本發(fā)明涉及一種半抗原及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及一種多效唑半抗原及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多效唑(paclobutrazol)是20世紀80年代研制成功的高效低毒的三唑類植物生長調(diào)節(jié)劑?？商岣咚具胚嵋宜嵫趸傅幕钚裕档偷久鐑?nèi)源iaa的水平。明顯減弱稻苗頂端生長優(yōu)勢，促進側(cè)芽生長。多效唑的應(yīng)用價值在于它對作物生長的控制效應(yīng)，能有效提高植物觀賞品質(zhì)，抑制細菌和害蟲的滋生，提高作物產(chǎn)量和抗逆性。但多效唑的大量使用會造成土地和作物污染等問題，多效唑性質(zhì)穩(wěn)定，降解較慢,在土壤中殘留時間較長，常溫(20℃)儲存穩(wěn)定期在兩年以上，其半衰期在半年到一年左右。多效唑由于多效唑不易被生物降解，殘留期長，因此對作物多效唑含量檢測的問題亟待解決。

傳統(tǒng)對作物中多效唑的研究方法是運用色譜分析技術(shù)，但色譜技術(shù)存在檢測成本高、周期長及操作繁瑣等缺陷，不適于大規(guī)模現(xiàn)場篩查。而酶聯(lián)免疫分析技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高、特異性強、操作簡便、適宜現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣品的篩選等優(yōu)點。加大對多效唑酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的研究開發(fā)，在農(nóng)藥殘留快速檢測中發(fā)揮著重要的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種多效唑半抗原及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個方面是提供一種多效唑半抗原，其分子結(jié)構(gòu)式如(1)所示：

本發(fā)明的第二個方面是提供一種如本發(fā)明第一個方面所述的多效唑半抗原的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，取1,2,4-三氮唑，加無水碳酸鉀、乙醇，60℃反應(yīng)完全，純化，得到3,3-二甲基-1-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-2-丁酮，其分子結(jié)構(gòu)式如式(2)所示，其中1,2,4-三氮唑和無水碳酸鉀的用量比為：8.4g︰15-20g(優(yōu)選為8.4g︰17-19g，更優(yōu)選為：8.4g︰18.4g)；

步驟2，取3,3-二甲基-1-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-2-丁酮溶于無水dmf中，取nah溶于無水dmf中，將3,3-二甲基-1-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-2-丁酮的dmf溶液逐滴加入到nah的dmf溶液中，反應(yīng)完全冷卻后，加4-硝基氯化芐溶于無水dmf溶液，并逐滴將4-硝基氯化芐的dmf溶液滴加到反應(yīng)液中，反應(yīng)完全，純化，得產(chǎn)物4,4-二甲基-1-(4’-硝基苯基)-2-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-3-戊酮，其分子結(jié)構(gòu)式如式(3)所示，其中3,3-二甲基-1-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-2-丁酮、nah、4-硝基氯化芐的用量比為：3.38g︰0.4-0.6g︰3-4g(優(yōu)選為3.38g︰0.45-0.55g︰3.2-3.6g，更優(yōu)選為：3.38g︰0.5g︰3.4316g)；

步驟3，取產(chǎn)物4,4-二甲基-1-(4’-硝基苯基)-2-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-3-戊酮和nabh4溶于甲醇中，室溫反應(yīng)完全，純化，得產(chǎn)物4,4-二甲基-1-(4’-硝基苯基)-2-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-3-戊醇，其分子結(jié)構(gòu)式如式(4)所示，其中4,4-二甲基-1-(4’-硝基苯基)-2-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-3-戊酮和nabh4的用量比為：0.923g︰0.16-0.2g(優(yōu)選為0.923g︰0.18-0.19g，更優(yōu)選為：0.923g︰0.185g)；

