本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，涉及肺鱗癌的非侵入性篩查診斷，具體涉及一種用于診斷重度吸煙人群中肺鱗癌患者的非侵入性標(biāo)記物及試劑盒。

背景技術(shù)：

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，死亡率居惡性腫瘤之首。我國肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，年平均增長近2％。肺癌根據(jù)病理學(xué)特點(diǎn)的不同分為多種組織類型，肺癌組織類型不同，其治療措施也不同。根據(jù)2004版WHO分類，常見肺癌組織病理學(xué)分型分為非小細(xì)胞癌(NSCLC)和小細(xì)胞癌(SCLC)。非小細(xì)胞癌又分為鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大細(xì)胞癌(LCC)。不同肺癌臨床治療方案不同，預(yù)后效果也不同。因此，為了提高治療效果，肺癌的治療策略已經(jīng)從傳統(tǒng)的以分期為基礎(chǔ)的治療模式轉(zhuǎn)變?yōu)橐越M織學(xué)類型和基因突變?yōu)橹笇?dǎo)的個(gè)體化、精準(zhǔn)的多學(xué)科治療模式。個(gè)體化治療提高了肺癌的治療和預(yù)后效果。

通常，環(huán)境空氣質(zhì)量下降及吸煙被認(rèn)為是肺癌最主要的誘因。肺鱗癌和肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌的兩種主要組織學(xué)類型。由于它們在病理學(xué)基礎(chǔ)、臨床特征以及與吸煙關(guān)系的不同，它們的發(fā)病機(jī)理也可能不同。例如，不同的抑癌基因可能與不同組織學(xué)類型的肺癌發(fā)生有關(guān)。國外有關(guān)人認(rèn)為吸煙導(dǎo)致不同組織類型肺癌的機(jī)理可能與關(guān)鍵性的基因突變有關(guān)。這一點(diǎn)已逐漸為人們所重視，特別是原癌基因的激活或抑癌基因失活均與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。

主流觀點(diǎn)普遍認(rèn)為肺腺癌和肺鱗癌在不同性別人群以及吸煙與非吸煙人群之間存在著不同的發(fā)病機(jī)制，組織病理學(xué)存在差異，預(yù)后及生存期也大為不同。

申請人于2017年2月20號提交了兩件名稱分別為“血漿microRNAs用于制備篩查診斷男性群體中肺腺癌患者的診斷試劑的用途”和“血漿microRNAs用于制備篩查診斷女性群體中肺腺癌患者的診斷試劑的用途”的專利申請，提供的兩組血漿microRNAs標(biāo)記物可以分別準(zhǔn)確用于篩查診斷男性和女性群體中肺腺癌患者，靈敏度高，特異性強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)男性和女性群體中肺腺癌患者的無介入診斷；而申請人在未將臨床樣本做性別區(qū)分之前一直無法尋找到可以準(zhǔn)確用于篩查肺腺癌的microRNAs標(biāo)記物。

同樣，申請人在尋找用于診斷肺鱗癌的microRNAs標(biāo)記物時(shí)，不管單個(gè)差異microRNA還是多個(gè)差異microRNAs的組合均不具備診斷區(qū)分肺鱗癌與健康人的價(jià)值。于是，申請人按性別對人群分類，同樣未發(fā)現(xiàn)具有診斷價(jià)值的microRNA或其組合。最終，申請人按是否吸煙以及吸煙指數(shù)對人群樣本進(jìn)行了分組，發(fā)現(xiàn)了兩組用于診斷肺鱗癌的microRNAs標(biāo)記物，但需要限定臨床樣本的吸煙指數(shù)，且該兩組microRNAs標(biāo)記物無法覆蓋所有人群。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供用于準(zhǔn)確診斷肺鱗癌的血漿microRNAs標(biāo)記物和診斷試劑盒；具體地，為提高篩查的準(zhǔn)確度、敏感度和特異性，根據(jù)吸煙嚴(yán)重程度，提供一組用于非侵入性診斷重度吸煙人群中肺鱗癌患者的microRNAs標(biāo)記物，提供另外一組用于非侵入性診斷非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者的microRNAs標(biāo)記物。其中，重度吸煙指吸煙指數(shù)≥400；輕度吸煙指吸煙指數(shù)＜200，吸煙指數(shù)＝每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù)。

