碳鏈長(zhǎng)度為10的飽和?；鵦oa(c10:0-coa)的km值最低，并且酶催化效率參數(shù)kcat/km值最大，表明trwsd5對(duì)于c10:0-coa表現(xiàn)出最強(qiáng)的底物親和性。

trwsd5的最適反應(yīng)鹽濃度測(cè)試結(jié)果顯示：以0mmnacl酶活力為100％，在nacl濃度為400mm時(shí)，其相對(duì)酶活力高于100％，當(dāng)鹽濃度范圍400mm-1200mm時(shí)，相對(duì)酶活力逐漸增加，當(dāng)鹽濃度為1600mm時(shí)，相對(duì)酶活力降低至60％左右。當(dāng)反應(yīng)體系中的nacl濃度范圍為400mm至1200mm時(shí)，促進(jìn)了trwsd5的催化反應(yīng)，利于酶催化反應(yīng)進(jìn)行。在反應(yīng)體系中nacl的濃度為800mm時(shí)，相對(duì)酶活力最高，800mm的nacl濃度為trwsd5的最適鹽濃度。

trwsd5的最適反應(yīng)溫度測(cè)試結(jié)果顯示：以設(shè)置37℃的反應(yīng)條件下的反應(yīng)速率為100％，其他條件下測(cè)得的酶活力以相對(duì)酶活力來(lái)表示；在溫度范圍為7℃～47℃時(shí)，相對(duì)酶活力隨著溫度的增加而增加。當(dāng)反應(yīng)溫度在37℃，相對(duì)酶活力達(dá)到最大，47℃時(shí)，相對(duì)酶活力為98％左右，相對(duì)酶活力并未發(fā)生較大的變化。當(dāng)反應(yīng)溫度為57℃時(shí)酶活力降低，相對(duì)酶活力可達(dá)到50％多左右，trwsd5的最適溫度為37℃。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

trwsd4基因和trwsd5基因的克隆

1.1trwsd4基因的克隆

1.1.1提取破囊壺菌(thraustochytriumroseum，atcc28210)的rna，經(jīng)rt-pcr得到cdna模板。

1.1.2以trwsd4-for與trwsd4-rev為引物(序列見(jiàn)表1)，以得到的cdna為模板，用高保真酶(phusionhigh-fidelitydnapolymerase；thermo)進(jìn)行pcr，50μlpcr反應(yīng)體系：5×hfbuffer10μl，dntp(10mm)1μl，trwsd4pet-23b-for(10mm)1μl，trwsd4pet-23b-rev(10mm)1μl，phusiondnapolymerase1μl，cdna2μl，ddh2o補(bǔ)齊至50μl。

反應(yīng)程序設(shè)定參照phusionhigh-fidelitydnapolymerase進(jìn)行，如下：98℃30s，98℃10s、55℃30s、72℃30s、30個(gè)循環(huán)，72℃10min。

表1

1.1.3取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物3μl，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶是否正確目的片段(trwsd4基因)，trwsd4基因的核苷酸序列如seqidno:2，長(zhǎng)度為1611bp，其編碼出的trwsd4酶的氨基酸序列如seqidno:1所示，分子量為64.3kda。待檢測(cè)正確后，使用dna純化回收試劑盒回收pcr產(chǎn)物，得到含目的片段的膠回收液。具體操作參照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.1.4將得到的目的片段連接到pmd-19t-simple克隆載體上

(1)將目的片段與datp連接，50μl反應(yīng)體系：膠回收液35μl，10×taqbuffer5μl，10mmdatp2μl，mgcl24μl，taq酶0.5μl，ddh2o3.5μl；pcr反應(yīng)條件:72℃，20min；12℃，5min。

(2)反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系：10×buffer1μl，t4-dna連接酶0.5μl，pmd-19t-simple0.5μl，插入片段(即步驟(1)的連接產(chǎn)物)6μl，ddh2o2μl；反應(yīng)條件：22℃-25℃，反應(yīng)30min～60min，得到連接產(chǎn)物，含有trwsd4基因的克隆載體，命名為pmd-19t-simple::trwsd4。

