本發(fā)明屬于殘余石油利用
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體涉及一種厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群的篩選方法。
背景技術(shù):
:對(duì)老油田進(jìn)行深度開發(fā),提高石油采收率已成為當(dāng)前老油田開發(fā)的中心任務(wù)?,F(xiàn)有提高采收率的技術(shù)存在的主要問(wèn)題是提高幅度有限,大量的殘余石油滯留地下。而怎樣利用大量殘存在油藏中的石油又成為一項(xiàng)重要課題。通過(guò)微生物降解石油產(chǎn)甲烷,從而對(duì)殘余石油進(jìn)行利用,成為一條有效途徑。微生物厭氧降解石油產(chǎn)甲烷過(guò)程是多種菌群參與的多步驟反應(yīng),在整個(gè)降解過(guò)程中,影響反應(yīng)速率的因素非常多。油藏中的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了在有機(jī)質(zhì)(特別是殘余石油)降解過(guò)程中,公認(rèn)的降解終端產(chǎn)物是甲烷,而電子受體耗盡是甲烷產(chǎn)生的基礎(chǔ),具體來(lái)說(shuō)產(chǎn)甲烷古菌和其它功能菌群協(xié)同作用,最終使殘余石油得到降解并產(chǎn)生甲烷。而地質(zhì)學(xué)的研究也表明,在數(shù)千年來(lái),油藏內(nèi)部一直自發(fā)進(jìn)行著微生物降解石油產(chǎn)甲烷,因?yàn)榈厍騼?nèi)部的厭氧環(huán)境有利于這一過(guò)程的進(jìn)行。有研究表明:油藏中的微生物群體是由微好氧菌群和兼性厭氧型以及嚴(yán)格厭氧型細(xì)菌組成的,烴類提供了它們存活的基礎(chǔ)條件,其可能原因是隨著油藏的開采,會(huì)大量注入水和其它物質(zhì),這改變了油藏本來(lái)的環(huán)境。目前,還沒(méi)有一種簡(jiǎn)單有效的,篩選厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群的方法出現(xiàn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:為了解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明提供了一種厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群的篩選方法,所述篩選方法本發(fā)明以油田采出液和含油污泥作為樣品,對(duì)其中的菌群進(jìn)行厭氧培養(yǎng),在不加入碳源的情況下,菌群只能利用石油烴作為碳源,進(jìn)而培育篩選出能夠利用石油烴作為碳源的菌群,同時(shí)為了得到適應(yīng)性更強(qiáng)的降解石油烴混合菌群,本發(fā)明同時(shí)使用油田采出液和含油污泥作為樣品,并根據(jù)油田采出液和含油污泥中菌群的不同屬性分別篩選出產(chǎn)氣量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的樣品,進(jìn)而將其混合,得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物。本發(fā)明的技術(shù)方案是,一種厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群的篩選方法,包括以下步驟:s1、取樣:分別從油田的不同區(qū)域采集油田采出液和含油污泥,作為樣品;s2、厭氧培養(yǎng):將所述油田采集液和含油污泥分別按照厭氧條件培養(yǎng);s3、培養(yǎng)結(jié)果測(cè)定:一段時(shí)間后,測(cè)量油田采出液和含油污泥的甲烷產(chǎn)量;s4:菌種混合:篩選油田采集液中產(chǎn)氣量大于0.4μmol/d和含油污泥中產(chǎn)氣量大于1.15μmol/d的樣品,取培養(yǎng)液分別作為最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液,并將最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液進(jìn)行混合,即得到含有降解石油烴混合菌群的混合物。本發(fā)明以油田采出液和含油污泥作為樣品,對(duì)其中的菌群進(jìn)行厭氧培養(yǎng),在不加入碳源的情況下,菌群只能利用石油烴作為碳源,進(jìn)而培育篩選出能夠利用石油烴作為碳源的菌群,同時(shí)為了得到適應(yīng)性更強(qiáng)的降解石油烴混合菌群,本發(fā)明同時(shí)使用油田采出液和含油污泥作為樣品,并根據(jù)油田采出液和含油污泥中菌群的不同屬性分別篩選出產(chǎn)氣量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的樣品,進(jìn)而將其混合,得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物。