步驟4，取4,4-二甲基-1-(4’-硝基苯基)-2-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-3-戊醇，加最小量乙酸至完全溶解，然后分批慢慢加入4-6個當量的fe粉，約0.8-1.5h加完，反應(yīng)完全，純化，得產(chǎn)物4,4-二甲基-1-(4’-氨基苯基)-2-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-3-戊醇，其分子結(jié)構(gòu)式如式(5)所示；

步驟5，取4,4-二甲基-1-(4’-氨基苯基)-2-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-3-戊醇，加ch2ch2、丁二酸酐、三乙胺，室溫攪拌反應(yīng)完全，純化，得到權(quán)利要求1所述的多效唑半抗原，其中4,4-二甲基-1-(4’-氨基苯基)-2-(1’,2’,4’-三氮唑-1-基)-3-戊醇、ch2ch2、丁二酸酐、三乙胺的用量比為：1.2mmol︰4-6ml︰2.5-3.5mmol︰1.5-2.5mmol(優(yōu)選為1.2mmol︰4.5-5.5ml︰2.8-3.2mmol︰1.8-2.2mmol，更優(yōu)選為：1.2mmol︰5ml︰3mmol︰2mmol)。

本發(fā)明的第三個方面是提供一種多效唑抗原，由本發(fā)明第一個方面所述的多效唑半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，其分子結(jié)構(gòu)式如式(6)所示：

本發(fā)明的第四個方面是提供一種制備如本發(fā)明第三個方面所述的多效唑抗原的方法，包括以下步驟：步驟a，取權(quán)利要求1所述的多效唑半抗原，加入無水二甲基甲酰胺混勻后，加入二環(huán)己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應(yīng)過夜，其中，多效唑半抗原、二環(huán)己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的用量比為：0.09mmol︰0.08-0.12mmol︰0.08-0.12mmol；步驟b，離心，取溶液，將溶液緩慢加入載體蛋白溶液中，所用載體蛋白的量按照半抗原與載體蛋白的摩爾比15-60︰1計；步驟c，反應(yīng)完全后，透析，得到多效唑抗原。

優(yōu)選地，上述步驟a中，多殺菌素半抗原、二環(huán)己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的用量比為：0.09mmol︰0.1mmol︰0.1mmol。

本發(fā)明的第五個方面是提供一種多效唑抗體，由本發(fā)明第三個方面所述的多效唑抗原免疫動物制備得到。

本發(fā)明的第六個方面是提供由本發(fā)明第五個方面所述的多效唑抗體制備的多效唑酶聯(lián)免疫試劑盒。

本發(fā)明的第七個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的多效唑半抗原或本發(fā)明第三個方面所述的多效唑抗原在制備多效唑抗體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第八個方面是提供本發(fā)明第五個方面所述的多效唑抗體或本發(fā)明第六個方面所述的多效唑酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測土壤水體和水果食品中多效唑殘留的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的多效唑半抗原既最大程度地保留了多效唑的化學結(jié)構(gòu)，又通過化學合成改造引入了可以與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的-cooh，合成方法簡單，純度、產(chǎn)率較高；用該半抗原作為原料，制備適于動物免疫的抗原體系免疫動物，所得抗體的效價、特異性、親和力都比較好；所得的抗體用于酶聯(lián)免疫試劑盒，使用方便、檢測成本低、檢測方法高效、準確、快速、可同時檢測大批量的樣本，適于土壤水體和水果食品中多效唑殘留的現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。本發(fā)明的多效唑半抗原在多效唑的檢測中發(fā)揮重要作用。

附圖說明

圖1為多效唑半抗原合成路線圖。

圖2為多效唑半抗原核磁共振碳譜圖。

圖3為多效唑半抗原核磁共振氫譜圖。

圖4為多效唑間接elisa標準曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1：多效唑半抗原的合成

步驟1：

1、稱取8.4g的1,2,4-三氮唑(0.12mol)，18.4g無水碳酸鉀，放入圓底燒瓶中，加50ml乙醇，用控溫磁力攪拌器，設(shè)定溫度為60℃，油浴加熱，將15.67ml(0.12mol)的1-氯頻哪酮在30min-1h之內(nèi)滴入圓底燒瓶內(nèi)，繼續(xù)攪拌3h，薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)完全，此過程的最適展開劑為乙酸乙酯︰正己烷＝1︰1。

