本發(fā)明屬于植物提取物分離制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從油橄欖果水中分離制備羥基酪醇的方法。
背景技術(shù)：
羥基酪醇(hydroxytyrosol，HT)的化學(xué)名稱為3,4-二羥基苯乙醇，是一種天然多酚類化合物，分子量很小，單體為黃褐色油狀液體。羥基酪醇同其他酚類物質(zhì)一樣具有酚羥基，而且在連有苯環(huán)的乙醇鏈上也具有醇羥基，是一種環(huán)烯醚萜類羥基芳族化合物，屬兩性分子，具有脂溶性和水溶性。生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，羥基酪醇具有良好的抗氧化活性，可有效地清除自由基和氧化物，被認(rèn)為是最具清除自由基的天然抗氧化劑之一，并且在抗壓、降血壓、降血糖、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗癌防癌等方面具有積極的促進(jìn)作用。因此，在全民倡導(dǎo)大健康的新時(shí)代，含有羥基酪醇的提取物有望成為食品、保健食品、特殊醫(yī)學(xué)用途食品的新原料。
天然羥基酪醇主要存在于油橄欖葉和果實(shí)中，在油橄欖葉中的含量甚微，約0.2％～0.7％，在油橄欖果實(shí)中的含量相對較高，除了以游離的形式存在外，多數(shù)以結(jié)合態(tài)生物形式存在。
目前，羥基酪醇的制備主要有人工合成和從植物中提取分離兩大類方法。申請?zhí)枮?01510242626.8、201410069820.6、200910017367.3、200880007487.9的中國發(fā)明專利分別采用了生物發(fā)酵合成法和化學(xué)合成法制備羥基酪醇，由于采用的原料成本昂貴，合成過程復(fù)雜且有毒副產(chǎn)物伴生等因素，目前依然還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，并未完全工業(yè)化。申請?zhí)枮?01510067619.9、201510371820.6、201510384388.4、201610426012.X、201610590631.2、201310518499.0、201410802938.5、201010297375.0、201010573775.X的發(fā)明專利中報(bào)道了以橄欖苦苷為原料，通過酶解或化學(xué)法使其分解成為羥基酪醇，這些方法有的需要強(qiáng)酸或強(qiáng)堿、有的需要酶解或高溫、還有的需要大孔樹脂富集，上述條件都可能會帶來安全性隱患，致使用上述方法制備的羥基酪醇提取物無法成為食品、保健食品和特殊醫(yī)學(xué)用途食品的原料，從而使其應(yīng)用受到限制。申請?zhí)枮?01010535347.8的專利報(bào)道了從高含量油橄欖葉中高效富集羥基酪醇的方法，主要采用超聲或微博提取、大孔樹脂富集和中壓制備色譜分離等技術(shù)，制備的產(chǎn)品羥基酪醇含量高達(dá)90％以上，此方法由于成本昂貴從而限制了其應(yīng)用。申請?zhí)枮?01410034710.6的專利報(bào)道了一種采用水提印加果葉制備羥基酪醇的方法，拓展了羥基酪醇制備的原料來源，但是由于工藝中包含大孔樹脂富集和冷凍干燥，導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高，使生產(chǎn)企業(yè)望而卻步。申請?zhí)枮?01510162731.0的專利發(fā)明了一種以油橄欖葉為原料，超聲輔助原位萃取天然羥基酪醇的方法，由于制備過程中多次使用高溫，導(dǎo)致羥基酪醇分級、含量降低。申請?zhí)枮?00710057290.3的專利以橄欖提取液為原料制備羥基酪醇的方法，整個(gè)工藝中不僅使用大孔樹脂富集純化、而且高溫濃縮，致使最終產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性都有所降低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種從油橄欖果水中分離制備羥基酪醇的方法，本發(fā)明制備的羥基酪醇純度可滿足需求，性質(zhì)穩(wěn)定。整個(gè)制備過程方法簡單、低溫運(yùn)行、綠色環(huán)保且適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足。
本發(fā)明的制備方法，具體包括如下步驟：
1)將油橄欖果水進(jìn)行固液分離后，獲得待分離的果水液體；
2)將步驟1)所得的果水液體加入有機(jī)溶劑，得混合液Ⅰ；
3)攪拌下在步驟2)所得的混合液Ⅰ中加入無機(jī)鹽，直至無機(jī)鹽在混合溶液Ⅰ中不再溶解，有固體出現(xiàn)時(shí)停止攪拌，靜置，得混合溶液Ⅱ；
4)分離步驟3)所得的混合溶液Ⅱ的有機(jī)相，在溫度不超過60℃下濃縮，得濃縮液；
5)將步驟4)所得的濃縮液干燥，滅菌，即得羥基酪醇提取物。
作為實(shí)施例中的一種具體操作，步驟1)所述的油橄欖果水為油橄欖果榨油后殘留的廢水；
上述步驟1)所述的固液分離是通過離心或與膜過濾方式完成的。
上述步驟2)所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯、正丁醇等中的一種或幾種；
上述步驟2)所述的有機(jī)溶劑和果水液體的體積比為1:5～5:1，萃取時(shí)間10～30min；