上述目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

重度吸煙人群中肺鱗癌患者的診斷：

一組用于非侵入性診斷重度吸煙人群中肺鱗癌患者的血漿microRNAs標(biāo)記物，所述重度吸煙人群指吸煙指數(shù)≥400的人群，由如下microRNAs組成：miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p；miR-432-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；miR-371a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；miR-588的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；miR-432-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一組用于非侵入性診斷重度吸煙人群中肺鱗癌患者的microRNAs引物、探針的組合，所述重度吸煙人群指吸煙指數(shù)≥400的人群，microRNAs引物包括逆轉(zhuǎn)錄引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物：miR-432-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.9所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.17所示；miR-371a-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.10所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.18所示；miR-588的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.11所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.19所示；miR-676-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.12所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.20所示；各microRNAs定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示，各microRNAs探針序列如SEQ ID NO.26所示。

一種用于非侵入性診斷重度吸煙人群中肺鱗癌患者的診斷試劑盒，含有上述microRNAs引物、探針的組合。

進(jìn)一步地，所述的診斷試劑盒還含有PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、dNTPs、MgCl₂、DEPC水和Taq酶等，以及標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?/p>

非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者的診斷：

一組用于非侵入性診斷非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者的血漿microRNAs標(biāo)記物，所述輕度吸煙人群指吸煙指數(shù)＜200的人群，由如下microRNAs組成：miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575；miR-644a的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；miR-619-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；miR-222-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；miR-575的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

一組用于非侵入性診斷非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者的microRNAs引物、探針的組合，所述輕度吸煙人群指吸煙指數(shù)＜200的人群，microRNAs引物包括逆轉(zhuǎn)錄引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物：miR-644a的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.13所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.21所示；miR-619-5p的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.14所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.22所示；miR-222-3p的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.15所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.23所示；miR-575的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如SEQ ID NO.16所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO.24所示；各microRNAs定量PCR后引物序列如SEQ ID NO.25所示，各microRNAs探針序列如SEQ ID NO.26所示。

一種用于非侵入性診斷非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者的診斷試劑盒，含有上述microRNAs引物、探針的組合。

進(jìn)一步地，所述的診斷試劑盒還含有PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、dNTPs、MgCl₂、DEPC水和Taq酶等，以及標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?/p>

本發(fā)明的有益效果：

為提高篩查的準(zhǔn)確度、敏感度和特異性，根據(jù)吸煙嚴(yán)重程度，本發(fā)明提供一組用于非侵入性診斷重度吸煙人群中肺鱗癌患者的microRNAs標(biāo)記物，提供另外一組用于非侵入性診斷非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者的microRNAs標(biāo)記物，診斷準(zhǔn)確度高，敏感度高、特異性強(qiáng)；其中，重度吸煙指吸煙指數(shù)≥400；輕度吸煙指吸煙指數(shù)＜200，吸煙指數(shù)＝每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù)。遺憾的是，該兩組microRNAs標(biāo)記物均不適用于吸煙指數(shù)介于200和400之間的吸煙人群中肺鱗癌患者的診斷，準(zhǔn)確度低，無臨床應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為4個(gè)microRNAs(miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p)聯(lián)合診斷區(qū)分重度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照的ROC曲線圖；

圖2為4個(gè)microRNAs(miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575)聯(lián)合診斷區(qū)分非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照的ROC曲線圖；

圖3為驗(yàn)證集中用4個(gè)microRNAs(miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p)聯(lián)合診斷區(qū)分重度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照的準(zhǔn)確性圖；

圖4為驗(yàn)證集中用4個(gè)microRNAs(miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575)聯(lián)合診斷區(qū)分非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照的準(zhǔn)確性圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖詳細(xì)介紹本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果。未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如教科書和實(shí)驗(yàn)指南中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件，為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知或易于獲知。

肺鱗癌患者和健康志愿者自2014年9月至2015年9月期間于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院和南京鼓樓醫(yī)院收集，取血經(jīng)患者同意并通過南京軍區(qū)南京總醫(yī)院和南京鼓樓醫(yī)院倫理委員會審批。重度吸煙人群(吸煙指數(shù)≥400)共88例，其中原發(fā)性肺鱗癌56例，健康對照32例，樣本年齡在35-60歲之間，且原發(fā)性肺鱗癌和健康對照人群年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.041)；非吸煙或輕度吸煙人群(吸煙指數(shù)＜200)共96例，其中原發(fā)性肺鱗癌62例，健康對照34例；樣本年齡在25-60歲之間，且原發(fā)性肺鱗癌和健康對照人群年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.037)。所有肺鱗癌患者和健康對照均經(jīng)過組織病理確證，無既往腫瘤病史，且血常規(guī)正常。

