本發(fā)明涉及生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株假腸膜明串珠菌產(chǎn)高光學(xué)純度α-熊果苷和高粘接性葡聚糖的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

熊果苷有兩種異構(gòu)體：α-熊果苷和β-熊果苷，兩者是差向異構(gòu)體，化學(xué)名為4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷和4-羥苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，兩者氧苷鍵在空間的方向相反。研究表明，α-熊果苷抑制酪氨酸酶的強(qiáng)度和安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于β-熊果苷，美白效果是后者的9～10倍。因此，α-熊果苷作為高效的化妝品增白劑，目前已經(jīng)逐漸被世界各大品牌所使用：2002年peutaharm推出了含有α-熊果苷的新活性皮膚增白劑，日本資生堂、dhc等品牌也推出了含有α-熊果苷成分的系列化妝品。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)α-熊果苷的化學(xué)性質(zhì)比β-熊果苷效果更穩(wěn)定，能夠方便的加入到各種美白亮膚化妝品中，當(dāng)其ph在3.5～6.5之間時(shí)最穩(wěn)定，推薦的添加量為0.2～5％，可用于所有的配方中。

α-熊果苷和β-熊果苷的來源不同。β-熊果苷可以通過植物提取、植物細(xì)胞培養(yǎng)、人工合成及糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)或逆水解反應(yīng)獲得。而α-熊果苷一般只能通過不同的微生物的酶進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)、植物提取或者微生物的直接轉(zhuǎn)化法獲得。日本學(xué)者kitao等采用蔗糖磷酸化酶，在hepes緩沖液中加入2g氫醌與30g蔗糖40℃反應(yīng)14h可得α-熊果苷2.3g(jp06153976)。劉春巧等利用黃單胞菌bt2112進(jìn)行發(fā)酵，生物催化對(duì)苯二酚合成了α-熊果苷，反應(yīng)得到12.7g/l的熊果苷，但是細(xì)胞發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)對(duì)苯二酚的耐受性比較低(劉春巧等，催化學(xué)報(bào)，2006,27:361-364)。fanayama等利用枯草桿菌ifo14140在30℃振蕩培養(yǎng)4h，在37℃有氧培養(yǎng)120h后純化得培養(yǎng)液，在醋酸緩沖液(ph5.3)加入氫醌、蔗糖和培養(yǎng)液40℃反應(yīng)90h制備α-熊果苷(jp06284896)。

葡聚糖(glucan)是由明串珠菌合成的微生物同型胞外多糖，屬于右旋吡喃葡萄糖聚合體，是一類具有安全、優(yōu)良理化特性的微生物代謝膠，可作為乳化劑、懸浮劑、凝膠劑、成膜劑、潤(rùn)滑劑等廣泛應(yīng)用于食品、石油、化工、制藥等領(lǐng)域中，和普通不具備高粘接性的葡聚糖相比，高粘接葡聚糖因其優(yōu)良的成膠性能在生物合成膠的應(yīng)用方面更具優(yōu)勢(shì)。

目前，葡聚糖的制備方法主要有發(fā)酵法和酶法，而酶法生產(chǎn)葡聚糖在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用還有很多的困難，需要進(jìn)一步研究，工業(yè)上生產(chǎn)葡聚糖的方法主要是微生物發(fā)酵法，但發(fā)酵法直接得到的葡聚糖分子量普遍在100kda以上，粘接性能較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問題，本發(fā)明利用自主篩選獲得的假腸膜明串珠菌g123，通過原料的變更和發(fā)酵條件的控制，同時(shí)制備得到高光學(xué)純度α-熊果苷和高粘接性葡聚糖。

本發(fā)明的目的在于提供一種高光學(xué)純度α-熊果苷和高粘接性葡聚糖的生產(chǎn)方法，該方法是利用一株假腸膜明串珠菌發(fā)酵，通過發(fā)酵條件的控制和底物的變更，一步發(fā)酵直接獲得α-熊果苷和葡聚糖兩種產(chǎn)品。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明利用假腸膜明串珠菌g123，保藏編號(hào)為cctccno:m2014115以蔗糖和氫醌為底物，將發(fā)酵ph調(diào)控在6.0～6.8的偏酸性范圍內(nèi)，可生產(chǎn)得到高光學(xué)純度α-熊果苷和高粘接性葡聚糖，所得到的高光學(xué)純度α-熊果苷光學(xué)純度100％，無其它構(gòu)型熊果苷生成，所述高粘接性葡聚糖的分子量在700～900da之間。

所述假腸膜明串珠菌通過種子培養(yǎng)步驟后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，包括如下步驟：

