本發(fā)明涉及生物分子檢測(cè)裝置和測(cè)序方法，特別是涉及一種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)和納米孔的dna測(cè)序裝置和測(cè)序方法。

背景技術(shù)：

dna測(cè)序技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的研究熱點(diǎn)技術(shù)之一。在所有以低成本、高通量、直接測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的第三代測(cè)序技術(shù)中，基于納米孔的單分子測(cè)序技術(shù)被認(rèn)為是最有發(fā)展?jié)摿拖Ｍ麑?shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的。然而基于納米孔的dna基因序列檢測(cè)發(fā)展到現(xiàn)在一直受到膜片鉗放大器掃描頻率的限制，現(xiàn)有的采樣頻率還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到精確測(cè)序的要求。因此研究者們采用了一系列方法來降低dna過孔的速度，有降低體系溫度和外加電壓，增加溶液粘度來降低dna的過孔速度，但這些方法只能很有限的降低dna的過孔速度，距離實(shí)現(xiàn)dna基因測(cè)序的目標(biāo)甚遠(yuǎn)；有提出采用聚合酶對(duì)dna的聚合作用來控制dna的遷移速度，雖然這樣可以降低dna的過孔速度，但聚合酶要求的測(cè)量條件非常苛刻，不利于高效低成本的dna測(cè)序檢測(cè)；所有基于納米孔的測(cè)序方法目前還沒有有效的控制dna通過納米孔速度的方法，由于dna過孔速度太快，造成了單個(gè)堿基檢測(cè)識(shí)別率不高的問題。

因此研究開發(fā)一種可有效降低dna過孔速度的dna測(cè)序裝置極具意義，可大大推動(dòng)高通量低成本基因測(cè)序技術(shù)在生物醫(yī)療檢測(cè)中的發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠控制dna過孔速度的基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)和納米孔的dna測(cè)序裝置和測(cè)序方法。

技術(shù)方案：一種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)和納米孔的dna測(cè)序裝置，包括：

介電泳裝置；

納米孔單分子傳感器，該傳感器位于所述介電泳裝置的內(nèi)部，將介電泳裝置分為左右兩個(gè)空腔，且該傳感器設(shè)有將所述左右兩個(gè)空腔連通的通孔；

隧穿電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)與所述納米孔單分子傳感器電連接；

離子電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的兩端分別置于所述通孔左右兩側(cè)的空腔內(nèi)；

激光系統(tǒng)，該系統(tǒng)位于介電泳裝置的外部，其發(fā)射的激光束照射于所述介電泳裝置上。

其中，所述介電泳裝置包括兩片導(dǎo)電玻璃，阿爾法氫化硅層以及交流信號(hào)發(fā)生器；所述兩片導(dǎo)電玻璃之間有一定的孔隙，其中，導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電層位于內(nèi)側(cè)；所述阿爾法氫化硅層位于下片導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電層上；所述交流信號(hào)發(fā)生器的兩端分別連接至上、下兩片導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電層上。

納米孔單分子傳感器，該傳感器包括基底以及貼合在基底一側(cè)上的納米薄膜；其中，基底的上端與上片導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電層連接，下端與阿爾法氫化硅連接，將所述介電泳裝置分為左右兩個(gè)空腔，基底上設(shè)有一通孔，將所述兩個(gè)空腔連通；所述納米薄膜含有一納米孔，且該納米孔與所述基底上的通孔連通。

所述隧穿電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)包括兩個(gè)電極ⅱ、電源ⅱ以及微弱電流測(cè)量裝置ⅱ；所述兩個(gè)電極ⅱ分別設(shè)置于納米薄膜的納米孔上下兩側(cè)，上側(cè)電極ⅱ通過介電泳裝置外部的微弱電流測(cè)量裝置ⅱ與介電泳裝置外部的電源ⅱ的一端相連，電源ⅱ的另一端與下側(cè)電極ⅱ相連。

所述離子電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)包括兩個(gè)電極ⅰ、電源ⅰ以及微弱電流測(cè)量裝置??；所述兩個(gè)電極ⅰ分別設(shè)置于所述納米孔左右兩側(cè)的空腔內(nèi)，右側(cè)電極ⅰ通過介電泳裝置外部的微弱電流測(cè)量裝置ⅰ與介電泳裝置外部的電源ⅰ的負(fù)極相連，電源ⅰ的正極與左側(cè)電極ⅰ相連。

所述激光系統(tǒng)設(shè)于所述介電泳裝置下層導(dǎo)電玻璃的下方，包括激光發(fā)射器和光學(xué)傳輸器件，所述激光發(fā)射器發(fā)射的激光束照射位于納米薄膜一側(cè)納米孔附近的阿爾法氫化硅。

