本發(fā)明屬于仔豬養(yǎng)殖防病技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種仔豬大腸桿菌血清型鑒定及其毒力因子檢測方法。

背景技術(shù)：

仔豬腹瀉病是目前豬養(yǎng)殖過程中最為常見的疾病之一，常常導(dǎo)致仔豬生長緩慢、停滯甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。中國仔豬腹瀉病其原因復(fù)雜，主要為傳染性腹瀉，其中病毒性病原有傳染性胃腸炎病毒、流行性腹瀉病毒及輪狀病毒等；細(xì)菌性病原主要有大腸桿菌、沙門氏菌和魏氏梭菌等。

仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一類傳染病，造成仔豬黃痢、白痢和水腫病。仔豬黃痢是初生仔豬的急性、致死性傳染病，主要發(fā)生于1周齡內(nèi)仔豬，以1～3日齡最為常見，發(fā)病率和死亡率均很高。仔豬白痢主要發(fā)生于10～30日齡仔豬，發(fā)病率高，死亡率低。目前大腸桿菌血清型繁多，抗原成分復(fù)雜，完整的血清分型包括菌體抗原(o抗原)、莢膜抗原(k抗原)、鞭毛抗原(h抗原)及菌毛抗原(f抗原)。到目前為止，已有175個o抗原，80個k抗原，56個h抗原及20多個f抗原被正式鑒定。因大腸桿菌抗原血清型的多樣性給大腸桿菌病的防治造成了極大的困難，目前雖有部分疫苗對其進(jìn)行預(yù)防注射，但效果并不理想。

目前，常規(guī)檢測豬源大腸桿菌毒素的方法費(fèi)時耗錢，操作復(fù)雜，不適合大批量臨床分離株的檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種仔豬大腸桿菌血清型鑒定及其毒力因子檢測方法。

pcr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法的建立為臨床實驗室提供了一個更為快速、簡便、靈敏的測定毒素的方法。與傳統(tǒng)血清學(xué)方法相比，pcr方法準(zhǔn)確性高，檢出時間短，是目前推廣使用的方法。

所述的方法包括如下步驟：

步驟1：細(xì)菌分離及純化。

取病料樣品于含2％(體積百分?jǐn)?shù))血清的tsa瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18～24h；然后挑取單菌落繼續(xù)在麥康凱培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，穩(wěn)定純化3代后，單菌落再接種于lb培養(yǎng)基中，進(jìn)行純菌增殖，得到分離菌，-80℃甘油凍存，備用。

步驟2：待檢菌株生化鑒定；

將步驟1得到的分離菌分別作吲哚試驗、甲基紅試驗、vp試驗、構(gòu)椽酸鹽利用試驗和三糖鐵瓊脂試驗，逐一鑒定篩選，大腸桿菌參考菌株atcc25922作對照，篩選出的菌株，再做葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、尿素發(fā)酵試驗；確定分離菌為大腸桿菌。

步驟3：大腸桿菌o血清型鑒定；

抗原的制備：取分離菌光滑菌落接種于普通瓊脂斜面小管，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用2ml0.5％石炭酸生理鹽水洗下普通瓊脂斜面小管培養(yǎng)物，置于小圓底試管，用塞子塞住，制成濃稠菌懸液，121℃高壓2h，破壞其k抗原，制成高壓抗原。

步驟4：大腸桿菌o抗原定型血清型鑒定。

先進(jìn)行玻片凝集試驗初步篩選o血清型，然后通過試管凝集試驗確定其o血清型。定型標(biāo)準(zhǔn)為血清的試管凝集價≥640。

玻片凝集反應(yīng)：將單因子血清進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)。取高壓抗原10μl于玻片上，再取10μl單因子血清與之混合，使之充分混勻，30s內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)。同時以高壓抗原與0.5％石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象。