1)一級(jí)種子培養(yǎng)：以0.1～0.2％的接種量取假腸膜明串珠菌菌液接種于種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)10～12h；

2)二級(jí)種子培養(yǎng)：以1～2％的接種量從一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，培養(yǎng)10～12h；

3)發(fā)酵培養(yǎng)：將二級(jí)種子液以5～8％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始ph6.5～6.8，以20％(wt)naoh控制發(fā)酵過程中ph不低于6.0，發(fā)酵全程通空氣，控制空氣流量為0.1～0.3vvm，加入0.1～0.3％消泡劑，37℃，250～300rpm，培養(yǎng)12～16h。

所述種子培養(yǎng)基為：蛋白胨3～10g/l、酵母粉3～10g/l、乙酸鈉3～10g/l、吐溫-800.5～5ml/l、c6h5o7(nh4)31～5g/l、k2hpo4·7h2o1～5g/l、煙酸0.5～2g/l、mgso4·7h2o0.1～1g/l、mnso4·h2o0.01～1g/l、cacl20.01～1g/l、fecl20.01～1g/l、nacl0.01～1g/l、5～20g/l濃度蔗糖溶液?jiǎn)为?dú)滅菌補(bǔ)加。

所述種子培養(yǎng)基優(yōu)選為：蛋白胨4～8g/l、酵母粉4～8g/l、乙酸鈉4～8g/l、吐溫-801～2ml/l、c6h5o7(nh4)32～3g/l、k2hpo4·7h2o2～3g/l、煙酸1～2g/l、mgso4·7h2o0.2～0.4g/l、mnso4·h2o0.05～0.08g/l、cacl20.02～0.06g/l、fecl20.01～0.02g/l、nacl0.01～0.02g/l、10～12g/l濃度蔗糖溶液?jiǎn)为?dú)滅菌補(bǔ)加。

所述種子培養(yǎng)基最優(yōu)為：蛋白胨5.0g/l、酵母粉5.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、吐溫-801ml/l、c6h5o7(nh4)32.0g/l、k2hpo4·7h2o2.0g/l、煙酸1.0g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、mnso4·h2o0.05g/l、cacl20.02g/l、fecl20.01g/l、nacl0.01g/l、10g/l濃度蔗糖溶液?jiǎn)为?dú)滅菌補(bǔ)加。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：蛋白胨3～10g/l、酵母粉3～10g/l、乙酸鈉3～10g/l、吐溫-800.5～5ml/l、c6h5o7(nh4)31～5g/l、k2hpo4·7h2o1～5g/l、煙酸0.5～5g/l、mgso4·7h2o0.1～1g/l、mnso4·h2o0.01～1g/l、cacl20.01～1g/l、fecl20.005～1g/l、nacl0.005～1g/l、glu0.1～3g/l、val0.1～0.3g/l、5～40g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，30～180g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為：蛋白胨4～8g/l、酵母粉4～8g/l、乙酸鈉4～8g/l、吐溫-801～2ml/l、c6h5o7(nh4)32～3g/l、k2hpo4·7h2o2～3g/l、煙酸1～2g/l、mgso4·7h2o0.2～0.4g/l、mnso4·h2o0.05～0.08g/l、cacl20.02～0.05g/l、fecl20.01～0.05g/l、nacl0.01～0.05g/l、glu0.1～1g/l、val0.1～0.2g/l、10～35g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，80～160g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)為蛋白胨5.0g/l、酵母粉5.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、吐溫-801ml/l、c6h5o7(nh4)32.0g/l、k2hpo4·7h2o2.0g/l、煙酸1.0g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、mnso4·h2o0.05g/l、cacl20.02g/l、fecl20.01g/l、nacl0.01g/l、glu0.35g/l、val0.115g/l、15～30g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，90～150g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。

有益效果：本發(fā)明所述高光學(xué)純度的α-熊果苷和高粘接性葡聚糖通過菌株發(fā)酵直接獲得，不需要通過先制備酶后進(jìn)一步酶轉(zhuǎn)化或酶分解獲得，生產(chǎn)過程中底物利用率高，α-熊果苷相對(duì)氫醌的收率在60～80％，葡聚糖收率相對(duì)與蔗糖質(zhì)量40％左右，且該葡聚糖溶液粘接性強(qiáng)，具備較高的成膠性能，若用作凝膠劑，該葡聚糖濃度在0.05％～0.3％就能形成膠體，節(jié)約了在食品中的添加量，是一種性能優(yōu)良的微生物代謝膠，具有廣泛的應(yīng)用前景，本發(fā)明所述的方法簡(jiǎn)單快捷、反應(yīng)條件溫和、耗能少、得率高、適用于實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。