1.1.5將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌trans5α感受細(xì)胞，在lb培養(yǎng)基(含有氨芐抗生素)上挑選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)菌落pcr驗(yàn)證后，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，送武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.1.6參照康為世紀(jì)有限公司質(zhì)粒小提試劑盒的說(shuō)明，對(duì)測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子，提質(zhì)粒(即trwsd4-pmd-19t-simple)，然后進(jìn)行雙酶切(bamhi+xholi)，酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收trwsd4基因片段，將其連接至經(jīng)同樣雙酶切后的pet-23(b+)表達(dá)載體上。得到含trwsd4基因片段的表達(dá)載體，命名為pet-23(b+)::trwsd4，如圖11所示。

1.1.7將連接產(chǎn)物pet-23(b+)::trwsd4轉(zhuǎn)化大腸桿菌trans5α感受細(xì)胞，在lb培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后挑選轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示(圖中：m為dl5000dnamarker；1、2、3、4為菌落pcr產(chǎn)物)。從圖1可看出，1、2、3、4泳道上在1600bp位置有條帶，說(shuō)明1、2、3、4為陽(yáng)性的trwsd4重組菌株。

1.1.8挑取相應(yīng)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，搖菌培養(yǎng)后送武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2trwsd5基因的克隆

1.2.1以trwsd5原始基因序列(seqidno:4所示)為基礎(chǔ)，對(duì)基因序列進(jìn)行了易于大腸桿菌為宿主表達(dá)的密碼子優(yōu)化，并化學(xué)合成優(yōu)化后的trwsd5基因(seqidno:5所示，其編碼seqidno:3所示的trwsd5酶)，將其構(gòu)建至puc-57載體上，得到質(zhì)粒載體puc-57::trwsd5。trwsd5原始基因的核苷酸序列如seqidno:4所示，長(zhǎng)度為1488bp，其編碼出的trwsd5酶的氨基酸序列如seqidno:3所示，分子量為99kda。

1.2.2以trwsd5-pmbpc-for與trwsd5-pmbpc-rev為引物(序列見(jiàn)表1)，以puc-57::trwsd5為模板，采用高保真酶(phusionhigh-fidelitydnapolymerase；thermo)，對(duì)trwsd5基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增。50μl反應(yīng)體系：5×hfbuffer10μl，dntp(10mm)1μl，trwsd5-pmbpc-for(10mm)1μl，trwsd5-pmbpc-rev(10mm)1μl，phusiondnapolymerase1μl，puc-57::trwsd52μl，ddh2o補(bǔ)齊至50μl。反應(yīng)程序設(shè)定參照phusionhigh-fidelitydnapolymerase進(jìn)行，如下所示：98℃30s，98℃10s、55℃30s、72℃30s、30個(gè)循環(huán)，72℃10min。

1.2.3取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物3μl，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶是否正確。待檢測(cè)正確后，使用dna純化回收試劑盒回收pcr產(chǎn)物。具體操作參照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4將回收得到的trwsd5基因片段，用限制性內(nèi)切酶bamhi與ecori進(jìn)行酶切；將其連接至經(jīng)同樣雙酶切后的pmbpc載體，得到連接產(chǎn)物(含trwsd5基因片段的表達(dá)載體，命名為pmbpc::trwsd5，如圖12所示)。

1.2.5將連接產(chǎn)物pmbpc::trwsd5轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受細(xì)胞，在lb培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后挑選轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，用引物trwsd5-for和trwsd5-rev(序列見(jiàn)表1)進(jìn)行菌落pcr反應(yīng)。結(jié)果如圖6中的a所示(圖6的a顯示了pmbpc::trwsd5載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌中的菌落pcr檢測(cè)結(jié)果，圖6的a中：m為trans2kplusiidnamarker；1、2、3為trwsd5重組菌株的pcr檢測(cè))。