試管凝集反應(yīng)：在l排小圓底試管中先加0.5％石炭酸生理鹽水稀釋液，第1管加1.5ml，從第2管起各管加0.5ml，然后在第1管加入大腸桿菌單因子血清0.5ml，混合后，從第1管吸0.5ml，加入第2管，依次作1∶2、1∶4、1∶8……1∶1024系列倍比濃度稀釋，然后各管加0.5ml普通肉湯高壓抗原，振蕩使血清和抗原充分混勻，放入37℃培養(yǎng)箱18～20h，取出后在室溫靜置2h，記錄結(jié)果。每個試驗設(shè)有以下各組：①標(biāo)準(zhǔn)抗原+陽性血清對照；②標(biāo)準(zhǔn)抗原+陰性血清對照；③標(biāo)準(zhǔn)抗原+生理鹽水對照。

步驟5：大腸桿菌主要毒力因子檢測；

大腸桿菌dna模板制備：按照細(xì)菌dna基因組提取試劑盒方法進(jìn)行操作，提取大腸桿菌dna，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物設(shè)計與合成：根據(jù)genbank上已公布的序列(登錄號：cp009072.1)設(shè)計引物，用于毒力因子的擴(kuò)增，引物由北京諾賽生物技術(shù)公司合成，濃度均為50mmol/l，引物信息見表1。

pcr擴(kuò)增；

以提取的dna基因組作為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，檢測64株分離菌對6個毒力因子的攜帶情況。pcr反應(yīng)體系20μl:2×easytaqpcrsupermix10ml，上、下游引物各0.5μl，dna模板1μl，雙蒸水8μl。pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共35個循環(huán)；72℃再延伸10min。反應(yīng)結(jié)束，取10μlpcr產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)；對分離的64株仔豬源致病性大腸桿菌血清型進(jìn)行鑒定，主要有8種，分別為o101(18.8％)、o8(11.0％)、o20(11.0％)、o64(12.5％)、o45(4.6％)、o149(4.6％)、o2(1.5％)、o89(1.5％)。其中，o101(18.8％)、o8(11.0％)、o20(11.0％)、o64(12.5％)是4種主要流行血清型。

(2)；本發(fā)明實施例中對64株仔豬源致病性大腸桿菌毒力因子基因進(jìn)行pcr檢測，攜帶毒力因子asta和eaea的菌株超過50％，而30％以上的菌株分別擁有sta和stx2e。另外，80％細(xì)菌至少擁有2個毒力因子，其中毒力因子組合stx2e+asta和stx2e+eaea較為流行，分別為20株和25株，而毒力因子組合sta+stb和stb+stx2e較為少見，僅分別檢測到3株和2株。

附圖說明

圖1a～1f分別為實施例中仔豬源致病性大腸桿菌毒力因子基因pcr檢測結(jié)果電泳圖，圖1a，stb基因；圖1b，asta基因；圖1c，eaea基因；圖1d，sepa基因；圖1e，sta基因；圖1f，stx2e基因。標(biāo)號1～9表示待檢菌株。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

本發(fā)明提供一種仔豬大腸桿菌血清型鑒定及其毒力因子檢測方法，所述的檢測方法中涉及到的蛋白胨購自oxoid公司；氯化鈉、乳糖、蔗糖、牛肉膏、甘油等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備廠；隔水式恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱均購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；pcr儀購自bio-rad公司；電泳儀(dyy-6c型)購自北京六一儀器廠；紫外透射分析儀購自北京智源通技術(shù)研究所；瞬時離心機(jī)購自江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

所述的仔豬大腸桿菌血清型鑒定及其毒力因子檢測方法包括如下步驟：

第一步，細(xì)菌分離及純化。

取病料樣品于含2％(體積分?jǐn)?shù))血清的tsa瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18～24h后，見到有白色、隆起、光滑的黏稠菌落后，用接種環(huán)勾取菌落涂片后采用革蘭氏染色鏡檢，可見兩端鈍圓，散在的紅色小桿菌，如圖1。

然后從每個tsa瓊脂平板上挑取單菌落繼續(xù)在麥康凱培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48h，穩(wěn)定純化3代后，單菌落再接種于lb培養(yǎng)基中，進(jìn)行純菌增殖，可見呈紅色、隆起、光滑濕潤型菌落，為典型大腸桿菌培養(yǎng)特性和形態(tài)特征。以上結(jié)果可初步判定分離菌為大腸桿菌。將分離菌-80℃甘油凍存，備用。