附圖說明

圖1為以葡聚糖的飛行質(zhì)樸分析圖譜表示的假腸膜明串珠菌g123發(fā)酵結(jié)果；其中發(fā)酵條件為：以初始ph6.5，發(fā)酵全程控制ph不低于6.0，15g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，90g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次，37℃的3l發(fā)酵罐。

圖2為假腸膜明串珠菌g123對(duì)氫醌的平板沖擊實(shí)驗(yàn)圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所描述的本發(fā)明。

本發(fā)明使用的假腸膜明串珠菌(leuconostocpseudomesenteroides)菌株：由所在聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室在中國(guó)專利局或國(guó)際專利組織承認(rèn)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行了專利程序保藏，該菌株的保藏編號(hào)為：cctccno：m2014115。

實(shí)施例1

假腸膜明串珠菌(leuconostocpseudomesenteroides)g123采用3l發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量2l，發(fā)酵條件為初始ph6.5，發(fā)酵全程控制ph為6.0～6.8，15g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，90g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次，具體包括如下步驟：

(1)種子液培養(yǎng)：

一級(jí)種子培養(yǎng)：以0.1～0.2％的接種量取甘油保存管中的假腸膜明串珠菌菌液接種于種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)11h；

二級(jí)種子培養(yǎng)：以1～2％的接種量從一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，培養(yǎng)11h；

所述種子培養(yǎng)基為：蛋白胨5.0g/l、酵母粉5.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、吐溫-801ml/l、c6h5o7(nh4)32.0g/l、k2hpo4·7h2o2.0g/l、煙酸1.0g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、mnso4·h2o0.05g/l、cacl20.02g/l、fecl20.01g/l、nacl0.01g/l、10g/l濃度蔗糖溶液?jiǎn)为?dú)滅菌補(bǔ)加。

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：

將二級(jí)種子液以5～8％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始ph6.5～6.8，以20％(wt)naoh控制發(fā)酵過程中ph為6.0～6.8，發(fā)酵全程通空氣，控制空氣流量為0.1～0.3vvm，加入0.1～0.3％消泡劑，37℃，250～300rpm，15g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，90g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：蛋白胨5.0g/l、酵母粉5.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、吐溫-801ml/l、c6h5o7(nh4)32.0g/l、k2hpo4·7h2o2.0g/l、煙酸1.0g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、mnso4·h2o0.05g/l、cacl20.02g/l、fecl20.01g/l、nacl0.01g/l、glu0.35g/l、val0.115g/l、15g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，90g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。

發(fā)酵12h后通過hplc檢測(cè)發(fā)酵液中的蔗糖、氫醌、α-熊果苷含量，通過恒重法檢測(cè)各時(shí)間段發(fā)酵液中葡聚糖的含量，發(fā)酵結(jié)果如表1所示。

在本實(shí)施例中，發(fā)酵12h時(shí)大部分的氫醌被轉(zhuǎn)化為熊果苷，部分蔗糖被轉(zhuǎn)化為葡聚糖。該葡聚糖的分子量通過質(zhì)譜分析，如圖1所示，分子量在700～900da。

表1假腸膜明串珠菌g123采用蔗糖和氫醌為原料的發(fā)酵結(jié)果

實(shí)施例2

假腸膜明串珠菌g123采用3l發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量2l，發(fā)酵條件為初始ph6.5，發(fā)酵全程控制ph為6.0～6.8，30g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，150g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次，具體包括如下步驟：

(1)種子液培養(yǎng)：

一級(jí)種子培養(yǎng)：以0.1～0.2％的接種量取甘油保存管中的假腸膜明串珠菌菌液接種于種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)10h；

二級(jí)種子培養(yǎng)：以1～2％的接種量從一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，培養(yǎng)10h；

所述種子培養(yǎng)基為：蛋白胨4.0g/l、酵母粉4.0g/l、乙酸鈉4.0g/l、吐溫-802ml/l、c6h5o7(nh4)33.0g/l、k2hpo4·7h2o3.0g/l、煙酸2.0g/l、mgso4·7h2o0.4g/l、mnso4·h2o0.8g/l、cacl20.06g/l、fecl20.02g/l、nacl0.02g/l、12g/l濃度蔗糖溶液?jiǎn)为?dú)滅菌補(bǔ)加。