1.2.6挑取相應(yīng)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，搖菌培養(yǎng)后送武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

實(shí)施例2

trwsd4酶和trwsd5酶的表達(dá)和純化

2.1trwsd4酶的表達(dá)和純化

2.1.1將重組表達(dá)載體pet-23(b+)::trwsd4轉(zhuǎn)化大腸桿菌rosettade3，轉(zhuǎn)化方法參照transettade3感受態(tài)細(xì)胞的說(shuō)明書進(jìn)行。得到含pet-23(b+)::trwsd4載體的大腸桿菌(trwsd4陽(yáng)性表達(dá)菌株)，將其接種于lb液體培養(yǎng)基(含amp)中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，以1％的接種量轉(zhuǎn)接入100ml的lb+amp中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，至其菌體濃度生長(zhǎng)至od600值0.6時(shí)，加入1mmiptg誘導(dǎo)trwsd4酶表達(dá)(trwsd4蛋白的c端表達(dá)有his-tag標(biāo)簽，his-tag標(biāo)簽的作用在與ni柱中的ni²⁺結(jié)合有利于后續(xù)純化)。再置于28℃，120rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。

2.1.2在4000rpm、4℃條件下，離心收集菌體，-80℃存儲(chǔ)。

2.1.3在冰上解凍菌體，并用預(yù)冷的25mm的緩沖液溶解菌體，用超聲波細(xì)胞破碎儀對(duì)菌體破碎處理，并使細(xì)胞處于冰浴的狀態(tài)，以超聲2s，停3s的方式，至菌體溶液澄清，透亮。

2.1.4將破碎細(xì)胞于高速12000rpm離心15min后，用0.45μm的濾膜對(duì)離心后的液體進(jìn)行過(guò)濾，并添加與bindingbuffer(ph7.4，25mmtris-hcl，500mmnacl，30mm咪唑)中相同的咪唑濃度，轉(zhuǎn)移溶液到離心管中，使其置于冰浴狀態(tài)。

2.1.5取一定量去離子水，經(jīng)過(guò)超聲后去除其中氣泡。將histrapff與紫外檢測(cè)器(hd-3000型，上海嘉鵬公司)蠕動(dòng)泵相連接，并調(diào)節(jié)紫外檢測(cè)器至280nm處。用去氣泡后的水潤(rùn)洗管道，并低流速連接histrapff，以避免空氣進(jìn)入柱體當(dāng)中，后續(xù)調(diào)節(jié)流速至1ml/min。在去離子水潤(rùn)洗柱子5個(gè)體積后。關(guān)閉泵閥，將進(jìn)液管換至bindingbuffer，同樣以1ml/min洗脫5個(gè)體積。此時(shí)，調(diào)節(jié)吸光值a為0。

2.1.6將樣品置于冰浴環(huán)境中，準(zhǔn)備上樣。將流速調(diào)節(jié)至0.5ml/min，隨著上樣量增大，觀察檢測(cè)器吸光值是否逐漸增大至一定值后，保持不變。直至上樣結(jié)束，吸光值保持在某個(gè)特定值處。更換bindingbuffer，洗脫柱子，使吸光值降低至0左右。此時(shí)，更換elutionbuffer(ph7.4，25mmtris-hcl，500mmnacl，500mm咪唑)洗脫，并觀察吸光值出峰處，用離心管收集，每管收集0.5ml-1ml。待吸光值將至不變值后，再用elutionbuffer洗脫5ml左右。最后用去離子水沖洗柱子，得到trwsd4酶溶液。

2.1.7對(duì)所收集的trwsd4酶溶液用12％sds-page檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示(圖中：m為蛋白質(zhì)marker；1為純化的trwsd4酶溶液)。

trwsd4酶分子量預(yù)測(cè)值約為77kda，從圖2可看出，在75kda左右位置有條帶，與預(yù)測(cè)值接近，且條帶較為單一。

實(shí)施例3

3.1trwsd4酶對(duì)9種不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酰基輔酶a酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定以及底物偏好性分析