2、反應(yīng)體系出現(xiàn)黃色溶液和白色固體沉淀，將黃色液體倒入另一圓底燒瓶內(nèi)，旋干(目的是分離乙醇和反應(yīng)產(chǎn)物)。加水25ml于含白色沉淀的圓底燒瓶中，充分溶解后轉(zhuǎn)入燒杯中，再加25的水沖洗兩次，倒入燒杯，搖勻，使白色沉淀完全溶解，倒入分液漏斗內(nèi)，用100ml的etoac沖洗兩次，倒入分液漏斗內(nèi)，搖5min，靜置10min，取上層，棄下層。將旋干產(chǎn)物溶于50ml水后倒入分液漏斗，用50ml的etoac沖洗兩次，倒入分液漏斗，取上層。將萃取產(chǎn)物混合置于三角燒瓶中，加無水na2so4干燥。

3、將三角瓶中液體倒入圓底燒瓶中，用etoac沖洗無水na2so4兩次，旋干。將產(chǎn)物重結(jié)晶分離，將產(chǎn)物加適量正己烷加熱至全部溶解，4℃靜置，旋干，得到上層白色，下層黃色的沉淀。

步驟2：

1、取步驟1的白色反應(yīng)產(chǎn)物3.38g(20mmol)溶于10ml的無水dmf中，稱取0.5gnah溶于10ml無水dmf中，將白色產(chǎn)物的dmf溶液逐滴加入到nah的dmf溶液中(30min)，攪拌3h，冰浴冷卻15min。

2、稱取3.4316g(20mmol)4-硝基氯化芐溶于10ml的無水dmf溶液，并逐滴將4-硝基氯化芐的無水dmf溶液滴加到冷卻的nah的dmf溶液中，室溫攪拌3h至過夜。薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)，此過程的最適展開劑為乙酸乙酯︰正己烷＝1︰1。

3、加300ml水于反應(yīng)體系中，搖勻，靜置，過濾。將沉淀溶于最少量的乙酸乙酯︰正己烷＝1︰1的體系中，加熱，搖勻至全部溶解，冷卻結(jié)晶。棄上層液體，重復(fù)結(jié)晶(tlc監(jiān)控反應(yīng)，至無雜質(zhì)為至。)在沉淀中加入適量的甲醇(約10ml)，加熱搖至溶解，靜置得到白色固體沉淀。

步驟3：

1、取步驟2的產(chǎn)物0.923(3.046mmol)和nabh4(185mg，4.89mmol)溶于40ml的甲醇中，室溫攪拌2.5h。薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)，此過程的最適展開劑為乙酸乙酯︰正己烷＝1︰1。

2、加5ml的水，50etoac萃取產(chǎn)物。加無水na2so4干燥，旋干，用甲醇重結(jié)晶。(逐滴滴加至溶解，4℃冷卻)

步驟4：

1、稱取步驟3的產(chǎn)物約0.445g，在45℃水浴下，加最小量乙酸至完全溶解。5個當量的fe粉分批加入，約1h加完。反應(yīng)約4h。薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)，此過程的最適展開劑為乙酸乙酯︰正己烷＝6︰4。

2、反應(yīng)溶液用抽濾漏斗墊濾紙除去沉淀，用乙醇沖洗。收集溶液，調(diào)ph-9(飽和nahco3調(diào))。etoac浸泡濾紙，收集合并溶液。etoac萃取，旋干。用飽和nacl再次萃取，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干(水浴溫度為40℃，轉(zhuǎn)數(shù)60)。然后薄層色譜法分離產(chǎn)物，展開劑為乙酸乙酯︰正己烷＝6︰4，收集產(chǎn)物，得產(chǎn)物0.1605g。

