本發(fā)明涉及細胞分離
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種肝星狀細胞分離制備方法。
背景技術(shù)：
：肝星狀細胞（hsc）位于肝原代細胞和肝竇內(nèi)皮細胞之間。一般認為肝星狀細胞的主要作用是儲存營養(yǎng)物質(zhì)，特別是維生素，若大量失去維生素a將導致星狀細胞纖維化。正常情況下肝星狀細胞處于靜止狀態(tài)，當肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，肝星狀細胞被激活，其表型由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚?。激活的肝星狀細胞一方面通過增生和分泌細胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建，另一方面通過細胞收縮使肝竇內(nèi)壓升高，這兩類變化最終奠定了肝纖維化、門靜脈高壓癥發(fā)病的病理學基礎(chǔ)。故肝星狀細胞是研究肝纖維化的工具，被廣泛應(yīng)用于肝功能，肝疾理，病理，藥理和其它相關(guān)研究。因此，如何分離制備高產(chǎn)量、高純度、高存活率、形態(tài)完整、體外代謝活性高的肝星狀細胞受到研究者的廣泛關(guān)注。自1953年anderson創(chuàng)剪切法從肝臟分離肝細胞以來,各實驗室對肝細胞的分離方法進行了不斷改進。在眾多方法中,主要分為非灌流的方法和灌流的方法。其中，非灌流的方法以其簡單易行的特點得到了一定的應(yīng)用,但由于存在消化不完全、分離得到的肝細胞中多細胞團塊存在的問題,不能滿足許多基礎(chǔ)研究或臨床應(yīng)用的要求。1969年，berry和friend引入了肝臟灌流法,灌流可以使消化液與肝組織更加充分地接觸,不僅提高了分離效率,還使分離所得肝細胞的活力和數(shù)量大大提高。自從引入灌流法分離肝細胞以來,許多學者根據(jù)不同的應(yīng)用條件對灌流法進行了改良。其中seglen經(jīng)過一系列細致的研究,創(chuàng)立了改良的seglen兩步灌流法,這一方法已成為應(yīng)用至今的標準的原代肝細胞分離方法。兩步灌流法主要是通過門靜脈先后用含edta或egta緩沖液和膠原酶緩沖液進行灌注來分離肝細胞的方法。許多學者在具體操作中,不斷改進兩步灌流法的灌注條件,目的在于進一步減少分離過程中肝細胞的損傷,提高肝細胞的活率。肝星狀細胞在肝組織細胞中密度最小，所以在兩步灌流法的基礎(chǔ)上最后用特定的密度液梯度離心出肝星狀細胞。然而，肝臟是由實質(zhì)細胞（肝原代細胞）和非實質(zhì)細胞構(gòu)成，其比例為3：2。肝臟的復雜性在于非實質(zhì)細胞包括：星狀細胞，竇內(nèi)皮，膽管上皮和免疫細胞（淋巴細胞和粒細胞），而整個肝臟組是由60%實質(zhì)細包和40%非實質(zhì)細胞交錯分布組成一個大的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，單一酶解達不到很好的效果，加上常用緩沖體系諸如d-hank’s液、hank’s液對酶解作用的限制，使得分離效果相對較差，因此，有必要對現(xiàn)有技術(shù)中的肝星狀細胞分離制備方法進行改進。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明為克服上述現(xiàn)有技術(shù)所述的至少一種不足，提供一種肝星狀細胞分離制備方法，分離制備高產(chǎn)量、高純度、高存活率、形態(tài)完整、體外代謝活性高的肝星狀細胞。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：一種肝星狀細胞分離制備方法，通過灌注、剝離、密度梯度分離得到肝星狀細胞，灌注過程中先后用灌注液i、灌注液ii、灌注液iii進行灌注；其中，所述灌注液i包括緩沖液i；所述灌注液ii由每毫升緩沖液ii加入0.22~0.38mg鏈霉蛋白酶e構(gòu)成；所述灌注液iii由每毫升緩沖液ii加入0.52~0.68mg膠原酶d構(gòu)成；所述緩沖液i每升包括下述重量份的各組分：nacl7000~9000mg，kcl350~450mg，nah2po4·h2o80~100mg，na2hpo4100~140mg，hepes2200~2600mg，nahco3300~400mg，egta150~250mg，glucose800~1000mg，其余為h2o；所述緩沖液ii每升包括下述重量份的各組分：nacl7000~9000mg，kcl350~450mg，nah2po4·h2o80~100mg，na2hpo4100~140mg，hepes2200~2600mg，nahco3300~400mg，cacl2·2h2o500~620mg，其余為h2o。hepes：4-羥乙基哌嗪乙磺酸；egta：乙二醇二乙醚二胺四乙酸；glucose：葡萄糖。本發(fā)明根據(jù)不同肝細胞的表面特性，先后使用鏈霉蛋白酶e和膠原酶d進行灌注，解決分離肝星狀細胞中血液干擾和組織特異性問題，得到高存活率、高純度的肝星狀細胞。肝臟是由肝細胞組成，并有豐富的血管網(wǎng)，呈紅褐色，質(zhì)軟而脆，易受暴力打擊而破裂，導致傳統(tǒng)機械法分離肝星狀細胞得率和存活率十分低下而極少人使用。一般酶解法由于血管網(wǎng)豐富而導致酶的合力低下，另外，肝臟組織中各類細胞交錯分布，單一酶解達不到很好的效果。鏈霉蛋白酶e和膠原酶d的分別作用使得結(jié)構(gòu)復雜、每種細胞表面生長基質(zhì)不同的肝臟能夠被充分酶解而得到單個細胞，而且該過程不會破壞周圍的血管網(wǎng)，使得酶解得到的肝星狀細胞具有較高存活率和較高得率。