酶活力測(cè)定原理：ws/dgat屬于轉(zhuǎn)移酶，對(duì)酯鍵上的羥基進(jìn)行親核攻擊，以便將脂肪酰轉(zhuǎn)移，該酶能將脂肪醇中的羥基去質(zhì)子，以便于催化乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移。釋放的游離coa與dtnb(5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸))反應(yīng)生成ntb^2-，該離子為黃色，在412nm存在吸光值，依據(jù)其od值隨反應(yīng)時(shí)間變化，測(cè)得相應(yīng)酶學(xué)數(shù)據(jù)。

trwsd4酶(或trwsd5酶)的酶活力測(cè)定反應(yīng)體系包括：磷酸緩沖液，dtnb，棕櫚醇(c16alcohol)，脂肪?；o酶a(c8:0-coa，c10:0-coa，c12:0-coa，c14:0-coa，c16:0-coa，c18:0-coa，c18:3-coa，c20:5-coa以及c20:4-coa中的一種)，酶溶液(含trwsd4酶或trwsd5酶)。

在酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中，依次加入15μl1mg/mldtnb(溶于dmso)，5μl1mg/ml棕櫚醇(溶于dmso)，用槍頭吸打混合均勻，再加入相應(yīng)體積的1mg/ml的脂肪?；o酶a(每種脂肪酰基輔酶a均設(shè)置終濃度為15μm，30μm，45μm，60μm，75μm，90μm的檢測(cè)體系，脂肪?；o酶a的加入體積根據(jù)終濃度確定)，加入10μg濃度為200μg/ml的trwsd4酶溶液(實(shí)施例2得到的)，加入20mm的磷酸緩沖液補(bǔ)齊至200μl的酶活力測(cè)定反應(yīng)體系；混合均勻，避免產(chǎn)生氣泡，放入酶標(biāo)儀(spectramaxm2e，購(gòu)自moleculardevices)中。在37℃條件下，412nm處測(cè)定連續(xù)吸光值。并根據(jù)ntb^2-的摩爾吸光系數(shù)14150m^-1·cm^-1，計(jì)算釋放游離輔酶a含量，以此計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的初始反應(yīng)速率vo(單位：nmol/minpermg，每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生多少納摩爾的游離輔酶a)。根據(jù)得到的vo與底物濃度[s]按照米氏方程，計(jì)算每種底物的km，vmax，kcat等值，結(jié)果如表2和圖3所示(圖中：a為c8:0-coa和c10:0-coa的米氏方程曲線，b為c12:0-coa和c14:0-coa的米氏方程曲線，c為c16:0-coa和c18:0-coa的米氏方程曲線，d為c18:3-coa、c20:4-coa和c20:5-coa的米氏方程曲線)。

表2

從表2中可以看出，trwsd4酶對(duì)于c12:0-coa的km值(0.14)最小，kcat/km值最大(1.46×10⁵)，kcat/km值可以比較同一種酶催化不同底物的催化效率。從表2中根據(jù)相關(guān)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較，綜合kcat/km與km值可以看出，trwsd4酶對(duì)短鏈到中長(zhǎng)度的碳鏈的脂肪?；o酶a如(c8-coa,c10:0-coa，c14:0-coa，c16:0-coa，c18:0-coa)的底物具有較高的親和性，對(duì)較長(zhǎng)鏈的多不飽和酯酰輔酶a如c18:3-coa，c20:4-coa和c20:5-coa，親和性都較差。

實(shí)施例4

trwsd4酶的酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)

