本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及谷氨酸棒桿菌中一種基因連續(xù)無痕敲除的方法。

背景技術(shù)：

谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)l-氨基酸，維他命，燃料乙醇以及其他的有機酸等產(chǎn)品中，目前主要通過代謝工程及合成生物學(xué)的方法在谷氨酸棒桿菌中完成相應(yīng)代謝產(chǎn)物的積累，因此連續(xù)無痕敲除的方法顯得尤為重要。在谷氨酸棒桿菌的模式菌株atcc13032中，反向篩選標(biāo)記系統(tǒng)，cre-loxp重組系統(tǒng)，rect介導(dǎo)的單鏈dna重組系統(tǒng)以及crispri干擾系統(tǒng)等方法已經(jīng)成功的運用于靶標(biāo)基因的無痕敲除，點突變及抑制靶標(biāo)基因表達中，為相關(guān)生產(chǎn)菌株的構(gòu)建奠定了堅實的基礎(chǔ)。

然而，在谷氨酸棒桿菌的模式菌株atcc13032中，廣泛應(yīng)用的sacb反向篩選技術(shù)，需要在整合型質(zhì)粒的幫助下通過兩輪的交換才能完成靶標(biāo)基因的同源重組；該方法雙交換的概率低，耗時久，完成一個基因的敲除需要10～13天。rect介導(dǎo)的單鏈dna重組系統(tǒng)為基因組中的點突變提供一種非常有效的方法，但是當(dāng)前能有效的篩選正確重組子的方法非常有限。crispri干擾系統(tǒng)為有效干擾靶標(biāo)基因的表達提供一種非常有效的方法，但是該方法目前僅限于抑制靶標(biāo)基因的表達；利用cre-loxp重組系統(tǒng)，在谷氨酸棒桿菌中的靶標(biāo)基因的同源重組需要設(shè)計兩個質(zhì)粒以及兩輪的轉(zhuǎn)化，過程繁瑣。這使快速高效地構(gòu)建谷氨酸棒桿菌相關(guān)生產(chǎn)菌株進入瓶頸，而迫切需要在谷氨酸棒桿菌中建立一種有效快速的基因連續(xù)無痕敲除的方法。

在一些能夠通過自身的重組系統(tǒng)完成外源線性雙鏈dna的同源重組的菌株中，通過構(gòu)建外源線性雙鏈dna完成靶標(biāo)基因的敲除的方法，過程簡單，省時。但是谷氨酸棒桿菌自身重組系統(tǒng)的限制，在沒有整合型質(zhì)粒協(xié)助的情況下，發(fā)生同源重組的概率很低。這使在谷氨酸棒桿菌中的同源重組需要通過整合型質(zhì)粒介導(dǎo)來完成，而使整個敲除過程繁瑣冗長。針對這個問題，利用核酸外切酶-重組酶協(xié)助外源線性雙鏈dna重組的系統(tǒng)，給簡化谷氨酸棒桿菌的同源重組提供有效方法。

基于大腸桿菌rec噬菌體的recet系統(tǒng)(receproteinid：np_415866.1；rectproteinid：np_415865.1)是協(xié)助完成外源線性雙鏈dna同源重組的核酸外切酶-重組酶系統(tǒng)中的典型。該系統(tǒng)由兩種蛋白組成，rece和rect組成：rece是一種雙鏈dna依賴的核酸外切酶，結(jié)合在5′-3′線性雙鏈dna的末端，從5′端向3′端降解dna，產(chǎn)生3′端突出端；rect是單鏈退火蛋白，結(jié)合在單鏈dna上，介導(dǎo)互補單鏈dna退火，能夠有效的實現(xiàn)單鏈dna的重組。此外recet功能相似的核酸外切酶-重組酶也具有類似的功能，例如orf47+orf48(orf47proteinid：cab53837.1；orf48proteinid：cab53838.1)、orfb+orfc(orfbproteinid：cac33455.1；orfcproteinid：cac33454.1)及orf60+orf61(orf60proteinid：aan12619.1；orf61proteinid：aan12618.1)。

cre/mutantlox特異位點重組系統(tǒng)在連續(xù)無痕敲除的方法中廣泛應(yīng)用。cre/mutantlox特異位點重組系統(tǒng)由cre重組酶(genbankaccessionald15663.1)和突變的loxp序列(loxp71：5′-taccgttcgtatagcatacattatacgaagttat-3′和loxp66：5′-ataacttcgtatagcatacattatacgaacggta-3′)兩部分組成。cre重組酶能夠特異性地識別loxp序列，當(dāng)兩個loxp位點位于一條dna鏈上且方向相同時，cre重組酶催化loxp71和loxp66位點間的dna進行精確的位點特異性重組，完成loxp位點間序列的剪切，留下不被cre重組酶識別的loxp72(序列：5′-taccgttcgtatagcatacattatacgaacggta-3′)。這對簡化谷氨酸棒桿菌基因無痕敲除的過程具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供谷氨酸棒桿菌中一種基因連續(xù)無痕敲除的方法。該方法簡單有效，簡化了谷氨酸棒桿菌基因無痕敲除的過程。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