將重度吸煙人群中的肺鱗癌患者和健康對照分別隨機(jī)對半分成測試集和驗(yàn)證集；將非吸煙或輕度吸煙人群中的肺鱗癌患者和健康對照分別隨機(jī)對半分成測試集和驗(yàn)證集。測試集用于血漿差異microRNAs的發(fā)現(xiàn)，并初步用于評價(jià)差異microRNAs作為標(biāo)記物診斷區(qū)分肺鱗癌和健康對照的診斷效能；驗(yàn)證集用于進(jìn)一步驗(yàn)證microRNAs標(biāo)記物的診斷準(zhǔn)確性。

取血之前均未進(jìn)行手術(shù)、化療、放療或內(nèi)分泌治療。

實(shí)施例1基于microRNA芯片的血漿差異microRNA發(fā)現(xiàn)及定量確證

一、實(shí)驗(yàn)材料

1、儀器試劑

高速離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)購自德國Eppendorf公司；NanoDrop 1000分光光度計(jì)購自美國賽默飛世爾Thermo Scientific公司；Agilent 2100Bioanalyzer System購自美國Agilent公司；普通PCR反應(yīng)儀和實(shí)時(shí)熒光PCR儀購自美國PE公司；DYCP-31B型電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；BIO-RAD凝膠成像分析購自美國伯樂；超低溫冰箱購自海爾集團(tuán)。mirvana^TM paris^TM kit購自美國Ambion公司；Agilent RNA 6000Pico Kit購自美國Agilent公司；Trizol總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；TaqMan MicroRNAReverse Transcription Kit、TaqMan Universal PCR Master Mix、cDNA合成試劑盒購自美國賽默飛世爾Thermo Scientific公司；引物、探針委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。未特別強(qiáng)調(diào)的儀器和試劑均為本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的儀器和試劑，且易于獲得。

2、實(shí)驗(yàn)樣品

早晨空腹抽取測試集肺鱗癌患者和健康對照外周血2mL，放入EDTA管內(nèi)，輕輕混勻，使血與管內(nèi)抗凝物質(zhì)充分接觸，防止血細(xì)胞破裂。將EDTA管放入4℃冰箱，在2小時(shí)內(nèi)分離血漿。首先，820g轉(zhuǎn)速離心10分鐘，將上層液相小心吸出，避免吸取中間白色細(xì)胞層。將上層液相轉(zhuǎn)入事先預(yù)冷的1.5mL離心管，16000g轉(zhuǎn)速繼續(xù)離心10分鐘，以便進(jìn)一步分離血漿和血細(xì)胞。將第二步離心以后得到的血漿，以500μL體積分裝，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱長期保存。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、血漿總RNA的提取

mirvana^TM paris^TM kit用于抽提血漿總RNA，NanoDrop 1000分光光度計(jì)測定總RNA濃度。對RNA質(zhì)量的評價(jià)通過Agilent RNA 6000Pico Kit由Agilent 2100Bioanalyzer System來完成。方法均參照各自說明書。用RNA完整指數(shù)(RIN)衡量總RNA的質(zhì)量，該值從1到10分別反應(yīng)樣本的質(zhì)量。RIN≥7-10表示質(zhì)量好，RIN≥5表示質(zhì)量中等，RIN＜5表示質(zhì)量差。本實(shí)驗(yàn)中，以RIN＞5作為抽提總RNA合格的標(biāo)準(zhǔn)。