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：

將二級(jí)種子液以5～8％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始ph6.5～6.8，以10％(wt)naoh控制發(fā)酵過程中ph為6.0～6.8，發(fā)酵全程通空氣，控制空氣流量為0.1～0.3vvm，加入0.1～0.3％消泡劑，37℃，250～300rpm，30g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，150g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：蛋白胨4.0g/l、酵母粉4.0g/l、乙酸鈉4.0g/l、吐溫-802ml/l、c6h5o7(nh4)33.0g/l、k2hpo4·7h2o3.0g/l、煙酸2.0g/l、mgso4·7h2o0.4g/l、mnso4·h2o0.08g/l、cacl20.05g/l、fecl20.05g/l、nacl0.05g/l、glu1g/l、val0.2g/l、30g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，150g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。發(fā)酵16h。

實(shí)施例3

假腸膜明串珠菌g123采用3l發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量2l，發(fā)酵條件為初始ph6.5，發(fā)酵全程控制ph為6.0～6.8，10g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，80g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次，具體包括如下步驟：

(1)種子液培養(yǎng)：

一級(jí)種子培養(yǎng)：以0.1～0.2％的接種量取甘油保存管中的假腸膜明串珠菌菌液接種于種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)12h；

二級(jí)種子培養(yǎng)：以1～2％的接種量從一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，培養(yǎng)12h；

所述種子培養(yǎng)基為：蛋白胨8.0g/l、酵母粉8.0g/l、乙酸鈉8.0g/l、吐溫-805ml/l、c6h5o7(nh4)35.0g/l、k2hpo4·7h2o5.0g/l、煙酸1.5g/l、mgso4·7h2o1g/l、mnso4·h2o1g/l、cacl21g/l、fecl21g/l、nacl1g/l、20g/l濃度蔗糖溶液?jiǎn)为?dú)滅菌補(bǔ)加。

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：

將二級(jí)種子液以5～8％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始ph6.5～6.8，以20％(wt)na2co3控制發(fā)酵過程中ph為6.0～6.8，發(fā)酵全程通空氣，控制空氣流量為0.1～0.3vvm，加入0.1～0.3％消泡劑，37℃，250～300rpm，10g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，80g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：蛋白胨8.0g/l、酵母粉8.0g/l、乙酸鈉8.0g/l、吐溫-805ml/l、c6h5o7(nh4)35.0g/l、k2hpo4·7h2o5.0g/l、煙酸5.0g/l、mgso4·7h2o1g/l、mnso4·h2o1g/l、cacl21g/l、fecl21g/l、nacl1g/l、glu3g/l、val0.1g/l、10g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，80g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。發(fā)酵13h。

實(shí)施例4

假腸膜明串珠菌g123采用3l發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量2l，發(fā)酵條件為初始ph6.5，發(fā)酵全程控制ph為6.0～6.8，40g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，160g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次，具體包括如下步驟：

(1)種子液培養(yǎng)：

一級(jí)種子培養(yǎng)：以0.1～0.2％的接種量取甘油保存管中的假腸膜明串珠菌菌液接種于種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)12h；

二級(jí)種子培養(yǎng)：以1～2％的接種量從一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，培養(yǎng)12h；

所述種子培養(yǎng)基為：蛋白胨3.0g/l、酵母粉3.0g/l、乙酸鈉3.0g/l、吐溫-800.5ml/l、c6h5o7(nh4)31.0g/l、k2hpo4·7h2o1.0g/l、煙酸0.5g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、mnso4·h2o0.01g/l、cacl20.01g/l、fecl20.01g/l、nacl0.01g/l、5g/l濃度蔗糖溶液?jiǎn)为?dú)滅菌補(bǔ)加。

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：

將二級(jí)種子液以5～8％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始ph6.5～6.8，以10％(wt)naoh控制發(fā)酵過程中ph為6.0～6.8，發(fā)酵全程通空氣，控制空氣流量為0.1～0.3vvm，加入0.1～0.3％消泡劑，37℃，250～300rpm，40g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，160g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：蛋白胨3.0g/l、酵母粉3.0g/l、乙酸鈉3.0g/l、吐溫-800.5ml/l、c6h5o7(nh4)31.0g/l、k2hpo4·7h2o1.0g/l、煙酸0.5g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、mnso4·h2o0.01g/l、cacl20.01g/l、fecl20.005g/l、nacl0.005g/l、glu0.1g/l、val0.1g/l、40g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，160g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。發(fā)酵14h。

實(shí)施例5

假腸膜明串珠菌g123采用3l發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量2l，發(fā)酵條件為初始ph6.5，發(fā)酵全程控制ph為6.0～6.8，35g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，30g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次，具體包括如下步驟：

(1)種子液培養(yǎng)：

一級(jí)種子培養(yǎng)：以0.1～0.2％的接種量取甘油保存管中的假腸膜明串珠菌菌液接種于種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)12h；

