本發(fā)明涉及設(shè)計微流控芯片領(lǐng)域，尤其涉及一種用于細(xì)胞藥物濃度梯度生成器。
背景技術(shù)：
：：藥物篩選，作為新藥研究的最初過程和關(guān)鍵步驟，是從天然或合成的化合物中篩選出高效的新藥或先導(dǎo)化合物，對可能作為藥物使用的物質(zhì)進(jìn)行生物活性、藥理作用及藥用價值的評估過程[1]。隨著細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，其具有的微量化、超高通量化的優(yōu)點，使其為基于細(xì)胞水平的高通量新藥篩選提供了途徑[2]?；诩?xì)胞模型的高通量篩選，能夠在群體細(xì)胞水平或單細(xì)胞水平[3]，通過單次實驗，監(jiān)測和定量分析多種細(xì)胞事件，為藥物的初步篩選提供可靠信息。傳統(tǒng)高通量篩選利用光學(xué)儀器，在微量滴定板小孔內(nèi)分析群體細(xì)胞的熒光信號。這類方法需要繁瑣的樣品預(yù)處理過程和機(jī)械化的溶液交換操作，且成本昂貴，不能適應(yīng)大規(guī)模樣品的同時篩選[4]。微流控芯片憑借其樣品及試劑消耗少、分析速度快、效率高、操作模式靈活多變、集成化優(yōu)勢明顯等特點，為細(xì)胞水平高通量藥物篩選提供了一個優(yōu)秀的實驗技術(shù)平臺[5]。濃度梯度微流控芯片由于可以在內(nèi)部建立起穩(wěn)定的濃度梯度，且可以與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，因此越來越受到關(guān)注，被廣泛地用于細(xì)胞水平的藥物篩選[6]。最經(jīng)典的微流體濃度梯度生成器是在2000年由Whiteside課題組提出的“圣誕樹”模型[7]，該模型基于控制低雷諾數(shù)層流流動的溶液的擴(kuò)散混合，從而在微流體通道網(wǎng)絡(luò)中形成組分梯度。基于該模型的微流體梯度生成器一直沿用至今。Wang等人[8]構(gòu)建了單個微流體裝置用于生成了氧氣和藥物的濃度梯度，并用于研究腫瘤細(xì)胞-藥物在動態(tài)缺氧微環(huán)境下的相互作用?；谠撗b置，成功地進(jìn)行了低氧腫瘤細(xì)胞治療的靶向生物學(xué)研究，以及研究了低氧特異性和常氧依賴性抗腫瘤藥物對不同類型的腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用。類似地，Chang等人[9]開發(fā)了一種PDMS-PC材料結(jié)合的氧氣和藥物濃度梯度生成器微流體芯片，并基于該裝置演示了基于細(xì)胞的藥物測試以及細(xì)胞遷移實驗。Xu等人[10]開發(fā)了一種新型的具有穩(wěn)定濃度梯度的微流體平臺進(jìn)行芯片上細(xì)胞培養(yǎng)與篩選測定。該芯片在梯度生成器的基礎(chǔ)上，將靜態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域與動態(tài)的細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)供給結(jié)構(gòu)相結(jié)合，細(xì)胞可以穩(wěn)定地與外部液體環(huán)境發(fā)生交換。Hong等人[11]設(shè)計制備了基于紙張的濃度梯度發(fā)生器，通過紙纖維內(nèi)的擴(kuò)散和混合產(chǎn)生藥物阿霉素的梯度濃度，并結(jié)合3D細(xì)胞培養(yǎng)陣列，用于監(jiān)測藥物阿霉素對腫瘤細(xì)胞的毒性反應(yīng)，降低了分析成本。此外，同樣地基于擴(kuò)散混合的原理，許多新穎的微流體濃度梯度生成器被報道。Wu等人[12]開發(fā)了一種簡單且通用的微流體細(xì)胞密度梯度生成器用量子點細(xì)胞毒性測定。該微流體密度梯度發(fā)生器由八個平行通道構(gòu)成，每個通道分別含有1-8個微孔，細(xì)胞通過重力落入微孔中，細(xì)胞密度取決于微孔數(shù)。Kilinc等人[13]構(gòu)建了一種微流體雙梯度發(fā)生器，進(jìn)行基于細(xì)胞的藥物組合測定。該發(fā)生器能夠產(chǎn)生彼此正交地對準(zhǔn)的多種溶質(zhì)的線性濃度梯度，能夠?qū)M合藥物對細(xì)胞的作用效果進(jìn)行監(jiān)測。為了研究細(xì)胞梯度的主動控制對生物系統(tǒng)和組織重建的影響。Li等人[14]提出了一種由多個細(xì)胞梯度組裝而成的三維微流體通道。將同源細(xì)胞懸浮液裝載到3D階梯形PDMS微通道中，在10分鐘內(nèi)通過沉降以產(chǎn)生細(xì)胞梯度。細(xì)胞梯度可以通過精確控制制造過程中每層的高度來實現(xiàn)。Li等人[15]還開發(fā)了一種多功能梯度發(fā)生器的微流體裝置用于高通量的單細(xì)胞多藥耐藥性分析。