2、全基因組microRNA分析

microRNA芯片檢測以及結(jié)果分析由上海生物芯片有限公司完成。microRNA芯片包含723個(gè)人microRNAs和76個(gè)人病毒microRNAs探針，microRNA數(shù)據(jù)來自Sanger v.10.1數(shù)據(jù)庫。每一張芯片包含八個(gè)上樣位點(diǎn)?？俁NA(100ng)通過Cy3標(biāo)記，芯片通過XDR Scan(PMT100，PMT5)掃描芯片上的信號。標(biāo)記和雜交過程按照Agilent microRNA芯片系統(tǒng)說明書操作。芯片圖像信息通過軟件轉(zhuǎn)換為強(qiáng)度值，消除背景嘈雜信號以后，信號強(qiáng)度值直接輸入到軟件進(jìn)行分析。在對樣本的檢測過程中，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-1228在血漿中穩(wěn)定表達(dá)，故選用hsa-miR-1228作為內(nèi)參，將雜交得到的原始信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到以2為底數(shù)的log值。如果一個(gè)樣本在芯片上重復(fù)檢測的數(shù)值，其變異系數(shù)大于15％或者陽性信號值不到5％，認(rèn)為該樣本質(zhì)量不合格，在下一步試驗(yàn)中將被排除。可以檢測到的microRNA定義為在超過50％的樣本中，芯片都能檢測到陽性信號。

3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以總RNA為逆轉(zhuǎn)錄模板，使用帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性引物將microRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將RT的產(chǎn)物cDNA使用TaqMan探針法進(jìn)行定量PCR檢測。PCR擴(kuò)增釆用特異性前引物及通用后引物，并使用特異性的TaqMan探針檢測目的片段。具體參照試劑盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan MicroRNAAssay、TaqMan Universal PCR Master Mix的說明書，每個(gè)樣品上樣量為100ng，反應(yīng)步驟如下：

100ng RNA標(biāo)本加入每個(gè)RT反應(yīng)試管中，Nuclease-free water補(bǔ)足體積；加入各反應(yīng)成分后稍作離心混勻，在PCR反應(yīng)儀執(zhí)行如下程序：

16℃30min→42℃30min→85℃5min→4℃保存。

參照TaqMan MicroRNAAssay說明書在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，體系和條件如下：

加入各反應(yīng)成分并充分混勻后稍作離心，每個(gè)孔10μL，每個(gè)樣本做三個(gè)復(fù)孔。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上執(zhí)行如下程序：

總共40個(gè)循環(huán)。60℃時(shí)進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)采集，吸收波長為490nm，釋放波長為530nm。Ct值由SDS軟件經(jīng)過二次衍生法計(jì)算得到。

4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以芯片檢測結(jié)果中最穩(wěn)定的hsa-miR-1228作為內(nèi)參對照，利用Agilent Feature Extraction軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)定量分析。芯片的圖像信息通過Scanner Control Rev.7.0軟件轉(zhuǎn)換為密度值。信號經(jīng)背景消除后直接導(dǎo)入GeneSpring GX10軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。以重復(fù)試驗(yàn)獲得的平均標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)比較研究分析。Benjamini-Hochberg校對的非配對t檢驗(yàn)(p≤0.01)。利用hierarchical clustering algorithm軟件進(jìn)行聚類分析，篩選出重度吸煙人群中肺鱗癌與健康對照、非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌與健康對照中具有顯著性差異的血漿microRNAs。

實(shí)時(shí)熒光PCR數(shù)據(jù)采用與芯片相同的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化，非配對t檢驗(yàn)確定組間差異。p＜0.05設(shè)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。F檢驗(yàn)和T檢驗(yàn)分析通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測得到的microRNAs表達(dá)值之間的顯著性差異，通過SPSS軟件分析實(shí)現(xiàn)，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均為雙側(cè)。

未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如教科書和實(shí)驗(yàn)指南中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件，為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知或易于獲知。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

microRNA芯片檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重度吸煙人群中，與健康對照相比，肺鱗癌病例出現(xiàn)大量上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的microRNAs，部分microRNAs差異表達(dá)非常明顯；非吸煙或輕度吸煙人群中，與健康對照相比，肺鱗癌病例出現(xiàn)大量上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的microRNAs，部分microRNAs差異表達(dá)非常明顯。由于microRNA芯片對microRNA表達(dá)特征的研究是間接的，在分析過程中仍存在特異性和敏感度不高等缺點(diǎn)。因此，所得結(jié)果有一定的假陽性，需要輔助其他更為準(zhǔn)確的表達(dá)研究方法加以驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)利用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR來進(jìn)行鑒定。

部分變化顯著的血漿差異microRNAs得到熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR的確認(rèn)，表達(dá)水平如下：