所述的病料樣品來自2010～2015年，在北京周邊規(guī)模化豬場收集400份仔豬腹瀉樣品中分離得到的64株大腸桿菌。大腸桿菌參考菌株atcc25922、c83907(k88+)、c83529(k99+)和c83710(987+)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

所述的血清為胎牛血清，購自gibco公司。所述的tsa、tsb培養(yǎng)基均購自bd公司。

第二步，待檢菌株生化鑒定；

將第一步中得到的64種大腸桿菌分離菌樣品分別作吲哚試驗、甲基紅試驗、vp試驗、構(gòu)椽酸鹽利用試驗和三糖鐵瓊脂試驗，逐一鑒定篩選，大腸桿菌參考菌株atcc25922作對照，篩選出的菌株，這64株細(xì)菌均符合大腸桿菌特征。再做葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、尿素發(fā)酵試驗，觀察記錄結(jié)果。

將64株大腸桿菌分別進(jìn)行生化試驗，vp和枸櫞酸鹽利用試驗均為陰性，全部毒株甲基紅和吲哚試驗為陽性，56株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖，33株能發(fā)酵蔗糖，不產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素。上述結(jié)果進(jìn)一步表明64株分離菌為大腸桿菌。

第三步，大腸桿菌o血清型鑒定；

抗原的制備：取分離菌光滑菌落接種于普通瓊脂斜面小管，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用2ml0.5％石炭酸生理鹽水洗下普通瓊脂斜面小管培養(yǎng)物，置于小圓底試管，用塞子塞住，制成濃稠菌懸液，121℃高壓(當(dāng)加熱至開鍋，加上高壓閥后，汽體噴出，此時的溫度已達(dá)121℃左右)2h，破壞其k抗原，制成高壓抗原。

第四步，大腸桿菌o抗原定型血清型鑒定；

按中國獸藥監(jiān)察所提供的大腸桿菌o抗原定型血清使用說明書的方法進(jìn)行o血清型鑒定。先進(jìn)行玻片凝集試驗初步篩選可能的o血清型，然后通過試管凝集試驗確定其o血清型。定型標(biāo)準(zhǔn)為血清的試管凝集價≥640。

所述的玻片凝集試驗：將單因子血清進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)，具體為：

取第三步制備得到的高壓抗原10μl于玻片上，再取10μl單因子血清與之混合，使二者充分混勻，30s內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)。同時以高壓抗原與0.5％(質(zhì)量百分比)石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象。

所述的試管凝集試驗：在一排小圓底試管中先加0.5％(質(zhì)量百分比)石炭酸生理鹽水稀釋液，第1管加1.5ml，從第2管起各管加0.5ml，然后在第1管加入大腸桿菌單因子血清0.5ml，混合后，從第1管吸0.5ml，加入第2管，依次作1∶2、1∶4、1∶8……1∶1024系列倍比稀釋，然后各管加0.5ml普通肉湯高壓抗原，振蕩使血清和抗原充分混勻，放入37℃培養(yǎng)箱18～20h，取出后在室溫靜置2h，記錄結(jié)果。每個試驗設(shè)有以下各組：①標(biāo)準(zhǔn)抗原+陽性血清對照；②標(biāo)準(zhǔn)抗原+陰性血清對照；③標(biāo)準(zhǔn)抗原+生理鹽水對照。

第五步，大腸桿菌主要毒力因子檢測；

(5.1)大腸桿菌dna模板制備：按照細(xì)菌dna基因組提取試劑盒方法進(jìn)行操作，提取大腸桿菌dna，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(5.2)引物設(shè)計與合成：根據(jù)genbank上已公布的序列(登錄號：cp009072.1)設(shè)計引物，用于毒力因子的擴(kuò)增，引物由北京諾賽生物技術(shù)公司合成，濃度均為50mmol/l，引物信息見表1。