4.1trwsd4酶的最適溫度測(cè)定

設(shè)置每個(gè)反應(yīng)體系中不同的溫度梯度為7℃，17℃，27℃，37℃，47℃，57℃，其中以c10:0-coa，棕櫚醇為固定底物。將整個(gè)反應(yīng)體系置于不同的溫度條件下溫浴，在412nm處測(cè)定吸光值，以37℃測(cè)得的酶反應(yīng)初速率為100％，其他的溫度條件下測(cè)定的酶反應(yīng)速率以相對(duì)酶活力(relativeenzymeactivity)表示。

結(jié)果如圖4中的a所示(圖4的a顯示了溫度對(duì)trwsd4酶活力的影響結(jié)果，圖4的b中：橫坐標(biāo)代表溫度，縱坐標(biāo)代表相對(duì)酶活力，單位為％)，在溫度范圍為7℃～47℃時(shí)，相對(duì)酶活力隨著溫度的增加而增加，在47℃時(shí)，相對(duì)酶活力達(dá)到最高，當(dāng)溫度為57℃時(shí)酶活力降低，相對(duì)酶活力為50％左右，由此可見(jiàn)，trwsd4酶的最適溫度為47℃。

4.2trwsd4酶最適鹽濃度測(cè)定

設(shè)置每個(gè)反應(yīng)體系中不同的nacl濃度梯度為0mm，400mm，800mm，1200mm，1600mm，其中以c10:0-coa和棕櫚醇為固定底物。將整個(gè)反應(yīng)體系置于不同的鹽終濃度下，在412nm處測(cè)定吸光值，以37℃，0mmnacl時(shí)測(cè)得的酶反應(yīng)初速率為100％，其他的鹽濃度條件下測(cè)定的酶反應(yīng)速率以相對(duì)酶反應(yīng)速率表示。

結(jié)果如圖4中的b所示(圖4的b顯示鹽濃度對(duì)trwsd4酶活力的影響結(jié)果，圖4的b中：橫坐標(biāo)代表不同的鹽濃度，縱坐標(biāo)代表相對(duì)酶活力，單位為％)，在nacl濃度為400mm時(shí)，其相對(duì)酶活力接近100％，當(dāng)鹽濃度范圍超過(guò)400mm時(shí)，相對(duì)酶活力逐漸降低，當(dāng)鹽濃度為1600mm時(shí)，相對(duì)酶活力降低至30％左右，由此可見(jiàn)，當(dāng)反應(yīng)體系中的nacl濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)對(duì)該酶活力影響較大，trwsd4酶的最適鹽濃度為0-400mm。

4.3trwsd4酶對(duì)于蠟酯合成酶(ws)活性與脂酰輔酶a:二?；视王；D(zhuǎn)移酶(dgat)活性比較

反應(yīng)體系設(shè)置同上述，測(cè)定dgat的活性時(shí)，用dag(1-棕櫚酸-3-油酸甘油二酯)，購(gòu)自larodan公司)以及c10:0-coa為底物，測(cè)定ws活性則以c10:0-coa與棕櫚醇為底物。在412nm處測(cè)定吸光值，以37℃測(cè)得的酶反應(yīng)速率。其中以測(cè)得的ws活性為100％，其中dgat活性以相對(duì)酶活力表示。

結(jié)果如圖5所示，dgat的酶活性僅為ws活性的50％，trwsd4具有較高的蠟酯合成酶活性。通過(guò)trwsd4對(duì)于dag的活性測(cè)定，表明本發(fā)明提供的trwsd4酶是具有蠟酯合成酶以及?；D(zhuǎn)移酶的雙功能酶，其具有合成蠟酯和甘油三酯功能。