梯度曲線可以由分配微通道的長度確定，而不受流速和壓力的影響，且具有良好的穩(wěn)定性以及能顯著減少冗余的微流體通道結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定的微流體濃度梯度生成器為細(xì)胞在不通藥物濃度下的篩選，提供重要的保障，經(jīng)典的基于“圣誕樹”結(jié)構(gòu)的濃度梯度生成器在許多研究中被采用，然而此類型的生成器對液體流速有較高的要求(通常在1μl/min左右最佳，速度越快產(chǎn)生的梯度效果越差)，這無疑限制了藥物篩選的效率，而且無法探究藥物流速對細(xì)胞作用的影響，復(fù)雜的微通道結(jié)構(gòu)也會造成試劑殘留；其他多數(shù)新穎的梯度生成器設(shè)計方案基本都是基于液體之間的混合擴(kuò)散原理，且無不需要精密的制備技術(shù)、操作技術(shù)，受流體速度的影響極大。經(jīng)典的“圣誕樹”濃度梯度生成模型[7]，基于分流的形式形成濃度梯度，將不同濃度的液體進(jìn)行組合，充分混合后再分流，最后在下游管道，形成濃度梯度。因為濃度的數(shù)量＝層數(shù)+2，如要得到不同的濃度，所需要的層數(shù)將會很多，這樣會導(dǎo)致芯片通道冗長、結(jié)構(gòu)復(fù)雜。如此使得其擴(kuò)展能力較差，難以實現(xiàn)高通量的生物分析。此外，流速對濃度梯度的穩(wěn)定性影響巨大(流速在0.001m/s-0.01m/s時能夠形成良好的梯度，當(dāng)流速大于0.01m/s時，梯度顯著變化)，只適用于超低速下的細(xì)胞分析。因此有必要開發(fā)一種結(jié)構(gòu)簡單，梯度產(chǎn)生受速度影響小，且易于同時產(chǎn)生多種穩(wěn)定梯度的微流體濃度梯度生成器用于細(xì)胞的藥物篩選過程。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種微流體細(xì)胞藥物濃度梯度生成器。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種微流體細(xì)胞藥物濃度梯度生成器，包括多組進(jìn)液孔；每組進(jìn)液孔包括兩個通過第一微通道連通的進(jìn)液孔；所述第一微通道與第二微通道連通；其中至少兩根第一微通道豎直設(shè)置，且與該兩根第一微通道連通的兩根第二微通道水平設(shè)置并連通后，形成公共微通道，該兩根第一微通道各與一根折彎微通道連通；其余的第一微通道水平設(shè)置，與這些第一微通道連通的第二微通道均與所述公共微通道連通；所述公共微通道與多根微混合通道連通；所有的微混合通道、折彎微通道均各與一個腔室連通。所述進(jìn)液孔數(shù)量為8個；利用4組進(jìn)液孔，基于分流的形式形成濃度梯度，將不同濃度的液體進(jìn)行組合，充分混合后再分流，最后在下游管道，形成濃度梯度。比傳統(tǒng)的依靠擴(kuò)散實現(xiàn)濃度梯度產(chǎn)生的設(shè)計結(jié)構(gòu)更加簡單，不受進(jìn)液速度的影響，濃度梯度生成效率高。所述微混合通道為蛇形，能夠保障層流液體充分地混合。所述第一微通道、第二微通道、微混合通道、折彎微通道橫截面寬度為50-100微米，長度為15-40微米，能夠滿足多數(shù)加工工藝的要求。第一組進(jìn)液孔的第一個進(jìn)液孔、第二組進(jìn)液孔的第一個進(jìn)液孔、第三組進(jìn)液孔的第一個進(jìn)液孔、第四組進(jìn)液孔的第一個進(jìn)液孔的進(jìn)液種類相同，能夠同時產(chǎn)生同一種混合液體的多個濃度梯度。所述微混合通道為五到八個方波周期以上，能夠保證層流液體混合均勻。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所具有的有益效果為：本發(fā)明克服了濃度梯度生成器中液體流速對濃度梯度產(chǎn)生的限制，解決了現(xiàn)有濃度生成器通道結(jié)構(gòu)復(fù)雜的缺點，同時獲得了多種穩(wěn)定的濃度梯度；將濃度梯度產(chǎn)生、細(xì)胞培養(yǎng)、藥物檢測與分析集成到一塊結(jié)構(gòu)簡單的微流體芯片上，能夠提高藥物的利用率，濃度產(chǎn)生快，提高藥物與細(xì)胞作用過程的效率，為研究腫瘤細(xì)胞在抗腫瘤藥物的多種濃度梯度下的凋亡情況，篩選目標(biāo)藥物提供了一種新型的平臺。附圖說明圖1為本發(fā)明微流體濃度梯度生成器設(shè)計示意圖。圖2為本發(fā)明微流體梯度生成器設(shè)計原理圖。圖3(a)～圖3(d)為本發(fā)明微流體濃度梯度生成器濃度分布云圖；圖3(a)進(jìn)液速度0.007m/s；圖3(b)進(jìn)液速度0.07m/s；圖3(c)進(jìn)液速度0.1m/s；圖3(d)進(jìn)液速度0.5m/s。