本發(fā)明涉及一種低分子量肝素的制備方法，特別涉及一種利用超聲輔助氧化方法綠色、快速制備低分子量肝素的方法，屬于多糖降解領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肝素是一種由艾杜糖醛酸和葡萄糖胺組成的，具有雙糖重復(fù)單元的長鏈粘多糖，屬糖胺聚糖，且分子量在3-30kda之間，重均分子量約15kda左右。肝素首先發(fā)現(xiàn)于肝臟，也因此得名，廣泛分布于在哺乳動物的組織中，如肝臟、肺、腸粘膜、心、脾臟、腎、胸腺等，其在醫(yī)藥方面作為抗凝血和抗血栓藥物的應(yīng)用備受關(guān)注。隨著對其研究的不斷深入，科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)肝素具有抗炎、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)血脂等諸多生物學(xué)功能。

低分子量肝素是通過對普通肝素降解得到的分子量較小的片段，具有生物利用率高、血漿半衰期長、口服易吸收、致出血傾向大大降低等諸多優(yōu)點。目前常用的低分子量肝素制備方法包括肝素鈉酶降解法、亞硝酸降解法、β-消除法、過氧化物降解法和過碘酸降解法，但由于酶法降解生產(chǎn)成本較高而缺乏競爭力，因此，市場上低分子量肝素制備多采用化學(xué)降解方法，易引起化學(xué)污染，且生產(chǎn)周期較長，如亞硝酸降解法在ph2.3-3.0，需約3.5h的反應(yīng)。該方法利用超聲和抗化血酸催化fe²⁺和過氧化氫的氧化反應(yīng)，從而達到快速制備低分子量肝素的目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于改進目前低分子量肝素制備技術(shù)，提供了一種安全、快速的一種低分子量肝素的制備方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種低分子量肝素的制備方法，包括以下步驟：

(1)取一定量的蒸餾水，加入適量hcl溶液調(diào)整ph在3-5之間，加入fecl2·4h2o或feso4·7h2o和抗壞血酸，配置成含有1.0-5.0mmol/lfe²⁺和0.5-2.0mmol/l抗壞血酸的溶液a。

(2)取肝素溶于溶液a，使得肝素的濃度為4-20mg/ml，攪拌溶液至肝素完全溶解；

(3)將步驟2配置的肝素溶液轉(zhuǎn)移至10-40℃環(huán)境中進行超聲處理，超聲強度為3-15w/ml，同時在溶液中加入8mol/lh2o2溶液，使金屬離子與過氧化氫的摩爾比為1:10-1:25；

(4)超聲處理后，加入亞硫酸氫鈉，終止反應(yīng)，然后通過陽離子交換樹脂置換溶液中的金屬離子；

(5)對步驟4處理后的溶液進行過濾，取濾液調(diào)整ph至5-8；

(6)將步驟5處理后的溶液轉(zhuǎn)移至500da的透析袋中，流水透析24h，純水透析24h，透析后液體0.22μm的水膜，凍干，得到低分子量肝素。

進一步地，所述步驟1中，ph為3，fe²⁺濃度為2mm，抗壞血酸濃度為1.0mmol/l。

進一步地，所述步驟3中，金屬離子與過氧化氫的摩爾比為1:20。

進一步地，所述步驟5中，ph為6。

本發(fā)明所具備的優(yōu)點：

1.本發(fā)明為肝素降解提供一種綠色、安全、快速降解方法，得率可達到75％以上，所得產(chǎn)品純度較高、質(zhì)量穩(wěn)定、成本低。

2.降解工藝簡單，反應(yīng)時間短，所用樹脂可重復(fù)利用，工藝條件環(huán)保無污染。

3.本發(fā)明所得的產(chǎn)品的重均分子量在4000-5500da，抗xa因子活性為85-105u/mg。

具體實施方式

本發(fā)明通過超聲、抗壞血酸和fenton氧化反應(yīng)聯(lián)用，達到快速降解肝素的目的。超聲能夠強化fenton反應(yīng)中fe³⁺的還原，還原生成的fe²⁺可進一步與過氧化氫發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生羥基自由基；同時抗壞血酸亦可強化降解體系，促進肝素的降解。羥基自由基造成肝素的氧化斷裂，作用位點主要集中于未硫酸化的己糖醛酸，形成低分子量肝素。所得到的的肝素重均分子量在4000-5500da，產(chǎn)物抗凝血保留，且副作用減小。

fe²⁺+h2o2→fe³⁺+·oh+oh^-(1)