實(shí)施例5

trwsd5酶的表達(dá)和純化

將構(gòu)建成功的載體pmbpc::trwsd5轉(zhuǎn)入大腸桿菌中異源表達(dá)，在菌體od600值為0.6時(shí)，加入0.8mmiptg誘導(dǎo)trwsd5酶表達(dá)。trwsd5酶的純化方法可參考上述的trwsd4酶的純化步驟。用12％sds-page電泳檢測(cè)目的蛋白trwsd5酶，結(jié)果如圖6中的b所示(圖6中的b顯示了trwsd5酶溶液的sds-page分析圖，圖6的b中：m為蛋白質(zhì)marker；1為純化的trwsd5酶條帶)。

trwsd5酶分子量預(yù)測(cè)值約為99kda，從圖6的b中可看出，在99kda左右位置有條帶，與預(yù)測(cè)值接近。

實(shí)施例6

參考實(shí)施例3的方法，檢測(cè)trwsd5酶對(duì)9種不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪?；o酶a酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定以及底物偏好性分析，結(jié)果如表3和圖7所示(圖7中：a為c8:0-coa和c10:0-coa的米氏方程曲線，b為c12:0-coa、c14:0-coa和c16:0-coa的米氏方程曲線，c為c18:0-coa的米氏方程曲線，d為c18:3-coa的米氏方程曲線，e為c20:4-coa和c20:5-coa的米氏方程曲線)。

表3

從表3中可以看出，trwsd5酶對(duì)于c10:0-coa的km值最小(0.96)，kcat/km值最大(9.83×10⁴)，kcat/km值可以比較同一種酶催化不同底物的催化效率。此外，從表3中根據(jù)相關(guān)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較可以看出，trwsd5酶對(duì)短鏈以及中長(zhǎng)碳鏈的脂肪?；o酶a如c8:0-coa,c10:0-coa，c14:0-coa，c16:0-coa，c18:0-coa的底物具有較高的親和性，而對(duì)于較長(zhǎng)的多不飽和碳鏈c18:3-coa，c20:5-coa，c20:4-coa親和性都較差。但對(duì)于長(zhǎng)鏈多不飽和碳鏈c20:5-coa的親和性則高于c18:3-coa，c20:4-coa。

實(shí)施例7

trwsd5酶的酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)

7.1trwsd5酶的最適溫度測(cè)定

設(shè)置每個(gè)反應(yīng)體系中不同的溫度梯度為7℃，17℃，27℃，37℃，47℃，57℃，其中以c10:0-coa，棕櫚醇為固定底物。將整個(gè)反應(yīng)體系置于不同的溫度條件下溫浴，在412nm處測(cè)定吸光值，以37℃測(cè)得的酶反應(yīng)初速率為100％，其他的溫度條件下測(cè)定的酶反應(yīng)速率以相對(duì)酶反應(yīng)速率表示。結(jié)果圖8中的a所示(圖8中的a顯示溫度對(duì)trwsd5酶活力的影響結(jié)果，圖8中的b顯示了鹽濃度對(duì)trwsd5酶活力的影響結(jié)果)。

從圖8的a中可看出，在溫度范圍為7℃～47℃時(shí)，相對(duì)酶活力隨著溫度的增加而增加。當(dāng)反應(yīng)溫度在37℃，相對(duì)酶活力達(dá)到最大，47℃時(shí)，相對(duì)酶活力為98％左右，相對(duì)酶活力并未發(fā)生較大的變化。當(dāng)反應(yīng)溫度為57℃時(shí)酶活力降低，相對(duì)酶活力可達(dá)到50％多左右，由此可見(jiàn)該酶的最適溫度為37℃。

7.2trwsd5酶最適鹽濃度測(cè)定

設(shè)置每個(gè)反應(yīng)體系中不同的nacl濃度梯度為0mm，400mm，800mm，1200mm，1600mm，其中以c10:0-coa，棕櫚醇為固定底物。將整個(gè)反應(yīng)體系置于不同的溫度條件下溫浴，在412nm處測(cè)定吸光值，以37℃，0mmnacl時(shí)測(cè)得的酶反應(yīng)初速率設(shè)定為100％，其他的鹽濃度條件下下測(cè)定的酶反應(yīng)速率以相對(duì)酶反應(yīng)速率表示。結(jié)果如圖8中的b所示。