圖4為本發(fā)明不同進(jìn)液速度情況下的濃度梯度曲線。具體實施方式如圖1，本發(fā)明實施例包括四組進(jìn)液孔；每組進(jìn)液孔包括兩個通過第一微通道11連通的進(jìn)液孔；所述第一微通道11與第二微通道12連通；其中兩根第一微通道11豎直設(shè)置，且與該兩根第一微通道連通的兩根第二微通道12水平設(shè)置并連通后，形成公共微通道13，該兩根第一微通道各與一根折彎微通道14連通；其余的第一微通道11水平設(shè)置，與這些第一微通道11連通的第二微通道均與所述公共微通道14連通；所述公共微通道14與多根微混合通道9連通；所有的微混合通道9、折彎微通道14均各與一個腔室10連通?；跀U(kuò)散混合的微流體濃度生成器主要依賴于在低雷諾數(shù)條件下，液體之間的混合擴(kuò)散的原理，所以當(dāng)速度增大，層流增強(qiáng)，擴(kuò)散減弱，產(chǎn)生的濃度梯度會大大減少。因此，為了克服該效應(yīng)，我們擬通過采用四組進(jìn)液口，按照不同的微通道長度，在速度較高的時候，搭配產(chǎn)生有序的層流，經(jīng)過充分的混合后以獲得不同的最終濃度，這種方案相比圣誕樹結(jié)構(gòu)通道設(shè)計簡單，操作簡易(如圖1)。例如，如圖2所示微通道截面，在微通道中兩種液體(藍(lán)色代表濃度為0，紅色代表濃度為1)的層流體積各占通道的50％，則完全混合好后的濃度為0.5；而若濃度為0的液體在層流中體積占30％，而濃度為1的液體在層流中體積占70％，最終的混合好的濃度應(yīng)為0.7；同理，濃度為0的液體在層流中體積占70％，而濃度為1的液體在層流中體積占30％，最終的混合好的濃度應(yīng)為0.3。因此，可按照此規(guī)律將兩種不同的液體以不同的層流體積組合好，再通過一種高效的微混合器實現(xiàn)充分混合，即可同時獲得多種穩(wěn)定的濃度。此外，在一定范圍內(nèi)，液體流速越快，越易于產(chǎn)生層流，因此，增大的流速對于濃度梯度的產(chǎn)生幾乎沒有影響，也就克服了傳統(tǒng)濃度梯度生成器只能在低雷諾數(shù)條件下適用的限制，提高了濃度梯度產(chǎn)生的效率。為了實現(xiàn)細(xì)胞在藥物的多種濃度梯度作用下的細(xì)胞狀態(tài)研究，在微混合器的末端連接了細(xì)胞培養(yǎng)室，將細(xì)胞懸液加入芯片細(xì)胞入口端，調(diào)整液面差，利用靜壓力緩慢進(jìn)樣，待細(xì)胞培養(yǎng)小室內(nèi)充滿大量細(xì)胞后，調(diào)整液面差，終止進(jìn)樣，待細(xì)胞貼壁生長，適時給芯片換液，去除細(xì)胞廢液，保持新鮮培養(yǎng)液連續(xù)灌注，使得細(xì)胞在培養(yǎng)瓶內(nèi)正常生長。隨后即可利用該梯度生成器將藥物與培養(yǎng)基注入，觀察細(xì)胞在不同濃度藥物作用下的形態(tài)變化，以篩選目標(biāo)濃度藥物。微混合通道包括至少五到八個方波周期(15)，本發(fā)明中所指的周期，是指圖1中所示的底面朝向同一側(cè)的U形的個數(shù)。為了驗證擬采取的方案的可行性，采用AutoCAD進(jìn)行微流體濃度梯度生成器的建模，通道橫截面(通道橫截面為矩形)寬度為80微米，長度為30微米，采用gambit軟件劃分均勻地六面體網(wǎng)格后，采用計算流體力學(xué)軟件fluent進(jìn)行仿真模擬，結(jié)果如圖3所示，可以觀察到明顯的梯度濃度云圖。此外，為了驗證在不同流速下的，產(chǎn)生的濃度梯度的效果，分別測試模擬速度在0.007m/s、0.07m/s、0.1m/s以及0.5m/s，(對應(yīng)體積速度為1μl/min、10μl/min、14.3μl/min以及71.4μl/min)時的濃度分布，如圖4所示，濃度梯度的線性度隨速度的增大而增強(qiáng)(接近于1)，只有當(dāng)速度極低(1μl/min)，產(chǎn)生的濃度梯度曲線的線性度稍有下降。因此，本發(fā)明克服了傳統(tǒng)的濃度梯度生成器只能在低雷諾數(shù)條件下產(chǎn)生濃度梯度的限制，提高了濃度梯度產(chǎn)生的效率，且可以在穩(wěn)定的濃度梯度下測試藥物流速等條件對細(xì)胞作用的影響。參考文獻(xiàn)1.JunweiShi,E.W.,JosephPMilazzo,ZihuaWang,JustinBKinney,ChristopherRVakoc,DiscoveryofcancerdrugtargetsbyCRISPR-Cas9screeningofproteindomains.NatureBiotechnology,2015.33:p.661-667.2.Hyun,K.