再使用所述混合物或從中提取出菌群,進(jìn)行石油烴的厭氧降解以產(chǎn)生甲烷。為保證樣品質(zhì)量和多樣性,優(yōu)選的,步驟s1中,所述油田采出液的原油密度為0.87-0.93g/cm3,原油粘度為61.6-169.3mpas,采集所述油田采出液后,使用氮?dú)饷芊獗4?;取距地?0cm以下被石油污染的含油率為5.8-11.3%的含油污泥,取樣后在-5℃下厭氧保存。在油田的不同區(qū)域采集油田采出液或含油污泥,并將不同的樣品分別按照厭氧條件培養(yǎng);厭氧培養(yǎng)為:取30-40g的油田采出液或含油污泥,和60ml無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基充入到120ml無(wú)菌瓶中,30℃下富集培養(yǎng)直到培養(yǎng)瓶中能檢測(cè)到穩(wěn)定的甲烷產(chǎn)量,培養(yǎng)結(jié)束。本發(fā)明中,使用的所述無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基的成分及含量為:kh2po45.0g,k2hpo45.0g,nh4cl5.0g,nacl1.0g,mgcl22.0g,cacl20.1g,酵母粉0.5g,l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g,硫酸亞鐵銨0.5g和刃天青1.0mg,加水定容至1l。所述無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基能夠滿足菌群生長(zhǎng)的需要,保證菌群的正常生長(zhǎng)。為使菌群生長(zhǎng)的更好,優(yōu)選的,所述無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基中還包括維生素水溶液5ml,所述維生素水溶液中維生素的成分及濃度為:維生素h2.0mg/l,維生素b92.0mg/l,維生素b610mg/l,維生素b15.0mg/l,維生素b25.0mg/l,維生素b120.1mg/l,硫辛酸5.0mg/l。進(jìn)一步的,所述無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基中還包括微量元素水溶液5ml,所述微量元素水溶液中的成分及濃度為:次氮基三乙酸1.5g/l,氯化鈷0.1g/l,無(wú)水氯化錳0.1g/l,氯化亞鐵0.1g/l,六水氯化鈷0.18g/l,氯化鋅0.1g/l,五水硫酸銅0.01g/l,十二水硫酸鋁鉀0.02g/l,硼酸0.01g/l,兩水鉬酸鈉0.01g/l和六水氯化鎳0.025g/l。所述無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基的配制方法為:將培養(yǎng)基中除刃天青、維生素水溶液和微量元素水溶液之外的其他組分混合,加熱煮沸的同時(shí)不斷通入氮?dú)?,直到培養(yǎng)基由粉色變?yōu)闊o(wú)色,停止加熱,待體系冷卻后,加入維生素水溶液和微量元素水溶液,滅菌后加入最終質(zhì)量比為0.03%的九水硫化鈉、最終質(zhì)量比為0.02%的碳酸氫鈉,以及刃天青,密封保存。其中,刃天青需要現(xiàn)用現(xiàn)配。由于含油污泥的粘度和濃度較大,為便于后續(xù)的厭氧培養(yǎng),優(yōu)選的,在對(duì)所述含油污泥進(jìn)行厭氧培養(yǎng)之前,向所述含油污泥中加入10倍重量的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基進(jìn)行初級(jí)培養(yǎng)6-8小時(shí),初級(jí)培養(yǎng)結(jié)束后取上清液繼續(xù)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。本發(fā)明中,使用色譜儀對(duì)生成的甲烷產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定,其中fid的溫度為200℃,氣化進(jìn)樣器的溫度為150℃;色譜柱的初溫為35℃,保持15min后以5℃/min的升溫速度升溫至200℃,并保持5min,取樣時(shí)使用氣體收集器從樣品上方收集氣體,然后再用密封注射器取樣和進(jìn)樣,進(jìn)樣體積為0.3ml。為了驗(yàn)證最終產(chǎn)生的氣體為油田采集液或含油污泥中的菌群產(chǎn)生,優(yōu)選的,所述篩選方法還包括使用滅菌組對(duì)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證:使用滅菌后的樣品按照所述厭氧條件培養(yǎng),若最終滅菌后的樣品經(jīng)厭氧條件培養(yǎng)后無(wú)甲烷產(chǎn)生,則證明甲烷氣體由樣品中的菌群產(chǎn)生。