表1引物信息

(5.3)pcr擴(kuò)增：以提取的dna基因組作為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，檢測64株分離菌對6個毒力因子的攜帶情況。pcr反應(yīng)體系20μl:2×easytaqpcrsupermix10ml，上、下游引物各0.5μl，dna模板1μl，雙蒸水8μl。pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共35個循環(huán)；72℃再延伸10min。反應(yīng)結(jié)束，取10μlpcr產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳。

實現(xiàn)結(jié)果如下：

血清型鑒定：64株仔豬源致病性大腸桿菌血清型分布見表3。由表3可知，對4株仔豬源致病性大腸桿菌鑒定出血清型的有42株，占鑒定菌株的65.5％，22株未能定型，占鑒定菌株的34.5％。流行的主要血清型主要有8種，分別為o101(18.8％)、o8(11.0％)、o20(11.0％)、o64(12.5％)、o45(4.6％)、o149(4.6％)、o2(1.5％)、o89(1.5％)。其中，o101(18.8％)、o8(11.0％)、o20(11.0％)、o64(12.5％)是4種主要流行血清型，其余各血清型較為分散，相同來源的菌株有相同血清型分布，也有不同血清型分布，而不同來源的菌株也有部分具有相同血清型。

表364株仔豬源致病性大腸桿菌血清型分布表

毒力因子檢測：

本試驗對64株仔豬源致病性大腸桿菌毒力因子基因進(jìn)行pcr檢測，部分檢測結(jié)果見圖1，(圖1中，)其攜帶毒力因子基因情況見表4。攜帶毒力因子asta和eaea的菌株超過50％，而30％以上的菌株分別擁有sta和stx2e。另外，80％細(xì)菌至少擁有2個毒力因子，其中毒力因子組合stx2e+asta和stx2e+eaea較為流行，分別為20株和25株，而毒力因子組合sta+stb和stb+stx2e較為少見，僅分別檢測到3株和2株。5株細(xì)菌中沒有檢測到所調(diào)查的任何一個毒力因子。

表464株仔豬源致病性大腸桿菌毒力因子分布表

最后應(yīng)當(dāng)說明的是:以上實施例僅用以解釋說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對其限制；盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行修改或者對部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明請求保護(hù)的技術(shù)方案范圍當(dāng)中。

本發(fā)明實施例的試驗是對北京周邊規(guī)模化豬場分離出64株仔豬源致病性大腸桿菌進(jìn)行o血清型鑒定，結(jié)果顯示仔豬源大腸桿菌的血清型復(fù)雜，地區(qū)分布廣泛，且差異較大。在定型42株菌中主要包括了8種血清型，分別為o101(18.8％)、o8(11.0％)、o20(11.0％)、o64(12.5％)、o45(4.6％)、o149(4.6％)、o2(1.5％)和o89(1.5％)，占分離菌株的65.5％。從鑒定比例中看出北京市的優(yōu)勢血清型為o101(18.8％)、o8(11.0％)、o20(11.0％)、o64(12.5％)，與山西省優(yōu)勢血清型基本一致，與河南省優(yōu)勢血清型o8，廣東省優(yōu)勢血清型o107等不完全符合，證實了不同地區(qū)仔豬致病性大腸桿菌流行的主要血清型不同，可能是由于養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，各地品種頻繁的流通，導(dǎo)致了血清型的不斷變化，為本地區(qū)篩選優(yōu)勢血清型且具有良好免疫原性的菌株制備多價苗提供數(shù)據(jù)參考。

本研究從北京周邊分離到的仔豬大腸桿菌攜帶的毒力因子主要有sta、stx2e、asta和eaea等，擁有asta和eaea的菌株超過50％，擁有sta和stx2e的菌株占30％以上。80％的細(xì)菌至少擁有2個毒力因子，這些毒力因子在疾病發(fā)生過程中有著非常重要的作用。

目前，常規(guī)檢測豬源大腸桿菌毒素的方法費(fèi)時耗錢，操作復(fù)雜，不適合大批量臨床分離株的檢測。pcr方法的建立為臨床實驗室提供了一個更為快速、簡便、靈敏的測定毒素的方法。與傳統(tǒng)血清學(xué)方法相比，pcr方法準(zhǔn)確性高，檢出時間短，是目前推廣使用的方法。