谷氨酸棒桿菌中一種基因連續(xù)無痕敲除的方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建核酸外切酶-重組酶表達的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌的感受態(tài)細胞中；

(2)制備同時含有靶標(biāo)基因1的左同源臂及l(fā)oxp71序列，cre酶表達盒及谷氨酸棒桿菌中有效的抗性篩選標(biāo)記表達盒，loxp66序列及靶標(biāo)基因1的右同源臂的自我切割線性敲除表達盒；

(3)制備核酸外切酶-重組酶表達的的谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細胞；

(4)將步驟(2)中的自我切割線性敲除表達盒轉(zhuǎn)化入步驟(3)中制備的感受態(tài)細胞中，涂布于相應(yīng)的抗性篩選平板；

(5)將鑒定成功的陽性轉(zhuǎn)化子接種于誘導(dǎo)cre酶表達的液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)cre酶表達，執(zhí)行l(wèi)oxp71和loxp66序列間的dna的剪切，剔除cre酶表達盒及kan抗性表達盒；

(6)將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液劃線分離單菌落；單菌落點板于含以及不含自我切割線性敲除表達盒中相應(yīng)抗性的平板進行篩選；

(7)將步驟(6)中鑒定正確的菌株進行pcr及測序驗證，成功獲取靶標(biāo)基因1無痕敲除的菌株，即含有核酸外切酶-重組酶表達質(zhì)粒的靶標(biāo)基因1無痕敲除菌株。

為了更好的實現(xiàn)本發(fā)明，還包括：

(8)制備同時含有靶標(biāo)基因2的左同源臂及l(fā)oxp71序列，cre酶表達盒及谷氨酸棒桿菌中有效的抗性篩選標(biāo)記表達盒，loxp66序列及靶標(biāo)基因2的右同源臂的自我切割線性敲除表達盒；

(9)制備核酸外切酶-重組酶表達的靶標(biāo)基因1無痕敲除菌株的谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細胞，并按照上述步驟(4)～(7)完成靶標(biāo)基因2的連續(xù)無痕敲除；依次類推，完成多個靶標(biāo)基因的連續(xù)無痕敲除。

所述的核酸外切酶-重組酶，除了recet，還可以是在谷氨酸棒桿菌中功能類似的核酸外切酶-重組酶，例如：orf47+orf48或orfb+orfc或gp60+gp61。

所述的自我剪切敲除表達盒，在相同質(zhì)量的線性雙鏈dna的條件下左右同源臂長度最佳長度為500～1000bp。

具體的，

谷氨酸棒桿菌中一種基因連續(xù)無痕敲除的方法，具體包括以下步驟(圖1)：

(1)構(gòu)建異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)可誘導(dǎo)的核酸外切酶-重組酶recet表達的質(zhì)粒pec-xc99e-recet(氯霉素抗性)，轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌的感受態(tài)細胞中；

(2)通過重疊延伸pcr的方法制備同時含有長度在500～1000bp的靶標(biāo)基因1的左同源臂及l(fā)oxp71序列(片段1)，茶堿可誘導(dǎo)的cre酶表達盒及kan抗性篩選標(biāo)記表達盒(片段2)，loxp66序列及長度在500～1000bp的靶標(biāo)基因1的右同源臂(片段3)的自我切割線性敲除表達盒；

(3)制備已誘導(dǎo)pec-xc99e-recet表達的的谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細胞；

(4)將步驟(2)中的自我切割線性敲除表達盒轉(zhuǎn)化入步驟(3)中制備的感受態(tài)細胞中，涂布于含有卡那霉素25μg/ml和氯霉素7.5μg/ml的lbh固體平板(lbh+kan25+chl7.5)；

(5)將鑒定成功的陽性轉(zhuǎn)化子接種于含1mm茶堿及氯霉素7.5μg/ml的bhi液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)cre酶表達，執(zhí)行l(wèi)oxp71和loxp66序列間的dna的剪切，剔除cre酶表達盒及kan抗性表達盒；

(6)將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液劃線于含1mm茶堿及氯霉素7.5μg/ml的bhi平板(bhi+chl7.5+1mm茶堿)，分離單菌落；單菌落分別點板于同時含卡那霉素25μg/ml和氯霉素7.5μg/ml的含bhi平板(bhi+kan25+chl7.5)及僅含氯霉素7.5μg/ml的bhi平板(bhi+chl7.5)進行篩選；在bhi+kan25+chl7.5平板上不生長，bhi+chl7.5平板上生長的菌落為初步鑒定為成功剔除cre酶表達盒及kan抗性表達盒的無痕敲除菌株；

(7)將步驟(6)中鑒定正確的菌株進行pcr及測序驗證，成功獲取靶標(biāo)基因1無痕敲除的菌株，即：含有核酸外切酶-重組酶recet表達質(zhì)粒的靶標(biāo)基因1無痕敲除菌株。

為了更好的實現(xiàn)本發(fā)明，還包括：

(8)通過重疊延伸pcr的方法制備同時含有長度在500～1000bp的靶標(biāo)基因2的左同源臂及l(fā)oxp71序列(片段1)，茶堿可誘導(dǎo)的cre酶表達盒及kan抗性篩選標(biāo)記表達盒(片段2)，loxp66序列及長度在500～1000bp的靶標(biāo)基因2的右同源臂(片段3)的自我切割線性敲除表達盒；