上述步驟3)所述的無機(jī)鹽為硫酸鈉、硫酸鈣、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂中的一種或幾種；
上述步驟5)所述的干燥方式為真空干燥、微波干燥、鼓風(fēng)干燥、冷凍干燥中的一種；
上述步驟5)所述的滅菌方式包括Co-60輻射滅菌、紫外照射滅菌、電子束滅菌中的一種或者幾種，滅菌時(shí)間為10～20min。
本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：
1)本發(fā)明在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，首次應(yīng)用油橄欖果榨油后所殘留的廢水作為提取羥基酪醇的原料，使其中含有的大量的羥基酪醇不被浪費(fèi)，極大地提高了羥基酪醇的提取率，同時(shí)變廢為寶。
2)本發(fā)明全程所有步驟均在低于60℃下進(jìn)行，并且沒有添加任何強(qiáng)酸強(qiáng)堿，避免了羥基酪醇在提取制備過程中不被分解。
3)本發(fā)明使用萃取的方法，大大縮短了純化羥基酪醇的時(shí)間，也沒有用任何材料進(jìn)行分離和純化，確保了羥基酪醇提取物的安全性，使其符合食品、保健食品和特殊醫(yī)學(xué)用途食品的原料要求。
具體實(shí)施方式
以下為本發(fā)明的實(shí)施例，對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)該就此理解為本發(fā)明上述主體的范圍僅限于以下的實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)的前提下，還可以做出改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
申請人在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，油橄欖果在壓榨獲取橄欖油的同時(shí)，產(chǎn)生大量的果水，此果水中羥基酪醇的含量高達(dá)1％，這為分離制備天然羥基酪醇提供了新的思路和途徑。
本發(fā)明的羥基酪醇含量測定方法如下：
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱取98％的羥基酪醇對照品置于容量瓶中，去離子水溶解并定容，將該溶液按對半稀釋法依次配置。質(zhì)量濃度由小到大依次進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次，記錄保留時(shí)間和峰面積。縱坐標(biāo)為峰面積平均值，橫坐標(biāo)為橄欖苦苷質(zhì)量濃度，繪制HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線，得HPLC線性回歸方程。
2.試樣的測定
準(zhǔn)確吸取待測液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制下的方法通過HPLC測定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算羥基酪醇的濃度。
3.測定結(jié)果的計(jì)算
式中：C0——對照品的濃度，mg/mL；
A0——HPLC測得的對照品的峰面積；
C1——待測液的濃度，mg/mL；
A1——HPLC測得的待測液的峰面積。
4.重復(fù)性
每個(gè)試樣取三個(gè)平行樣進(jìn)行測定，以其算術(shù)平均值為測定結(jié)果，允許相對偏差為5％
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
實(shí)施例1：
1)將油橄欖果榨油時(shí)所殘留的廢水通過管式離心機(jī)固液分離，得到離心液體。取100mL油橄欖果水離心液體置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，在溫度低于55℃下濃縮至75mL。
2)將上述濃縮液靜置，冷卻至室溫后加入75mL乙酸乙酯，并攪拌，邊攪拌邊加入2g硫酸鈉。
3)持續(xù)攪拌20分鐘，置于分液漏斗中靜置30分鐘，可明顯觀察到上述溶液分為兩相。
4)取上相液體在溫度低于55℃下濃縮，微波干燥后得羥基酪醇提取物。
上述方法從油橄欖果水中提取得到的羥基酪醇的純度為17％，轉(zhuǎn)移率93％。
實(shí)施例2：
1)將油橄欖果水通過碟片式離心機(jī)固液分離，得到離心液體。取1L油橄欖果水離心液體濃縮，在溫度低于60℃下濃縮至600mL。
2)將上述濃縮液靜置，冷卻至室溫后，加入500mL乙酸乙酯，邊攪拌邊加入32g硫酸鈉。
3)持續(xù)攪拌30分鐘，置于分液漏斗中靜置30分鐘，可明顯觀察到上述溶液分為兩相。
4)取上相液體在溫度低于55℃下濃縮，冷凍干燥后得羥基酪醇。
上述方法從油橄欖果水中提取的羥基酪醇提取物的純度為26％，轉(zhuǎn)移率87％。
實(shí)施例3：
1)將1000L油橄欖果水通過管式離心機(jī)和陶瓷膜的偶聯(lián)分離設(shè)備，得到的液體在雙效濃縮罐中進(jìn)行濃縮，溫度低于55℃下濃縮至750L。
2)將上述濃縮液打入醇沉罐中，冷卻至室溫后加入750L乙酸乙酯，開啟攪拌，邊攪拌邊分批加入27kg工業(yè)硫酸鈉。
3)再持續(xù)攪拌20分鐘，靜置30分鐘，從可視鏡可以明顯看出溶液分為上中下三相。
4)將上相液體打入雙效濃縮罐中，在溫度低于55℃下濃縮至密度為1.2，微波干燥，得羥基酪醇提取物。
上述方法從油橄欖果水中提取羥基酪醇提取物的純度為32％。