得到上述變化倍數(shù)顯著的血漿差異microRNA后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評價(jià)單個(gè)血漿差異microRNA及其聯(lián)合用于診斷區(qū)分重度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照、非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照的診斷效能。

實(shí)施例2：ROC曲線評價(jià)血漿差異microRNA的診斷效能

ROC曲線評價(jià)法的原理：

診斷試驗(yàn)的基本評價(jià)指標(biāo)有敏感度、特異性等，綜合評價(jià)指標(biāo)有Youden指數(shù)、ROC、AUC等。對于診斷試驗(yàn)的評價(jià)，首先應(yīng)該知道受試者的真實(shí)類別，即哪些屬于健康組，哪些屬于疾病組。劃分健康組和疾病組的標(biāo)準(zhǔn)就是金標(biāo)準(zhǔn)(如本申請中公認(rèn)的組織病理診斷法)。對于按金標(biāo)準(zhǔn)確定的疾病組和健康組，采用診斷試驗(yàn)檢測的結(jié)果可以分為如下情況：

陽性(True Positive,TP)；診斷試驗(yàn)檢測為陽性(與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致)；

陰性(True Negative,TN)；診斷試驗(yàn)檢測為陰性(與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致)；

假陽性(False Positive,FP)：診斷試驗(yàn)檢測為陽性(與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致)；

假陰性(False Negative,FN)：診斷試驗(yàn)檢測為陰性(與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致)。

可以用下表表示：

診斷試驗(yàn)的敏感度＝A/(A+C)；診斷試驗(yàn)的特異性＝D/(B+D)。通過敏感度和特異性可以得出診斷試驗(yàn)相對于金標(biāo)準(zhǔn)的診斷靈敏程度和特異程度。敏感度高代表將疾病例診斷為陰性的個(gè)數(shù)少，漏診率低；特異性高代表將健康例診斷為陽性的個(gè)數(shù)少，誤診率低。

ROC曲線正是基于上述敏感度和特異性繪制出的曲線。以診斷試驗(yàn)中可能的診斷界值作為診斷點(diǎn)，根據(jù)上述表格計(jì)算出相應(yīng)的敏感度和特異性。然后，以敏感度為縱坐標(biāo)，1-特異性為橫坐標(biāo)，將各診斷點(diǎn)時(shí)各點(diǎn)的敏感度和特異性點(diǎn)在坐標(biāo)圖中標(biāo)出，連接坐標(biāo)點(diǎn)得到平滑曲線，該曲線即為ROC曲線。診斷點(diǎn)設(shè)置的越多越密，得到的ROC曲線就越平滑。

ROC曲線是以每一個(gè)檢測結(jié)果作為可能的診斷界值，其曲線下面積AUC的大小表明了診斷試驗(yàn)準(zhǔn)確度的大小。ROC曲線下面積AUC(ROCAUC)作為診斷試驗(yàn)真實(shí)性評價(jià)的固有準(zhǔn)確度指標(biāo)已被普遍認(rèn)可，完全無價(jià)值的診斷試驗(yàn)AUC為0.5，理想的診斷試驗(yàn)AUC為1，而一般認(rèn)為對于一個(gè)診斷試驗(yàn)，ROC AUC在0.5～0.7之間時(shí)診斷價(jià)值較低，在0.7～0.9之間時(shí)診斷價(jià)值中等，在0.9以上時(shí)診斷價(jià)值較高。

1、單個(gè)血漿差異microRNA用于診斷區(qū)分肺鱗癌和健康對照時(shí)ROC曲線的繪制方法

分別將測試集重度吸煙人群所有樣本中miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p的含量經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后，得到標(biāo)準(zhǔn)化值，以各可能的標(biāo)準(zhǔn)化值作為診斷點(diǎn)，按照上述方法繪制診斷區(qū)分重度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照的ROC曲線；同理，分別將測試集非吸煙或輕度吸煙人群所有樣本中miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575的含量經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后，得到標(biāo)準(zhǔn)化值，以各可能的標(biāo)準(zhǔn)化值作為診斷點(diǎn)，按照上述方法繪制診斷區(qū)分非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照的ROC曲線。單獨(dú)microRNA診斷區(qū)分肺鱗癌和健康對照的ROC曲線下面積AUC及最佳cut-off值處敏感度和特異性如下表所示：