進(jìn)一步的，所述電極ⅰ為ag或agcl電極，所述電極ⅱ為pt或au電極。所述電源ⅰ的偏置電壓為0.05～2v，電源ⅱ的偏置電壓為0.05～10v。所述微弱電流測(cè)量裝置ⅰ和微弱電流測(cè)量裝置ⅱ均為皮安級(jí)電流表。所述含有納米孔的納米薄膜上的納米孔的直徑為1.5～10nm。

一種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)和納米孔的dna測(cè)序裝置的測(cè)序方法，包括以下步驟：

(1)搭建好所述介電泳裝置、納米孔單分子傳感器、隧穿電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)、離子電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和激光系統(tǒng)，構(gòu)成檢測(cè)平臺(tái)。

(2)配置適量濃度為0.1～2mol/l、ph值為6.0～8.0的氯化鈉溶液，分成兩份，其中一份加入適量待檢測(cè)dna，使得溶液中dna濃度為1～100μmol/l；在含有納米孔的納米薄膜的左右兩側(cè)分別加入氯化鈉溶液和含有待檢測(cè)dna的氯化鈉溶液。

(3)兩片導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電層分別連接至交流信號(hào)發(fā)生器的兩端，給交流信號(hào)發(fā)生器施加峰峰幅值為0～20v，頻率為0.1～10mhz的交流正弦信號(hào)；電源ⅰ的偏置電壓為0.05～2v，電源ⅱ的偏置電壓為0.05～10v。

(4)調(diào)節(jié)激光系統(tǒng)發(fā)射合適強(qiáng)度的激光束，并通過光學(xué)傳輸器件使得激光束照射在納米孔附近的阿爾法氫化硅區(qū)域，通過調(diào)節(jié)激光束照射區(qū)域來調(diào)節(jié)最終作用在dna上的介電泳力來實(shí)現(xiàn)對(duì)dna過孔速度的控制。

(5)通過離子電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和隧穿電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)dna穿過納米孔時(shí)的電流變化信號(hào)，并進(jìn)行對(duì)比分析，找出四種堿基與信號(hào)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，完成測(cè)序。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)與基于電流信號(hào)檢測(cè)的納米孔單分子傳感器相結(jié)合應(yīng)用于dna測(cè)序技術(shù)中，可通過相關(guān)參數(shù)調(diào)節(jié)dna所受的介電泳作用力大小來有效控制dna過孔速度，減慢了dna過孔速度，提高了測(cè)序精度，這些為實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率、直接納米孔測(cè)序奠定了基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)新一代dna測(cè)序技術(shù)低成本、高通量和直接測(cè)序提供技術(shù)支撐。

附圖說明

圖1是本發(fā)明測(cè)序裝置的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

圖1所示的一種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)和納米孔的dna測(cè)序裝置，包括介電泳裝置、納米孔單分子傳感器、隧穿電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)、離子電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)以及激光系統(tǒng)。

介電泳裝置包括上下兩片導(dǎo)電玻璃1、阿爾法氫化硅2以及交流信號(hào)發(fā)生器3；上下兩片導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電層101朝里，上下兩片導(dǎo)電玻璃之間形成一個(gè)空腔；在下層導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電層上沉積有阿爾法氫化硅(ɑ-sih)，兩片導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電層均連接至交流信號(hào)發(fā)生器，交流信號(hào)發(fā)生器可產(chǎn)生峰峰幅值為0～20v，頻率為0.1～10mhz的交流正弦信號(hào)。

納米孔單分子傳感器包括基底4和納米薄膜5；基底設(shè)于介電泳裝置的空腔內(nèi)，上端與上層導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電層連接，下端與阿爾法氫化硅連接，基底將介電泳裝置的空腔分為左右兩個(gè)空腔；基底上設(shè)有通孔401，該通孔將左右兩個(gè)空腔連通；納米薄膜含有納米孔501，納米薄膜貼合在基底的一側(cè)，且納米孔與基底上的通孔連通，納米孔直徑為1.5～10nm。

隧穿電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)包括兩個(gè)納米pt或au電極6、電源ⅱ7以及微弱電流測(cè)量裝置ⅱ8；其中一個(gè)電極設(shè)于納米薄膜的納米孔上側(cè)，另一個(gè)電極設(shè)于納米薄膜的納米孔下側(cè)；上側(cè)電極通過微弱電流測(cè)量裝置ⅱ與電源ⅱ的一端相連，電源ⅱ的另一端與下側(cè)電極相連；其中，電源ⅱ和微弱電流測(cè)量裝置ⅱ設(shè)于介電泳裝置外部，電源ⅱ的偏置電壓為0.05～10v，微弱電流測(cè)量裝置ⅱ為皮安級(jí)電流表。