下面結(jié)合具體事例對本產(chǎn)品做進一步闡述。

實施例1：

(1)取30ml蒸餾水，加入3mol/lhcl溶液，調(diào)整ph至3，加入fecl2·4h2o和抗壞血酸，配置成含有1mmol/lfe²⁺和0.5mmol/l抗壞血酸的溶液a；

(2)取120mg/ml肝素溶解于30ml溶液中，攪拌充分溶解后，轉(zhuǎn)移至超聲管(內(nèi)徑3.4cm)中；

(3)將超聲管置于10℃恒溫槽中，并開啟超聲設(shè)備，同時加入8mol/lh2o2溶液，使金屬離子與過氧化氫比為1:10，設(shè)置超聲強度3w/ml，超聲處理10min；

(4)超聲處理后，加入過量亞硫酸氫鈉，還原多余h2o2，終止反應(yīng)；

(5)將終止反應(yīng)后的溶液通過陽離子交換樹脂，控制流速為0.5ml/min，充分置換其中的鐵離子；

(6)將置換后的溶液過0.22μm的水膜，取濾液用2mol/lnaoh調(diào)整ph為6.0；

(7)將上述溶液轉(zhuǎn)移至500da的透析袋中，流水透析24h，純水透析12h，后將其置于真空冷凍機中凍干。取肝素樣品進行分子量及抗凝血活性測定，重均分子量為4876da，抗xa因子活性為96u/mg。

實施例2：

(1)取300ml蒸餾水，加入3mol/lhcl溶液，調(diào)整ph至3.5，加入fecl2·4h2o和抗壞血酸，配置成含有3mmol/lfe²⁺和1mmol/l抗壞血酸的溶液a；

(2)取3g肝素溶解于300ml溶液中，攪拌充分溶解后，轉(zhuǎn)移至超聲槽中；

(3)將其置于30℃恒溫槽中，并開啟超聲設(shè)備，同時加入8mol/lh2o2溶液，使金屬離子與過氧化氫比為1:18，設(shè)置超聲強度10w/ml，超聲處理10min；

(4)超聲處理后，加入過量亞硫酸氫鈉，還原多余h2o2，終止反應(yīng)；

(5)將終止反應(yīng)后的溶液通過陽離子交換樹脂，控制流速為0.5ml/min，充分置換其中的鐵離子；

(6)將置換后的溶液過0.22μm的水膜，取濾液用2mol/lnaoh調(diào)整ph為5；

(7)將上述溶液轉(zhuǎn)移至500da的透析袋中，流水透析24h，純水透析12h，后將其置于真空冷凍機中凍干。取肝素樣品進行分子量及抗凝血活性測定，重均分子量為4618，抗xa因子活性為94u/mg。

實施例3：

(1)取3000ml蒸餾水，加入3mol/lhcl溶液，調(diào)整ph至5，加入fecl2·4h2o和抗壞血酸，配置成含有5mmol/lfe²⁺和2mmol/l抗壞血酸的溶液a；

(2)取60g肝素溶解于3l溶液中，攪拌充分溶解后，轉(zhuǎn)移至超聲槽中；

(3)將其置于30℃恒溫槽中，并開啟超聲設(shè)備，同時加入8mol/lh2o2溶液，使金屬離子與過氧化氫比為1:25，設(shè)置超聲強度15w/ml，超聲處理10min；

(4)超聲處理后，加入過量亞硫酸氫鈉，還原多余h2o2，終止反應(yīng)；

(5)將終止反應(yīng)后的溶液通過陽離子交換樹脂，控制流速為0.5ml/min，充分置換其中的鐵離子；

(6)將置換后的溶液過0.22μm的水膜，取濾液用2mol/lnaoh調(diào)整ph為8；

(7)將上述溶液轉(zhuǎn)移至500da的透析袋中，流水透析24h，純水透析12h，后將其置于真空冷凍機中凍干。取肝素樣品進行分子量及抗凝血活性測定，重均分子量為5319，抗xa因子活性為89u/mg。