(9)制備核酸外切酶-重組酶recet表達的靶標(biāo)基因1無痕敲除菌株的感受態(tài)細胞，并按照上述步驟(4)～(7)完成靶標(biāo)基因2的連續(xù)無痕敲除；依次類推，完成多個靶標(biāo)基因的連續(xù)無痕敲除。

本發(fā)明的具體實施方案中，首先確定核酸外切酶-重組酶recet、orf47+orf48、orfb+orfc及orf60+orf61分別在谷氨酸棒桿菌中對線性雙鏈dna表達盒的重組效率及recet對線性雙鏈dna重組的最佳同源臂長度。

在本發(fā)明中的具體實施方案中，將構(gòu)建的δargr自我切割線性敲除表達盒，轉(zhuǎn)化入14067-recet的感受態(tài)細胞中，完成基因argr(genbanknumber354510801)的無痕敲除。

在本發(fā)明中的具體實施方案中，將構(gòu)建的δcrtb自我切割線性敲除表達盒轉(zhuǎn)化入argr無痕敲除菌株的感受態(tài)細胞中，完成在基因argr的無痕敲除的基礎(chǔ)上crtb基因(genbanknumber：658107612)的連續(xù)無痕敲除。

在本發(fā)明中的具體實施方案中，另外分別構(gòu)建基因ncgl1221(genbanknumber：658108254)，prob(genbanknumber：658109122)的自我切割線性敲除表達盒，轉(zhuǎn)化入recet表達的感受態(tài)細胞中，分析recet對線性自我切割敲除表達盒的重組效率；通過茶堿誘導(dǎo)cre切除篩選標(biāo)記，測定無痕剪切的效率。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：

本發(fā)明在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建了核酸外切酶-重組酶-cre/loxp連續(xù)無痕敲除系統(tǒng)，以recet-cre/loxp連續(xù)無痕敲除系統(tǒng)最佳。本方法在谷氨酸棒桿菌中的同源重組不需要質(zhì)粒的介導(dǎo)，在recet的協(xié)助下僅需轉(zhuǎn)化入線性雙鏈dna即可完成同源重組；僅需要一輪轉(zhuǎn)化，即可完成靶標(biāo)基因的無痕敲除，整個無痕敲除過程僅需4～6天，同時能夠完成基因的連續(xù)無痕敲除；利用抗性基因作為篩選標(biāo)記篩選過程簡單有效，相對于谷氨酸棒桿菌中的其他無痕敲除的方法更加簡單，有效且節(jié)省時間。

附圖說明

圖1是利用recet-cre/loxp系統(tǒng)完成谷氨酸棒桿菌基因連續(xù)無痕敲除的方法示意圖；其中，lbh+chl7.5+kan2.5表示含有氯霉素的濃度為7.5μg/ml和卡那霉素濃度為25μg/ml的lbh培養(yǎng)基；bhi+chl7.5+1mm茶堿表示含有氯霉素的濃度為7.5μg/ml和茶堿濃度為1mm的bhi培養(yǎng)基。

圖2是在谷氨酸棒桿菌中不同核酸外切酶-重組酶對線性雙鏈dna的重組效率；其中，同源臂長度為400bp的crtb基因的左右同源臂和抗性篩選標(biāo)記kan表達盒融合的線性雙鏈dna表達盒被用來測試不同核酸外切酶-重組酶對線性雙鏈dna同源重組的效率；每組實驗至少做三組平行。

圖3是不同同源臂長度對recet同源重組效率的影響；其中，長度為100，200，300，400，500，800，1000，1200，1500，2000bp的crtb基因的左右同源臂和抗性篩選標(biāo)記kan表達盒融合的線性雙鏈dna表達盒被用來測試不同同源臂長度對recet同源重組效率的影響；每組實驗至少做三組平行。

圖4是谷氨酸棒桿菌atcc14067-xc99e-recet中基因argr的無痕敲除；其中，圖a，δargr自我切割線性表達盒在atcc14067-xc99e-recet中的同源重組；mcargr：基因argr被4335bp的δargr自我切割線性表達盒替換；圖b，基因argr無痕敲除菌株的鑒定；margr：基因argr被34bp的loxp72序列替換。

圖5是谷氨酸棒桿菌atcc14067-recet-margr中基因crtb的無痕敲除；其中，margr-crtb：基因argr和crtb被34bp的loxp72序列替換；pr：引物δargr-jd-s，δargr-jd-a；pc：引物δcrtb-jd-s，δcrtb-jd-a。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

本發(fā)明所使用的實驗材料若無特別說明均為市售購買產(chǎn)品。

實施例1核酸外切酶-重組酶在谷氨酸棒桿菌中對線性雙鏈dna的重組

一、核酸外切酶-重組酶表達的谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細胞的制備

設(shè)計引物rect/rece-s：5′-caaaaaggaggcccttcagatgagcacaaaaccactcttc-3′及rect/rece-a：5′-ggcaccaataactgccttaattattcctctgaattatcga-3′，擴增基因rect+rece；