結(jié)果單個(gè)差異microRNA診斷區(qū)分重度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照、診斷區(qū)分非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照的診斷效能低，AUC在0.5～0.7之間。

2、多個(gè)差異microRNAs聯(lián)合用于診斷區(qū)分肺鱗癌和健康對照時(shí)ROC曲線的繪制方法

分別將測試集重度吸煙人群所有樣本中miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p的含量經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后，得到標(biāo)準(zhǔn)化值，將肺鱗癌樣本作為組別1，健康對照樣本作為組別2，對miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p在兩組樣本中的標(biāo)準(zhǔn)化值進(jìn)行二元邏輯回歸，得到二元邏輯回歸方程；將各樣本中miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p的標(biāo)準(zhǔn)化值代入該二元邏輯回歸方程，即可得到各個(gè)樣本的回歸值，以可能的回歸值作為診斷點(diǎn)，按照上述方法繪制診斷區(qū)分重度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照的ROC曲線。

同理，將測試集非吸煙或輕度吸煙人群所有樣本中miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575的含量經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后，得到標(biāo)準(zhǔn)化值，將肺鱗癌樣本作為組別1，健康對照樣本作為組別2，對miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575在兩組樣本中的標(biāo)準(zhǔn)化值進(jìn)行二元邏輯回歸，得二元邏輯回歸方程；將各樣本miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575的標(biāo)準(zhǔn)化值代入該二元邏輯回歸方程，即得各個(gè)樣本的回歸值，以可能的回歸值作為診斷點(diǎn)，按照上述方法繪制診斷區(qū)分非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照的ROC曲線。

上述ROC曲線即為多個(gè)血漿差異microRNAs聯(lián)合診斷時(shí)的診斷曲線，曲線下面積AUC及最佳cut-off值處敏感度和特異性可體現(xiàn)該多個(gè)血漿差異microRNAs的聯(lián)合診斷效能。

結(jié)果表明，miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p聯(lián)合用于診斷區(qū)分重度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照具有較高的診斷效能，AUC在0.9以上，敏感度高、特異性強(qiáng)；miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575聯(lián)合用于診斷區(qū)分非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照具有較高的診斷效能，AUC在0.9以上，敏感度高、特異性強(qiáng)。

結(jié)果如下表和圖1和圖2所示。

因此，miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p聯(lián)合用于診斷區(qū)分重度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照時(shí)診斷效能高；miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575聯(lián)合用于診斷區(qū)分非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者與健康對照時(shí)診斷效能高。

實(shí)施例3：在驗(yàn)證集中進(jìn)一步驗(yàn)證血漿差異microRNAs聯(lián)合診斷的準(zhǔn)確性

一、實(shí)驗(yàn)材料

同實(shí)施例1。

二、實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

1、血漿總RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法同實(shí)施例1。

2、在驗(yàn)證集中，基于上述二元邏輯回歸方程將驗(yàn)證集重度吸煙人群樣本中的4個(gè)血漿差異microRNAs(miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p)含量的標(biāo)準(zhǔn)化值作二元邏輯回歸變換，計(jì)算出重度吸煙人群樣本中的該4個(gè)血漿差異microRNAs含量的邏輯回歸值。低于最佳cut-off值0.496的預(yù)測為健康對照，高于最佳cut-off值0.496的預(yù)測為肺鱗癌，最后計(jì)算出以該4個(gè)代謝標(biāo)志物水平預(yù)測重度吸煙人群中肺鱗癌的準(zhǔn)確率。結(jié)果如圖3，基于上述4個(gè)血漿差異microRNAs驗(yàn)證集樣本中的預(yù)測準(zhǔn)確率為95.5％。

3、在驗(yàn)證集中，基于上述二元邏輯回歸方程將驗(yàn)證集非吸煙或輕度吸煙人群樣本中的4個(gè)血漿差異microRNAs(miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575)含量的標(biāo)準(zhǔn)化值作二元邏輯回歸變換，計(jì)算出非吸煙或輕度吸煙人群樣本中的該4個(gè)血漿差異microRNAs含量的邏輯回歸值。低于最佳cut-off值0.443的預(yù)測為健康對照，高于最佳cut-off值0.443的預(yù)測為肺鱗癌，最后計(jì)算出以該4個(gè)代謝標(biāo)志物水平預(yù)測非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌的準(zhǔn)確率。結(jié)果如圖4，基于上述4個(gè)血漿差異microRNAs驗(yàn)證集樣本中的預(yù)測準(zhǔn)確率為95.8％。