從圖8的b中可看出，當(dāng)反應(yīng)體系中的nacl濃度范圍為400mm至1200mm時(shí)，促進(jìn)了trwsd5的催化反應(yīng)，利于酶催化反應(yīng)進(jìn)行。由在反應(yīng)體系中nacl的濃度為800mm時(shí)，相對(duì)酶活力最高，因此，800mm的nacl濃度為trwsd5的最適鹽濃度。

7.3trwsd5酶對(duì)于蠟酯合成酶活性與二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性比較

反應(yīng)體系設(shè)置同上述，測(cè)定dgat的活性時(shí)，用dag以及c10:0-coa為底物，測(cè)定ws活性則以c10:0-coa與棕櫚醇為底物。在412nm處測(cè)定吸光值，以37℃測(cè)得的酶反應(yīng)速率。其中以測(cè)得的ws活性為100％，其中dgat活性以相對(duì)酶活力表示。結(jié)果如圖9所示。

從圖9看出，trwsd5酶的dgat酶活性僅為ws活性的25％，表明trwsd5以蠟酯合成酶活性較高。通過(guò)trwsd5對(duì)于dag的活性測(cè)定，表明了trwsd5是具有蠟酯合成酶以及?；D(zhuǎn)移酶雙功能的酶。

實(shí)施例8

trwsd4基因與trwsd5基因在釀酒酵母突變株中的表達(dá)

8.1將trwsd4基因(seqidno:2)和在seqidno:4的基礎(chǔ)上密碼子優(yōu)化后的trwsd5基因(seqidno:6所示，該序列適于在酵母中表達(dá)，其編碼的trwsd5酶的氨基酸序列如seqidno:3所示)分別連接至pesc-ura載體上，得到重組載體pesc-ura::trwsd4(如圖13所示)和pesc-ura::trwsd5(如圖14所示)，具體構(gòu)建方法可參考實(shí)施例1。

8.2將pesc-ura::trwsd4和pesc-ura::trwsd5分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母saccharomvcescerevisiae-h1246(一株甘油三酯以及蠟酯合成的缺陷型酵母，釀酒酵母缺陷株-h1246無(wú)法合成甘油三酯，甾醇酯以及蠟酯，是被廣泛用于驗(yàn)證具有dgat功能的基因的表達(dá)宿主)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接入sc-ura培養(yǎng)基(缺尿嘧啶)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，以乳糖為碳源誘導(dǎo)gal1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始，并添加wsd酶的兩種底物棕櫚醇以及棕櫚酸，添加量均為0.1％(w/v)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集菌體，提取酵母細(xì)胞總油脂，通過(guò)薄層層析的方法檢測(cè)是否有蠟酯產(chǎn)生。以轉(zhuǎn)化空載體作為陰性對(duì)照，以蠟酯標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果圖10所示(圖中：a為轉(zhuǎn)化pesc-ura::trwsd4載體的酵母細(xì)胞總油脂的薄層層析結(jié)果，1、2、3為pesc-ura空載體對(duì)照，4、5、6為轉(zhuǎn)入pesc-ura::trwsd4的酵母總油脂，7為蠟酯標(biāo)準(zhǔn)品(waxesters)，8為甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品(tag)；b為轉(zhuǎn)化pesc-ura::trwsd5載體的酵母細(xì)胞總油脂的薄層層析結(jié)果，1、2、3為pesc-ura空載體對(duì)照，4、5、6為轉(zhuǎn)入pesc-ura::trwsd5的酵母總油脂，7為蠟酯標(biāo)準(zhǔn)品，8為甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品)。

從圖10中可看出，與轉(zhuǎn)化空載體的酵母陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)入trwsd4基因的酵母和轉(zhuǎn)入trwsd5基因的酵母均有蠟酯的合成。說(shuō)明了在釀酒酵母缺陷株h1246中轉(zhuǎn)入trwsd4與trwsd5兩個(gè)基因后，在添加酵母細(xì)胞中外源脂肪醇時(shí)，酵母細(xì)胞能夠在酵母胞內(nèi)合成蠟酯。