設(shè)計引物orfc/orfb-s：5′-caaaaaggaggcccttcagatgacaaaattatgttttagtg-3′，orfc/orfb-a：5′-ggcaccaataactgccttaattaagccttatcctgattagt-3′，擴增基因orfc+orfb；

設(shè)計引物orf48/orf47-s：5′-caaaaaggaggcccttcagatggctattgcaaaagaaaagac-3′，orf48/orf47-a：5′-ggcaccaataactgccttaattagatcattgacccttgaacc-3′，擴增orf48+orf47基因；

設(shè)計引物gp60/61-s：5′-acaaaaaggaggcccttcagatgagtgtgcccacacaggacgga-3′，gp60/61-a：5′-ggcaccaataactgccttaatcatgcgttgggcccgtcgaacat-3′，擴增gp60+gp61基因；

設(shè)計引物pec-a：5′-ctgaagggcctcctttttgttatccg-3′及pec-s：5′-ttaaggcagttattggtgcccatgcg-3′，擴增pec-xc99e(genbanknumber：ay219682)的骨架序列；

將上述基因片段rect+rece、orfc+orfb、orf48+orf47及gp60+gp61分別和pec-xc99e的骨架序列用nebuilderhifidnaassemblymastermix(購自newenglandbiolabs)試劑盒進行組裝，構(gòu)建核酸外切酶-重組酶誘導(dǎo)表達質(zhì)粒pec-xc99e-recet、pec-xc99e-orf47/orf48、pec-xc99e-orfb/orfc和pec-xc99e-gp60/61。將成功構(gòu)建的pec-xc99e-recet、pec-xc99e-orf47/orf48、pec-xc99e-orfb/orfc和pec-xc99e-gp60/61質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌atcc14067感受態(tài)細胞中，并分別制備核酸外切酶-重組酶表達的感受態(tài)細胞atcc14067-xc99e-recet、atcc14067-xc99e-orf47/orf48、atcc14067-xc99e-orfb/orfc和atcc14067-xc99e-gp60/61。

以菌株atcc14067-xc99e-recet為例，描述制備核酸外切酶-重組酶表達的atcc14067感受態(tài)細胞的方法。首先，接種atcc14067-xc99e-recet的單菌落于含7.5μg/ml氯霉素的bhi液體培養(yǎng)基，過夜搖菌；將上述的菌體轉(zhuǎn)接入30mlepo培養(yǎng)基(含7.5μg/ml氯霉素和1mmiptg)，控制起始o(jì)d≈0.3，30℃，250rpm培養(yǎng)3～4h后，使od在0.9左右；將菌液轉(zhuǎn)移至滅菌的50ml離心管中，冰上放置20min；4℃、4000rpm離心10min，去上清，收集菌體；用預(yù)冷的10％甘油30ml重懸菌體，重復(fù)本步驟2次；用400μl預(yù)冷的10％甘油重懸細胞，分裝于預(yù)冷的ep管中，每管分裝80μl。

二、含同源臂及篩選標(biāo)記的線性雙鏈dna的制備

設(shè)計引物crtb-l-s：5′-taataggtacgccagaccaaaagg-3′，crtb-l-a：5′-atgaagacatcaactacaactcca-3′，以atcc14067基因組為模板，擴增2487bp的crtb基因的左同源臂；

設(shè)計引物crtb-r-a：5′-catcgcctatgctcgaaatactgc-3′，crtb-r-s：5′-tcatagctgagcctgcttctggta-3′，以atcc14067基因組為模板，擴增2581bp的crtb基因的右同源臂；

設(shè)計引物kan-crtb-a：5′-agaagcaggctcagctatgaatgggttaaaaaggatcgatcctc-3′，kan-crtb-s：5′-gttgtagttgatgtcttcatcgcaagcgcaaagagaaagcaggt-3′，擴增質(zhì)粒pec-k18mob2(genbanknumber：af445080)上1103bp的kan抗性篩選標(biāo)記表達盒；

設(shè)計引物pbs-crtb-a：5′-ttggtctggcgtacctattattgttatccgctcacaattccacac-3′，pbs-crtb-s：5′-atttcgagcataggcgatgatgcaggaattcgatatcaagctta-3′，擴增2877bp的pbluescriptiisk(+)(購自stratagene)質(zhì)粒骨架序列。

用nebuilderhifidnaassemblymastermix(購自newenglandbiolabs)試劑盒通過同源重組的方法將上述四個片段進行組裝，構(gòu)建質(zhì)粒pbs-crtb-l/r-kan質(zhì)粒，用于擴增含有kan篩選標(biāo)記表達盒及同源臂長度分別為100，200，300，400，500，800，1000，1200，1500和2000bp的線性雙鏈dna表達盒crtb/100-kan，crtb/200-kan，crtb/300-kan，crtb/400-kan，crtb/500-kan，crtb/800-kan，crtb/1000-kan，crtb/1200-kan，crtb/1500-kan，crtb/2000-kan。