如果若最終滅菌后的樣品經(jīng)厭氧條件培養(yǎng)后有甲烷產(chǎn)生,則證明甲烷氣體不全由樣品中的菌群產(chǎn)生,此時(shí)需要重新采用,重復(fù)以上步驟,以得到含有降解石油烴混合菌群的混合物。本發(fā)明的有益效果為:所述篩選方法本發(fā)明以油田采出液和含油污泥作為樣品,對(duì)其中的菌群進(jìn)行厭氧培養(yǎng),在不加入碳源的情況下,菌群只能利用石油烴作為碳源,進(jìn)而培育篩選出能夠利用石油烴作為碳源的菌群,同時(shí)為了得到適應(yīng)性更強(qiáng)的降解石油烴混合菌群,本發(fā)明同時(shí)使用油田采出液和含油污泥作為樣品,并根據(jù)油田采出液和含油污泥中菌群的不同屬性分別篩選出產(chǎn)氣量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的樣品,進(jìn)而將其混合,得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚,下面將對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描述。顯然,所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例,而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所得到的所有其它實(shí)施方式,都屬于本發(fā)明所保護(hù)的范圍。實(shí)施例一種厭氧降解石油烴產(chǎn)甲烷菌群的篩選方法,包括以下步驟:s1、取樣:分別從油田的不同區(qū)域采集油田采出液和含油污泥,作為樣品;本步驟中,采集某油田區(qū)塊的六口油井采出液調(diào)研取樣,將數(shù)個(gè)塑料桶裝滿(約5l),取樣之前通入氮?dú)饷芊?,取樣后迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,低溫保存,編號(hào)為yh1-yh6;取4份距地面30cm以下被石油污染的含油率為5.8-11.3%的含油污泥,取樣后在-5℃下厭氧保存,分別編號(hào)為th1-th6;其中,yh1-yh6的理化性質(zhì)如表1所示。表1:yh1-yh6的理化性質(zhì)附注1:yh代表厭氧培養(yǎng)油田采出液,后面的編號(hào)為取樣地油井編號(hào)s2、厭氧培養(yǎng):將所述油田采集液和含油污泥分別按照厭氧條件培養(yǎng);將不同的樣品分別按照厭氧條件培養(yǎng),厭氧培養(yǎng)為:取30-40g的油田采出液或含油污泥,和60ml無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基充入到120ml無(wú)菌瓶中,30℃下富集培養(yǎng)直到培養(yǎng)瓶中能檢測(cè)到穩(wěn)定的甲烷產(chǎn)量,培養(yǎng)結(jié)束。使用的所述無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基的成分及含量為:kh2po45.0g,k2hpo45.0g,nh4cl5.0g,nacl1.0g,mgcl22.0g,cacl20.1g,酵母粉0.5g,l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g,硫酸亞鐵銨0.5g和刃天青1.0mg,加水定容至1l。所述無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基中還包括維生素水溶液5ml,所述維生素水溶液中維生素的成分及濃度為:維生素h2.0mg/l,維生素b92.0mg/l,維生素b610mg/l,維生素b15.0mg/l,維生素b25.0mg/l,維生素b120.1mg/l,硫辛酸5.0mg/l。所述無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基中還包括微量元素水溶液5ml,所述微量元素水溶液中的成分及濃度為:次氮基三乙酸1.5g/l,氯化鈷0.1g/l,無(wú)水氯化錳0.1g/l,氯化亞鐵0.1g/l,六水氯化鈷0.18g/l,氯化鋅0.1g/l,五水硫酸銅0.01g/l,十二水硫酸鋁鉀0.02g/l,硼酸0.01g/l,兩水鉬酸鈉0.01g/l和六水氯化鎳0.025g/l。將培養(yǎng)基中除刃天青、維生素水溶液和微量元素水溶液之外的其他組分混合,加熱煮沸的同時(shí)不斷通入氮?dú)?,直到培養(yǎng)基由粉色變?yōu)闊o(wú)色,停止加熱,待體系冷卻后,加入維生素水溶液和微量元素水溶液,滅菌后加入最終質(zhì)量比為0.03%的九水硫化鈉、最終質(zhì)量比為0.02%的碳酸氫鈉,以及刃天青,密封保存。