實(shí)施例4：診斷試劑盒的制備

上述實(shí)施例表明，miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p聯(lián)合診斷區(qū)分重度吸煙人群中肺鱗癌和健康對照的準(zhǔn)確度高，敏感度和特異性強(qiáng)，可基于miR-432-3p、miR-371a-3p、miR-588、miR-676-5p制作診斷重度吸煙人群中肺鱗癌患者的非侵入性診斷試劑盒。該診斷試劑盒中包括miR-432-3p引物、探針；miR-371a-3p引物、探針；miR-588引物、探針；miR-676-5p引物、探針。引物具體包括逆轉(zhuǎn)錄引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。當(dāng)然，診斷試劑盒還含有PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、dNTPs、MgCl₂、DEPC水和Taq酶等，以及標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌?。引物和探針的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，下表為引物和探針的一種設(shè)計(jì)，也可以設(shè)計(jì)成其他序列。

上述實(shí)施例表明，miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575聯(lián)合診斷區(qū)分非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌和健康對照的準(zhǔn)確度高，敏感度和特異性強(qiáng)，可基于miR-644a、miR-619-5p、miR-222-3p、miR-575制作診斷非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者的非侵入性診斷試劑盒。該診斷試劑盒中包括miR-644a引物、探針；miR-619-5p引物、探針；miR-222-3p引物、探針；miR-575引物、探針。引物具體包括逆轉(zhuǎn)錄引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。當(dāng)然，診斷試劑盒還含有PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、dNTPs、MgCl₂、DEPC水和Taq酶等，以及標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰Ｒ锖吞结樀脑O(shè)計(jì)是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，下表為引物和探針的一種設(shè)計(jì)，也可以設(shè)計(jì)成其他序列。

為提高篩查的準(zhǔn)確度、敏感度和特異性，根據(jù)吸煙嚴(yán)重程度，本發(fā)明提供一組用于非侵入性診斷重度吸煙人群中肺鱗癌患者的microRNAs標(biāo)記物，提供另外一組用于非侵入性診斷非吸煙或輕度吸煙人群中肺鱗癌患者的microRNAs標(biāo)記物，診斷準(zhǔn)確度高，敏感度高、特異性強(qiáng)；其中，重度吸煙指吸煙指數(shù)≥400；輕度吸煙指吸煙指數(shù)＜200，吸煙指數(shù)＝每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù)。遺憾的是，該兩組microRNAs標(biāo)記物均不適用于吸煙指數(shù)介于200和400之間的吸煙人群中肺鱗癌患者的診斷，準(zhǔn)確度低，無臨床應(yīng)用價(jià)值。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京九壽堂醫(yī)藥科技有限公司

<120> 一種用于診斷重度吸煙人群中肺鱗癌患者的非侵入性標(biāo)記物及試劑盒

<130> 1

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

cuggauggcu ccuccauguc u 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

aagugccgcc aucuuuugag ugu 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

uuggccacaa uggguuagaa c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

ucuucaaccu caggacuugc a 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

aguguggcuu ucuuagagc 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

gcugggauua caggcaugag cc 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

agcuacaucu ggcuacuggg u 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

gagccaguug gacaggagc 19

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacag acatgg 56

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac actcaa 56

<210> 11

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacgt tctaac 56

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgactg caagtc 56

<210> 13

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacgc tctaag 56

<210> 14

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacgg ctcatg 56

<210> 15

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac ccagta 56

<210> 16

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacgc tcctgt 56

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acactccagc tgggctggat ggctcctcca t 31

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acactccagc tgggaagtgc cgccatcttt t 31

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acactccagc tgggttggcc acaatgggtt a 31

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

acactccagc tgggtcttca acctcaggac t 31

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acactccagc tgggagtgtg gctttcttag a 31

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

acactccagc tggggctggg attacaggca t 31

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acactccagc tgggagctac atctggctac t 31

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acactccagc tggggagcca gttggacagg a 31

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cgccgcagtg cgtgtcgtgg agt 23

<210> 26

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cgtatcca 8