三、不同核酸外切酶-重組酶對線性雙鏈dna的重組

將構(gòu)建的crtb基因同源臂長度為400bp的線性雙鏈雙鏈dna表達盒crtb/400-kan分別電擊轉(zhuǎn)化入核酸外切酶-重組酶表達的atcc14067-xc99e-recet，atcc14067-xc99e-orf47/orf48，atcc14067-xc99e-orfb/orfc和atcc14067-xc99e-gp60/61感受態(tài)細胞中。電擊轉(zhuǎn)化的方法如下：(1)吸取預(yù)冷的線性雙鏈dna，加入核酸外切酶-重組酶表達的感受態(tài)細胞中，彈壁使其混勻，冰浴5～10min；(2)將上述混合物加入預(yù)冷的電擊杯中，1.8kv，5ms電擊3次，加入6mllbh恢復(fù)培養(yǎng)基(含7.5μg/ml的氯霉素)，46℃水浴6min，30℃，250rpm復(fù)蘇培養(yǎng)5h；(3)4000rpm，離心10min，收集菌體；(4)棄上清，剩余200μl液體，重懸菌體，涂布于lbh+kan25+chl7.5固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)36～48h。計數(shù)平板上的菌落個數(shù)，pcr鑒定分析菌落的重組情況，結(jié)果表明核酸外切酶-重組酶recet、orf47+orf48、orfb+orfc及gp60+gp61均能在谷氨酸棒桿菌中協(xié)助完成線性雙鏈dna的同源重組，且核酸外切酶-重組酶recet的效果最好，結(jié)果見圖2。

四、500～1000bp的同源臂長度提高核酸外切酶-重組酶recet對的線性雙鏈dna的同源重組效率

將500ng不同同源臂長度的線性雙鏈dna表達盒crtb/100-kan，crtb/200-kan，crtb/300-kan，crtb/400-kan，crtb/500-kan，crtb/800-kan，crtb/1000-kan，crtb/1200-kan，crtb/1500-kan和crtb/2000-kan分別轉(zhuǎn)化入recet表達的atcc14067-xc99e-recet的感受態(tài)細胞中，30℃培養(yǎng)36～48h后計數(shù)平板上的菌落個數(shù)，pcr鑒定分析菌落的重組情況。結(jié)果表明，在谷氨酸棒桿菌中，在相同質(zhì)量的線性雙鏈dna的條件下，同源臂長度在500～1000bp左右，核酸外切酶-重組酶recet對線性雙鏈dna的同源重組的效率最佳(圖3)。

實施例2單基因無痕敲除菌株atcc14067-recet-margr的獲得

一、自我剪切的線性雙鏈dna敲除表達盒δargr的制備

設(shè)計引物pbs-kan-s：5′-tcgatcctttttaacccattgcaggaattcgatatcaag-3′，pbs-cre-a：5′-gcgacacgaattatgcagtttgttatccgctcacaattc-3′，擴增2875bp的質(zhì)粒pbluescriptiisk(+)骨架片段；

設(shè)計引物theoe-cre-s：5′-actgcataattcgtgtcgctcaag-3′，theoe-cre-a：5′-ctttgcgcttgcgcggaattaattcatgagcg-3′，擴增1594bp的誘導(dǎo)型cre酶表達盒；

設(shè)計引物kan-s：5′-aattaattccgcgcaagcgcaaagagaaagca-3′，

kan-a：5′-atgggttaaaaaggatcgatcctc-3′，擴增1074bp的kan抗性篩選標(biāo)記表達盒；

將上述三個片段膠回收后用nebuilderhifidnaassemblymastermix(newenglandbiolabs)試劑盒進行組裝，得到通用質(zhì)粒pbs-cre-kan。

設(shè)計通用引物c-k-loxp66：5′-taccgttcgtataatgtatgctatacgaagttatatgggttaaaaaggatcgatcc-3′，c-k-loxp71：5′-taccgttcgtatagcatacattatacgaagttatactgcataattcgtgtcgctca-3′，以通用質(zhì)粒pbs-cre-kan為模板擴增左端含有l(wèi)oxp71序列，右端含有l(wèi)oxp66序列的2712bp的通用的cre-kan表達盒(片段2)(圖1)；

設(shè)計引物argr-l-s：5′-tcaactcgtactcgcttctccttc-3′，argr-l-loxp71：5′-tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtagtcttacctcggctggttggc-3′，以atcc14067的基因組為模板，擴增841bp的含有argr基因左同源臂及l(fā)oxp71序列的dna序列(片段r-1)；

設(shè)計引物argr-r-loxp66：5′-acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtaagcgcccctagttcaaggcttg-3′，argr-r-a：5′-tgatgacctcatctggagcgttac-3′，擴增862bp的含有l(wèi)oxp66及argr基因右同源臂的dna序列(片段r-3)。