8.3gc-ms分析酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的蠟酯

將轉(zhuǎn)入pesc-ura::trwsd4,pesc-ura::trwsd5的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子挑取接入sc-ura培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，再進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，同時(shí)添加棕櫚酸，棕櫚醇為底物。通過(guò)薄層層析tlc的方法分離純化蠟酯，將薄層層析板上產(chǎn)生蠟酯條帶的位置，用小刀刮下，裝入白蓋瓶，用3ml的氯仿洗脫兩次。在氮?dú)庀麓蹈陕确?，最后?0μl氯仿復(fù)溶得到的得到純品蠟酯。用安捷倫氣象色譜以及質(zhì)譜聯(lián)用儀gc7890a-5795c，測(cè)定每種蠟酯混合物中的蠟酯成分。質(zhì)譜條件如下：色譜柱應(yīng)用hp-5石英毛細(xì)管柱(0.25mm×30m；膜層厚，250nm；aglienttechnologies，unitedstates)；1μl進(jìn)樣，不分流；以氦氣(恒流，1.0ml/min)為載氣，進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度為280℃，升溫程序?yàn)樵谥鶞?0℃下恒溫2min；然后，以20℃/min的速度升溫至300℃，恒溫15min。質(zhì)譜條件為：四極桿溫度150℃，離子源電子轟擊溫度230℃，電子能量70ev。結(jié)果如圖15和圖16所示。

圖15顯示了trwsd4酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的蠟酯的gc-ms分析結(jié)果(圖中：a為十四烷酸十六烷醇酯，b為十六烷酸十六烷醇酯)，由圖15可知，以棕櫚醇與棕櫚酸為添加底物時(shí)，trwsd4酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的蠟酯成分有十四烷酸-十六烷醇酯；十六烷酸-十六烷醇酯。

圖16顯示了trwsd5酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的蠟酯的gc-ms分析結(jié)果(圖中：a為十二烷酸十六烷醇酯，b為十四烷酸十六烷醇酯，c為十六烷酸十六烷醇酯)，由圖16可知，trwsd5酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的蠟酯成分有十四烷酸-十六烷醇酯；十六烷酸-十六烷醇酯；十二烷酸-十六烷醇酯。

綜上，本發(fā)明提供的具有蠟酯合成活性和甘油三酯合成活性的雙功能酶，來(lái)自海洋原生生物破囊壺菌，其氨基酸序列如seqidno:1或seqidno:3所示。seqidno:1所示的雙功能酶和seqidno:3所示的雙功能酶是一種新的兼具蠟酯合成酶和甘油三酯合成酶活性的酶，二者均能合成蠟酯和甘油三酯，其為蠟酯合成酶類的基礎(chǔ)研究提供了新的思路。其相應(yīng)的編碼基因(如seqidno:2，seqidno:4-6所示)能夠在宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，轉(zhuǎn)化該編碼基因的酶能夠重新合成蠟酯，對(duì)其進(jìn)行基因工程改造以及工業(yè)應(yīng)用生產(chǎn)蠟酯和甘油三酯奠定了理論基礎(chǔ)。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所

<120>一種具有蠟酯合成活性和甘油三酯合成活性的雙功能酶及其編碼基因與應(yīng)用

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>537

<212>prt

<213>破囊壺菌（thraustochytriumroseum）

<400>1

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151015

glnarggluglnaspvalgluvalgluglugluvalgluglugluglu

202530

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354045

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505560

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65707580

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100105110

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<210>2

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<213>破囊壺菌（thraustochytriumroseum）

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<210>3

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<213>破囊壺菌（thraustochytriumroseum）

<400>3

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151015

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202530

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354045

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<210>4

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<213>破囊壺菌（thraustochytriumroseum）

<400>4

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<213>人工序列

<400>6

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