其中,刃天青需要現(xiàn)用現(xiàn)配。由于含油污泥的粘度和濃度較大,為便于后續(xù)的厭氧培養(yǎng),在對(duì)所述含油污泥進(jìn)行厭氧培養(yǎng)之前,向所述含油污泥中加入10倍重量的無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基進(jìn)行初級(jí)培養(yǎng)6-8小時(shí),初級(jí)培養(yǎng)結(jié)束后取上清液繼續(xù)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。s3、培養(yǎng)結(jié)果測(cè)定:培養(yǎng)400天后,測(cè)量油田采出液和含油污泥的甲烷產(chǎn)量;本發(fā)明中,使用色譜儀對(duì)生成的甲烷產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定,其中fid的溫度為200℃,氣化進(jìn)樣器的溫度為150℃;色譜柱的初溫為35℃,保持15min后以5℃/min的升溫速度升溫至200℃,并保持5min,取樣時(shí)使用氣體收集器從樣品上方收集氣體,然后再用密封注射器取樣和進(jìn)樣,進(jìn)樣體積為0.3ml。具體來(lái)說(shuō),本實(shí)施例中甲烷的產(chǎn)氣測(cè)定的具體操作為:氣體組分:安捷倫氣相色譜儀。檢測(cè)器:fid200℃;氣化進(jìn)樣器150℃;色譜柱:pona彈性石英毛細(xì)柱(50m×0.2mm×0.5μm);柱溫:初溫35℃,15min;5℃/min升溫至200℃,5min。取樣時(shí)先用氣體收集器從上方收集氣體,然后再用密封注射器取樣,進(jìn)樣體積:0.3ml,將標(biāo)準(zhǔn)氣體用高純氮?dú)庀♂尦刹煌瑵舛龋谏鲜鰲l件下進(jìn)行分析,修正的面積歸一法定量氣體含量。本實(shí)施例中,各樣品的產(chǎn)氣量詳見(jiàn)表2所示表2:各樣品的產(chǎn)氣量結(jié)果表樣品編號(hào)yh1yh2yh3yh4yh5yh6產(chǎn)氣量(μmol)70.599.261.7108.3246.90樣品編號(hào)th1th2th3th4th5th6產(chǎn)氣量(μmol)68.546625.692.560.730.8s4:菌種混合:篩選油田采集液中產(chǎn)氣量大于0.4μmol/d和含油污泥中產(chǎn)氣量大于1.15μmol/d的樣品,取培養(yǎng)液分別作為最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液,并將最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液進(jìn)行混合,即得到含有降解石油烴混合菌群的混合物。從表2中能夠得知,yh5和th2符合要求,所以yh5和th2分別作為最優(yōu)油田采集液培養(yǎng)液和最優(yōu)含油污泥培養(yǎng)液,將yh5和th2的培養(yǎng)液進(jìn)行混合,即得到含有降解石油烴混合菌群的混合物。需要說(shuō)明的是,yh6中未檢出甲烷生成,可能的原因是本實(shí)施例采用厭氧培養(yǎng),而yh6中可能含有好氧菌,本實(shí)施例并未對(duì)yh6進(jìn)行滅菌處理。為了驗(yàn)證最終產(chǎn)生的氣體為油田采集液或含油污泥中的菌群產(chǎn)生,所述篩選方法還包括使用滅菌組對(duì)培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證:使用滅菌后的樣品按照所述厭氧條件培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),無(wú)論是油田采集液還是含油污泥,其最終產(chǎn)生的甲烷的量均為0,由此能夠得出,本實(shí)施例中,甲烷氣體均由樣品中的菌群產(chǎn)生,并且使用本實(shí)施例中的方法,得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物。以上所述,僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此,任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域:
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi),可輕易想到變化或替換,都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此,本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12