以argr-l-s，argr-r-a作為引物，片段r-1，片段2和片段r-3作為模板，重疊延伸pcr擴增4335bp的δargr自我剪切線性敲除表達盒。

二、argr基因的無痕敲除

將上述制備的δargr自我剪切線性敲除表達盒，1μg轉(zhuǎn)入新鮮制備atcc14067-xc99e-recet的感受態(tài)細胞中，按照實施例1中電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化δargr自我剪切線性敲除表達盒。在抗性平板上，平均有轉(zhuǎn)化子122個，設(shè)計引物δargr-jd-s：5′-gttgtcatcaccgatacctgggtatcca-3′，δargr-jd-a：5′-aggtcgagagaaactgcgatgacttcac-3′，對平板上長出的菌落進行pcr驗證，δargr自我剪切線性敲除表達盒成功重組的菌株在3265bp處有條帶，野生菌株在1069bp處有條帶(圖4)。挑取約30個轉(zhuǎn)化子，用引物δargr-jd-s，δargr-jd-a進行pcr鑒定，結(jié)果表明94％的轉(zhuǎn)化子均為正確重組的陽性轉(zhuǎn)化子(表1)。

挑取正確重組的轉(zhuǎn)化子，誘導(dǎo)cre酶表達，執(zhí)行l(wèi)oxp71和loxp66位點間序列的剪切，完成argr基因的無痕敲除。誘導(dǎo)cre酶表達，執(zhí)行l(wèi)oxp71和loxp66位點間序列的剪切及無痕敲除菌株的篩選方法如下：將驗證正確的轉(zhuǎn)化子，挑取5株，接種于含7.5μg/ml氯霉素及1mm茶堿的bhi液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，搖菌24h；蘸取菌液，劃線于含1mm茶堿及7.5μg/ml氯霉素的bhi固體培養(yǎng)基上，30℃，培養(yǎng)24h；將上述長出的單菌落分別點板于含bhi+kan25+chl7.5及bhi+chl7.5的平板上，30℃，培養(yǎng)12h后，觀察菌落的生長情況。在僅含氯霉素的平板上生長，同時在含氯霉素和卡那霉素的平板上不生長(圖4)，初步鑒定有效剔除cre表達盒及kan篩選標(biāo)記，點板結(jié)果表明100％的cre切割菌株均有效完成loxp位點間dna序列的剪切(表1)；用引物δargr-jd-s，δargr-jd-a進一步pcr驗證，無痕敲除在600bp左右處有條帶，野生的對照菌株在1100bp左右處有條帶(圖4)，進一步確定成功有效剔除cre表達盒及kan篩選標(biāo)記；用引物δargr-jd-s，δargr-jd-a擴增的敲除菌株的條帶進行測序，再一步確定基因組上的argr基因被34bp的loxp72代替，測序結(jié)果表明重組切割后的無痕敲除菌株基因突變的概率為0％。成功獲得argr基因無痕敲除的菌株，atcc14067-recet-margr。

實施例3無痕敲除菌株atcc14067-recet-margr中疊加無痕敲除crtb基因

按照實施例2中的方法設(shè)計引物crtb-l-s(1)：5′-gaagtgttgatagaaatgacctca-3′，crtb-l-loxp71：5′-tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtaatgaagacatcaactacaactcc-3′，以atcc14067的基因組為模板擴增840bp的含有crtb基因左同源臂及l(fā)oxp71序列的dna序列(c-1)；

設(shè)計引物crtb-r-loxp66：5′-acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtatcatagctgagcctgcttctgg-3′，crtb-r-a(1)：5′-gtcactagtgctgactccccctct-3′，以atcc14067的基因組為模板擴增850bp的含有l(wèi)oxp66及crtb基因右同源臂的dna序列(c-3)。

以crtb-l-s(1)，crtb-r-a(1)作為引物，片段c-1、2712bp的通用的cre-kan表達盒(片段2)和片段c-3作為模板，融合4322bp的δcrtb自我剪切的線性敲除表達盒。

按照施例1中的方法，完成recet表達的atcc14067-recet-margr感受態(tài)細胞的制備并完成δcrtb線性敲除表達盒的轉(zhuǎn)化。

設(shè)計引物δcrtb-jd-s：5′-ccaggcgttaattctaccaaatcgagat-3′，δcrtb-jd-a：5′-ggtctgacagtaaccggcggagtaatta-3′，對平板上長出的菌落進行pcr驗證，δcrtb線性敲除表達盒成功同源重組的菌株在3257bp處有條帶，野生菌株在1455bp處有條帶。挑取約30個轉(zhuǎn)化子，用引物δcrtb-jd-s，δcrtb-jd-a進行pcr鑒定，結(jié)果表明97％的轉(zhuǎn)化子均為成功重組的陽性轉(zhuǎn)化子(表1)。按照實施例2中的方法完成cre酶的誘導(dǎo)剪切及點板篩選，點板結(jié)果表明100％的cre切割菌株均有效完成loxp位點間dna序列的剪切(表1)；用引物δcrtb-jd-s，δcrtb-jd-a進一步pcr驗證，無痕敲除在600bp左右處有條帶，野生的對照菌株在1455bp左右處有條帶(圖5)，進一步確定成功剔除cre酶表達盒及kan篩選標(biāo)記表達盒序列；用引物δcrtb-jd-s，δcrtb-jd-a擴增的敲除菌株的條帶進行測序，再一步確定基因組上的crtb基因被34bp的loxp72代替，測序結(jié)果表明重組切割后的無痕敲除菌株基因突變的概率為0％，成功獲得crtb基因無痕敲除的菌株；同時對無痕敲除菌株用引物δargr-jd-s，δargr-jd-a進行pcr驗證，在600bp左右處有條帶，表明成功獲得argr和crtb基因連續(xù)無痕敲除的菌株atcc14067-recet-margr-crtb。