離子電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)包括兩個(gè)ag或agcl電極9、電源ⅰ10以及微弱電流測(cè)量裝置ⅰ11；其中一個(gè)電極設(shè)于納米孔右側(cè)的空腔內(nèi)，另一個(gè)電極設(shè)于納米孔左側(cè)的空腔內(nèi)；右側(cè)電極通過微弱電流測(cè)量裝置ⅰ與電源ⅰ的負(fù)極相連，電源ⅰ的正極與左側(cè)電極相連；其中，電源ⅰ和微弱電流測(cè)量裝置ⅰ設(shè)于介電泳裝置外部，電源ⅰ的偏置電壓為0.05～2v，微弱電流測(cè)量裝置ⅰ為皮安級(jí)電流表。

激光系統(tǒng)包括激光發(fā)射器和光學(xué)傳輸器件；激光發(fā)射器用來產(chǎn)生激光束12，并通過光學(xué)傳輸器件使得激光束照射在納米孔附近的阿爾法氫化硅區(qū)域。

一種基于光誘導(dǎo)介電泳技術(shù)和納米孔的dna測(cè)序裝置的測(cè)序方法，包括以下步驟：

(1)按照?qǐng)D1所示布局搭建好介電泳裝置、納米孔單分子傳感器、隧穿電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)、離子電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和激光系統(tǒng)，構(gòu)成檢測(cè)平臺(tái)。

(2)配置適量濃度為0.1～2mol/l、ph值為6.0～8.0的氯化鈉溶液，分為兩份；然后其中一份加入適量待檢測(cè)dna13，使得溶液中dna濃度為1～100μmol/l；在納米孔左右兩側(cè)分別加入氯化鈉溶液和含有待檢測(cè)dna的氯化鈉溶液。

(3)兩片導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電層連接至交流信號(hào)發(fā)生器，交流信號(hào)發(fā)生器產(chǎn)生峰峰幅值為0～20v，頻率為0.1～10mhz的交流正弦信號(hào)；電源ⅰ的偏置電壓為0.05～2v，置于納米薄膜所在的右側(cè)ag或agcl電極連接電源ⅰ負(fù)極，置于另一側(cè)的ag或agcl電極連接電源ⅰ正極；電源ⅱ的偏置電壓為0.05～10v。

(4)調(diào)節(jié)激光系統(tǒng)的激光發(fā)射器發(fā)射合適強(qiáng)度的激光束，并通過光學(xué)傳輸器件使得激光束照射在納米孔附近的阿爾法氫化硅區(qū)域，如圖1所示?？烧{(diào)節(jié)激光束照射區(qū)域來調(diào)節(jié)最終作用在dna上的介電泳力來實(shí)現(xiàn)對(duì)dna過孔速度的控制。

(5)通過離子電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和隧穿電流信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)dna穿過納米孔時(shí)的電流變化信號(hào)，并進(jìn)行對(duì)比分析，找出四種堿基與信號(hào)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，完成測(cè)序。

本發(fā)明的工作原理如下：

含單鏈dna分子13的電解液位于測(cè)序反應(yīng)腔右部，dna分子在溶液中帶負(fù)電，在靜電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)作用下，單鏈dna分子成線狀通過納米孔到達(dá)測(cè)序反應(yīng)腔左部。用激光束照射在納米孔右側(cè)附近的阿爾法氫化硅區(qū)域，利用阿爾法氫化硅的明暗電導(dǎo)差異產(chǎn)生非均勻電場(chǎng)，從而對(duì)單鏈dna分子產(chǎn)生介電泳力，減慢單鏈dna分子穿過納米孔的過孔速度?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)交流信號(hào)發(fā)生器產(chǎn)生的交流信號(hào)的頻率和幅值、改變激光強(qiáng)弱及照射位置來調(diào)節(jié)介電泳力大小，從而控制dna分子穿過納米孔的過孔速度大小。在單鏈dna分子穿過納米孔時(shí)，對(duì)通過納米孔的電解液離子電流造成堵塞，導(dǎo)致離子電流急劇變化，由于單鏈dna分子中不同堿基結(jié)構(gòu)不同，在穿越納米孔時(shí)造成的電流變化也不同；采用微弱電流測(cè)量裝置ⅰ對(duì)單鏈dna分子穿越納米孔過程中離子電流發(fā)生阻塞的時(shí)間間隔δt1、阻塞離子電流的大小ib1進(jìn)行定量檢測(cè)；同時(shí)單鏈dna分子通過納米孔時(shí)，不同堿基也會(huì)相應(yīng)的在納米孔處產(chǎn)生不同的隧穿電流，采用微弱電流測(cè)量裝置ⅱ對(duì)單鏈dna分子穿越納米孔過程中隧穿電流發(fā)生改變的時(shí)間間隔δt2、隧穿電流的大小ib2進(jìn)行定量檢測(cè)，其中dna分子中堿基之間的間隔是一定的，所以時(shí)間間隔δt1＝δt2；通過對(duì)所測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析計(jì)算得dna分子序列sequence＝f(δt1,ib1,ib2)，即可得到所測(cè)dna分子的序列。