二級(jí)種子培養(yǎng)：以1～2％的接種量從一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，培養(yǎng)12h；

所述種子培養(yǎng)基為：蛋白胨10.0g/l、酵母粉10.0g/l、乙酸鈉10.0g/l、吐溫-801ml/l、c6h5o7(nh4)32.0g/l、k2hpo4·7h2o2.0g/l、煙酸1.0g/l、mgso4·7h2o0.3g/l、mnso4·h2o0.1g/l、cacl20.1g/l、fecl20.1g/l、nacl0.1g/l、8g/l濃度蔗糖溶液?jiǎn)为?dú)滅菌補(bǔ)加。

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：

將二級(jí)種子液以5～8％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始ph6.5～6.8，以20％(wt)naoh控制發(fā)酵過程中ph為6.0～6.8，發(fā)酵全程通空氣，控制空氣流量為0.1～0.3vvm，加入0.1～0.3％消泡劑，37℃，250～300rpm，35g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，30g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：蛋白胨10.0g/l、酵母粉10.0g/l、乙酸鈉10.0g/l、吐溫-801ml/l、c6h5o7(nh4)32.0g/l、k2hpo4·7h2o2.0g/l、煙酸1.0g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、mnso4·h2o0.05g/l、cacl20.02g/l、fecl20.01g/l、nacl0.01g/l、glu0.5g/l、val0.3g/l、35g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，30g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。發(fā)酵15h。

實(shí)施例6

假腸膜明串珠菌g123采用3l發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量2l，發(fā)酵條件為初始ph6.5，發(fā)酵全程控制ph為6.0～6.8，5g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，180g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次，具體包括如下步驟：

(1)種子液培養(yǎng)：

一級(jí)種子培養(yǎng)：以0.1～0.2％的接種量取甘油保存管中的假腸膜明串珠菌菌液接種于種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)12h；

二級(jí)種子培養(yǎng)：以1～2％的接種量從一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，培養(yǎng)12h；

所述種子培養(yǎng)基為：蛋白胨5.0g/l、酵母粉5.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、吐溫-801ml/l、c6h5o7(nh4)32.0g/l、k2hpo4·7h2o2.0g/l、煙酸1.0g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、mnso4·h2o0.05g/l、cacl20.02g/l、fecl20.01g/l、nacl0.01g/l、10g/l濃度蔗糖溶液?jiǎn)为?dú)滅菌補(bǔ)加。

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：

將二級(jí)種子液以5～8％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始ph6.5～6.8，以20％(wt)naoh控制發(fā)酵過程中ph為6.0～6.8，發(fā)酵全程通空氣，控制空氣流量為0.1～0.3vvm，加入0.1～0.3％消泡劑，37℃，250～300rpm，5g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，180g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：蛋白胨5.0g/l、酵母粉5.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、吐溫-801ml/l、c6h5o7(nh4)32.0g/l、k2hpo4·7h2o2.0g/l、煙酸1.0g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、mnso4·h2o0.05g/l、cacl20.02g/l、fecl20.01g/l、nacl0.01g/l、glu0.35g/l、val0.115g/l、5g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，180g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次。發(fā)酵16h。

實(shí)施例7

本實(shí)施例說明假腸膜明串珠菌g123，在不同ph環(huán)境中α-熊果苷和葡聚糖的發(fā)酵結(jié)果，采用3l發(fā)酵罐發(fā)酵，裝液量2l，發(fā)酵條件為初始ph7.0，發(fā)酵全程控制ph6.0、7.0和8.0，15g/l氫醌單獨(dú)滅菌分10次補(bǔ)加，90g/l蔗糖單獨(dú)滅菌與氫醌同時(shí)補(bǔ)加，分10次，種子液培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)條件與實(shí)施例1相同，發(fā)酵12h結(jié)果見表2。

本實(shí)施例中，假腸膜明串珠菌g123隨著ph的上升，氫醌和蔗糖的殘留增加，熊果苷的合成量減少，葡聚糖的合成變化不大，因此最優(yōu)條件是在偏酸性環(huán)境。

表2不同發(fā)酵ph條件對(duì)α-熊果苷和葡聚糖合成的影響

實(shí)施例8

本實(shí)施例說明假腸膜明串珠菌g123對(duì)氫醌的耐受性，結(jié)果見圖2。

本實(shí)施例中，假腸膜明串珠菌g123受不同濃度氫醌的沖擊后，隨著氫醌濃度的提高，細(xì)胞生長(zhǎng)量顯著下降，超過5/l時(shí)有明顯的抑制作用，因此為消除氫醌對(duì)細(xì)胞的毒性作用，控制氫醌濃度在1g/l以內(nèi)。