實施例4recet對線性敲除表達盒重組效率及cre酶切割效率分析

為了探索recet-cre/loxp系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中的同源重組效率及cre切割效率，首先按照實施例2中制備自我剪切敲除表達盒的方法分別制備敲除基因ncgl1221和prob的自我剪切線性敲除表達盒。

設(shè)計引物ncgl-l-s：5′-gacggtggtgacttttgaacgaag-3′，ncgl-l-loxp71：5′-tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtagacgctgattacagacgtgtcc-3′，以atcc14067基因組為模板擴增886bp的含有ncgl1221基因左同源臂及l(fā)oxp71序列的dna序列(片段n-1)；

設(shè)計引物ncgl-r-loxp66：5′-acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtagagccaagattagcgctgaaaagtag-3′，ncgl-r-a：5′-gaacggagtccaagtttgcatcag-3′，以atcc14067的基因組為模板擴增826bp的含有l(wèi)oxp66序列及ncgl1221基因右同源臂的dna序列(片段n-3)。

以ncgl-l-s，ncgl-r-a為引物，片段n-1，2712bp的通用的cre-kan表達盒(片段2)和片段n-3作為模板，融合4343bp的δncgl自我剪切線性敲除表達盒。

設(shè)計引物prob-l-s：5′-gatggcccgtgttcattatctccg-3′，prob-l-loxp71：5′-tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtatccggattcatgtccgtatgcg-3′，以atcc14067的基因組為模板擴增849bp的含有prob基因左同源臂及l(fā)oxp71序列的dna序列(p-1)；

設(shè)計引物prob-r-loxp66：5′-acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtaagcgcgggcctgctggtggcag-3′，prob-r-a：5′-gtcaggaagtggctcaggatc-3′，以atcc14067的基因組為模板擴增849bp的含有l(wèi)oxp66序列及prob基因右同源臂的dna序列(p-3)。

以prob-l-s，prob-r-a作為引物，片段p-1，通用的cre-kan表達盒片段(片段2)和片段p-3作為模板，融合4330bp的δprob自我剪切線性敲除表達盒。

按照實施例1中的方法，將制備好的1μg自我剪切的δncgl1221及δprob的線性敲除表達盒分別轉(zhuǎn)化入recet表達的atcc14067-xc99e-recet及atcc14067-recet-margr感受態(tài)細胞中。按照實施例2中的方法計數(shù)平板上長出的單菌落個數(shù)，不同基因的敲除菌株挑取轉(zhuǎn)化子30個進行菌落pcr驗證，分析recet對線性敲除表達盒的替換頻率(表1)。

按照實施例2中的方法，誘導(dǎo)cre酶的表達，執(zhí)行l(wèi)oxp位點間的剪切、點板篩選及測序，分析不同敲除基因中cre酶的切割效率(表1)，并分別獲得無痕敲除菌株atcc14067-recet-mncgl1221，atcc14067-recet-mprob，atcc14067-recet-margr-ncgl1221，atcc14067-recet-margr-prob。

表1recet對自我剪切線性敲除表達盒的重組效率及cre剪切效率統(tǒng)計結(jié)果

本發(fā)明中，通過將構(gòu)建的recet-cre/loxp系統(tǒng)應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌atcc14067中，利用核酸外切酶-重組酶recet直接有效地完成線性雙鏈dna的同源重組，整個過程只需要一輪的轉(zhuǎn)化，且成功重組的轉(zhuǎn)化子的概率≥94％；同時cre酶能夠有效的執(zhí)行l(wèi)oxp位點間的剪切，剪切效率≥97％；recet-cre/loxp系統(tǒng)完成靶標(biāo)基因的無痕敲除僅需4～6天，同時能夠完成靶標(biāo)基因的連續(xù)無痕敲除，相對于谷氨酸棒桿菌中的其他無痕敲除的方法更加簡單，有效而且節(jié)省時間。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華南理工大學(xué)