步驟5：

1、取步驟4的反應(yīng)產(chǎn)物1.2mmol(328mg)，加5mlch2ch2、3mmol(300mg)丁二酸酐、2mmol(278微升)三乙胺。室溫攪拌反應(yīng)，薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)，此過程的最適展開劑為乙酸乙酯︰石油醚＝7︰3。

2、產(chǎn)物萃取(etoac50ml+30ml飽和nh4cl)，加無水na2so4干燥，旋干。薄層色譜法分離產(chǎn)物，展開劑為二氯甲烷︰甲醇＝9︰1，收集產(chǎn)物，得產(chǎn)物約150mg。

實施例2：多效唑半抗原的鑒定

上述實施例1步驟5的產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜和碳譜測定，核磁共振數(shù)據(jù)如下，說明半抗原合成成功：

1hnmr(500mhz,cd3od)δ8.55(s,1h),7.85(s,1h),7.40(d,j＝8.4hz,2h),7.01(d,j＝8.4hz,2h),4.86–4.80(m,1h),3.66(s,1h),3.51(d,j＝1.1hz,1h),3.20(ddd,j＝20.2,13.8,7.9hz,2h),2.67–2.60(m,4h),0.69(s,9h).

13cnmr(126mhz,cd3od)δ176.30(s),172.71(s),150.33(s),145.33(s),138.59(s),134.23(s),130.33(s),121.08(s),78.81(s),64.39(s),41.26(s),36.06(s),32.29(s),29.97(s),26.29(s).

實施例3：多效唑抗原

向0.09mmol所述琥珀酰胺基多效唑半抗原中加入0.6ml的無水dmf，混勻后，加入0.1mmol的dcc和0.1mmol的nhs活化半抗原上的羧基基團，攪拌反應(yīng)過夜后，離心去沉淀，將溶液平均分為三份，分別逐滴加入到不同的載體蛋白溶液中，所述載體蛋白為bsa，ova，klh等，所述溶解蛋白的緩沖液為碳酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液，所用蛋白的量按照半抗原與蛋白的摩爾比15-60︰1計算。待羧基活化的半抗原與蛋白分子上的氨基偶聯(lián)反應(yīng)過夜后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到半透膜中，使用10mm的ph7.2的pbs緩沖液于4℃透析3-5天，得到包被原，經(jīng)紫外鑒定，多效唑半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。將透析完畢的溶液按照所用載體蛋白的量用pbs稀釋成1mg/ml。

實施例4：抗血清制備

將1mg/ml的多效唑-klh作為免疫原與等體積的弗氏佐劑混合攪拌乳化，首次免疫用弗氏完全佐劑，以后免疫使用弗氏不完全佐劑，每間隔10至15天對小鼠免疫一次，第三次免疫后小鼠眼眶采血檢測血清效價和抗體特異性。

實施例5：血清效價及抗體特異性檢測

將1mg/ml的多效唑-ova包被原使用碳酸鹽緩沖液稀釋合適的倍數(shù)后，加入到96孔酶標板中于37℃包被3小時，將多效唑標準品使用樣品稀釋液(pbs中含有0.1％的吐溫20和明膠)稀釋后，每孔加入50ul，以樣品稀釋液作為非抑制孔對照，隨后加入經(jīng)過樣品稀釋液稀釋合適倍數(shù)的血清，于37℃溫浴30min后，洗脫，再加入羊抗鼠酶標二抗反應(yīng)30min，洗脫酶標二抗后，加入含有opd或tmb的底物緩沖液顯色5-10min，于酶標儀檢測od值。

本發(fā)明以多效唑-ova作為包被原，多效唑-klh作為免疫原所獲得的抗血清，所建立的elisa標準曲線如圖4所示，抑制中濃度為786ng/ml。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。