-A.andH.-I.Jung,Advancesandcriticalconcernswiththemicrofluidicenrichmentsofcirculatingtumorcells.LabonaChip,2014.14(1):p.45-56.3.Lecault,V.,etal.,Microfluidicsinglecellanalysis:frompromisetopractice.CurrentOpinioninChemicalBiology,2012.16(3-4):p.381-390.4.E.ClaireMarkway,S.N.B.,AReviewoftheMethods,Interpretation,andLimitationsoftheUrineDrugScreen.Orthopedics,2011.34:p.877-881.5.Min-HsienWu,S.-B.H.,Gwo-BinLee,Microfluidiccellculturesystemsfordrugresearch.LabChip,2010.10:p.939–956.6.Folch,T.M.K.a.A.,Biomoleculargradientsincellculturesystems.LabChip,2008.8:p.34–57.7.NooLiJeon,S.K.W.D.,DanielT.Chiu,InsungS.Choi,AbrahamD.Stroock,andGeorgeM.Whitesides,GenerationofSolutionandSurfaceGradientsUsingMicrofluidicSystems.Langmuir2000.16:p.8311-8316.8.Wang,L.,etal.,Constructionofoxygenandchemicalconcentrationgradientsinasinglemicrofluidicdeviceforstudyingtumorcell-druginteractionsinadynamichypoxiamicroenvironment.LabonaChip,2013.13(4):p.695-705.9.Chang,C.-W.,etal.,Apolydimethylsiloxane-polycarbonatehybridmicrofluidicdevicecapableofgeneratingperpendicularchemicalandoxygengradientsforcellculturestudies.LabonaChip,2014.14(19):p.3762-3772.10.Xu,B.-Y.,etal.,Anovelmicrofluidicplatformwithstableconcentrationgradientforonchipcellcultureandscreeningassays.LabonaChip,2013.13(18):p.3714-3720.11.Hong,B.,etal.,Aconcentrationgradientgeneratoronapaper-basedmicrofluidicchipcoupledwithcellculturemicroarrayforhigh-throughputdrugscreening.BiomedicalMicrodevices,2016.18(1).12.Wu,J.,etal.,Asimpleandversatilemicrofluidiccelldensitygradientgeneratorforquantumdotcytotoxicityassay.LabonaChip,2013.13(10):p.1948-1954.13.Kilinc,D.,etal.,Amicrofluidicdualgradientgeneratorforconductingcell-baseddrugcombinationassays.IntegrativeBiology,2016.8(1):p.39-49.14.Li,Y.,etal.,Assemblyofmultiplecellgradientsdirectedbythree-dimensionalmicrofluidicchannels.LabonaChip,2015.15(15):p.3203-3210.15.Li,Y.,etal.,High-throughputsinglecellmultidrugresistanceanalysiswithmultifunctionalgradients-customizingmicrofluidicdevice.SensorsandActuatorsB-Chemical,2016.225:p.563-571.當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3