<120>谷氨酸棒桿菌中一種基因連續(xù)無痕敲除的方法

<130>1

<160>49

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>34

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>loxp71

<400>1

taccgttcgtatagcatacattatacgaagttat34

<210>2

<211>34

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>loxp66

<400>2

ataacttcgtatagcatacattatacgaacggta34

<210>3

<211>34

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>loxp72

<400>3

taccgttcgtatagcatacattatacgaacggta34

<210>4

<211>40

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>rect/rece-s

<400>4

caaaaaggaggcccttcagatgagcacaaaaccactcttc40

<210>5

<211>40

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>rect/rece-a

<400>5

ggcaccaataactgccttaattattcctctgaattatcga40

<210>6

<211>41

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>orfc/orfb-s

<400>6

caaaaaggaggcccttcagatgacaaaattatgttttagtg41

<210>7

<211>41

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>orfc/orfb-a

<400>7

ggcaccaataactgccttaattaagccttatcctgattagt41

<210>8

<211>42

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>orf48/orf47-s

<400>8

caaaaaggaggcccttcagatggctattgcaaaagaaaagac42

<210>9

<211>42

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>orf48/orf47-a

<400>9

ggcaccaataactgccttaattagatcattgacccttgaacc42

<210>10

<211>44

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>gp60/61-s

<400>10

acaaaaaggaggcccttcagatgagtgtgcccacacaggacgga44

<210>11

<211>44

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>gp60/61-a

<400>11

ggcaccaataactgccttaatcatgcgttgggcccgtcgaacat44

<210>12

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pec-a

<400>12

ctgaagggcctcctttttgttatccg26

<210>13

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pec-s

<400>13

ttaaggcagttattggtgcccatgcg26

<210>14

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>crtb-l-s

<400>14

taataggtacgccagaccaaaagg24

<210>15

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>crtb-l-a

<400>15

atgaagacatcaactacaactcca24

<210>16

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>crtb-r-a

<400>16

catcgcctatgctcgaaatactgc24

<210>17

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>crtb-r-s

<400>17

tcatagctgagcctgcttctggta24

<210>18

<211>44

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>kan-crtb-a

<400>18

agaagcaggctcagctatgaatgggttaaaaaggatcgatcctc44

<210>19

<211>44

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>kan-crtb-s

<400>19

gttgtagttgatgtcttcatcgcaagcgcaaagagaaagcaggt44

<210>20

<211>45

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pbs-crtb-a

<400>20

ttggtctggcgtacctattattgttatccgctcacaattccacac45

<210>21

<211>44

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pbs-crtb-s

<400>21

atttcgagcataggcgatgatgcaggaattcgatatcaagctta44

<210>22

<211>39

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pbs-kan-s

<400>22

tcgatcctttttaacccattgcaggaattcgatatcaag39

<210>23

<211>39

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pbs-cre-a

<400>23

gcgacacgaattatgcagtttgttatccgctcacaattc39

<210>24

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>theoe-cre-s

<400>24

actgcataattcgtgtcgctcaag24

<210>25

<211>32

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>theoe-cre-a

<400>25

ctttgcgcttgcgcggaattaattcatgagcg32

<210>26

<211>32

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>kan-s

<400>26

aattaattccgcgcaagcgcaaagagaaagca32

<210>27

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>kan-a

<400>27

atgggttaaaaaggatcgatcctc24

<210>28

<211>56

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>c-k-loxp66

<400>28

taccgttcgtataatgtatgctatacgaagttatatgggttaaaaaggatcgatcc56

<210>29

<211>56

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>c-k-loxp71

<400>29

taccgttcgtatagcatacattatacgaagttatactgcataattcgtgtcgctca56

<210>30

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>argr-l-s

<400>30

tcaactcgtactcgcttctccttc24

<210>31

<211>61

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>argr-l-loxp71

<400>31

tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtagtcttacctcggctggttgg60

c61

<210>32

<211>62

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>argr-r-loxp66

<400>32

acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtaagcgcccctagttcaaggct60

tg62

<210>33

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>argr-r-a

<400>33

tgatgacctcatctggagcgttac24

<210>34

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>△argr-jd-s

<400>34

gttgtcatcaccgatacctgggtatcca28

<210>35

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>△argr-jd-a

<400>35

aggtcgagagaaactgcgatgacttcac28

<210>36

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>crtb-l-s（1）

<400>36

gaagtgttgatagaaatgacctca24

<210>37

<211>63

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>crtb-l-loxp71

<400>37

tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtaatgaagacatcaactacaac60

tcc63

<210>38

<211>62

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>crtb-r-loxp66

<400>38

acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtatcatagctgagcctgcttct60

gg62

<210>39

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>crtb-r-a（1）

<400>39

gtcactagtgctgactccccctct24

<210>40

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>△crtb-jd-s

<400>40

ccaggcgttaattctaccaaatcgagat28

<210>41

<211>28

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>△crtb-jd-a

<400>41

ggtctgacagtaaccggcggagtaatta28

<210>42

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>ncgl-l-s

<400>42

gacggtggtgacttttgaacgaag24

<210>43

<211>62

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>ncgl-l-loxp71

<400>43

tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtagacgctgattacagacgtgt60

cc62

<210>44

<211>66

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>ncgl-r-loxp66

<400>44

acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtagagccaagattagcgctgaa60

aagtag66

<210>45

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>ncgl-r-a

<400>45

gaacggagtccaagtttgcatcag24

<210>46

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>prob-l-s

<400>46

gatggcccgtgttcattatctccg24

<210>47

<211>62

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>prob-l-loxp71

<400>47

tgcagtataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtatccggattcatgtccgtatg60

cg62

<210>48

<211>62

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>prob-r-loxp66

<400>48

acccatataacttcgtatagcatacattatacgaacggtaagcgcgggcctgctggtggc60

ag62

<210>49

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>prob-r-a

<400>49

gtcaggaagtggctcaggatc21