同時，鏈霉蛋白酶e和膠原酶d分別灌注，使得兩種酶的酶解作用不會相互干擾，分離效果更佳。另外，本發(fā)明采用特殊的緩沖體系即緩沖液ii為酶解過程提供了良好的環(huán)境，促進酶解的進行，提高分離效率和改善分離效果，glucose為細胞生活提供了必要能量來源，為分離過程贏得時間，提高分離得到的單細胞的存活率。進一步地，所述灌注液ii由每毫升緩沖液ii加入0.3mg鏈霉蛋白酶e構(gòu)成；所述灌注液iii由每毫升緩沖液ii加入0.6mg膠原酶d構(gòu)成；剝離過程中，將經(jīng)灌注處理后的肝臟置于平衡溶液中漂洗并剪碎，然后在37℃溫度下于解離液中孵育20min，過濾離心，棄上清，用含145~155ul脫氧核糖核酸酶i的8~12ml平衡溶液重懸細胞。其中，所述平衡溶液包括緩沖液iii；所述解離液由每毫升緩沖液ii加入0.45~0.55mg鏈霉蛋白酶e、0.45~0.55mg膠原酶d和0.015~0.025mg脫氧核糖核酸酶構(gòu)成；所述緩沖液iii每升包括下述重量份的各組分：kcl320~420mg，mgcl2·6h2o170~250mg，mgso4·7h2o60~80mg，na2hpo450~70mg，kh2po425~35mg，glucose890~1100mg，nahco3190~270mg，cacl2·2h2o185~265mg，其余為h2o。本發(fā)明將經(jīng)過灌注的肝臟摘除剪碎后進一步采用復合酶配以緩沖體系緩沖液iii使肝細胞得到進一步分離，并在37℃溫度下進行孵育，改善分離效果。進一步地，所述解離液由每毫升緩沖液ii加入0.5mg鏈霉蛋白酶e、0.5mg膠原酶d和0.02mg脫氧核糖核酸酶構(gòu)成；密度梯度分離過程中，將經(jīng)灌注、剝離處理得到的細胞懸液先后加入平衡溶液和離心液a，混勻后移入預先加入離心液b的離心管中，再加入平衡溶液，離心，回收肝星狀細胞。其中，所述平衡溶液包括緩沖液iii；所述離心液a由每毫升緩沖液iii加入0.15~0.25g密度梯度分離試劑構(gòu)成；所述離心液b由每毫升緩沖液iii加入0.08~0.12g密度梯度分離試劑構(gòu)成；所述緩沖液iii每升包括下述重量份的各組分：kcl320~420mg，mgcl2·6h2o170~250mg，mgso4·7h2o60~80mg，na2hpo450~70mg，kh2po425~35mg，glucose890~1100mg，nahco3190~270mg，cacl2·2h2o185~265mg，其余為h2o。密度梯度分離試劑采用nycodenz粉劑。本發(fā)明采用特殊的緩沖體系緩沖液iii配合密度梯度分離液得到特殊的密度梯度分離體系，該體系擁有與肝星狀細胞密度一致的密度層，能夠?qū)⒏涡菭罴毘浞指患?，提高肝星狀細胞的得率。進一步地，所述離心液a由每毫升緩沖液iii加入0.2g密度梯度分離試劑構(gòu)成；所述離心液b由每毫升緩沖液iii加入0.1g密度梯度分離試劑構(gòu)成。進一步地，所述緩沖液i每升包括下述重量份的各組分：nacl7500~8500mg，kcl380~420mg，nah2po4·h2o85~95mg，na2hpo4110~130mg，hepes2300~2500mg，nahco3320~380mg，egta170~220mg，glucose850~950mg，其余為h2o；所述緩沖液ii每升包括下述重量份的各組分：nacl7500~8500mg，kcl380~420mg，nah2po4·h2o85~95mg，na2hpo4110~130mg，hepes2300~2500mg，nahco3320~380mg，cacl2·2h2o520~600mg，其余為h2o。所述緩沖液iii每升包括下述重量份的各組分：kcl345~395mg，mgcl2·6h2o190~230mg，mgso4·7h2o65~75mg，na2hpo455~65mg，kh2po427.5~32.5mg，glucose940~1050mg，nahco3210~250mg，cacl2·2h2o205~245mg，其余為h2o。更進一步地，所述緩沖液i每升包括下述重量份的各組分：nacl8000mg，kcl400mg，nah2po4·h2o88.17mg，na2hpo4120.45mg，hepes2380mg，nahco3350mg，egta190mg，glucose900mg，其余為h2o；所述緩沖液ii每升包括下述重量份的各組分：nacl8000mg，kcl400mg，nah2po4·h2o88.17mg，na2hpo4120.45mg，hepes2380mg，nahco3350mg，cacl2·2h2o560mg，其余為h2o。所述緩沖液iii每升包括下述重量份的各組分：kcl370mg，mgcl2·6h2o210mg，mgso4·7h2o70mg，na2hpo459.6mg，kh2po430mg，glucose991mg，nahco3227mg，cacl2·2h2o225mg，其余為h2o。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的肝星狀細胞分離制備方法能夠有效分離肝星狀細胞，先后采用鏈霉蛋白酶e和膠原酶d的單獨作用、剪碎后再用復合酶共同作用使得每種細胞的不同表面生長基質(zhì)都能夠得到充分的酶解，從而得到單個的細胞懸液。特殊緩沖體系緩沖液ii的配合為酶的酶解作用提供了適宜的環(huán)境，使得酶解更為完全，從而提高分離肝星狀細胞的得率。特殊的緩沖體系緩沖液iii配合nycodenz得到特殊的密度梯度分離體系，該體系擁有與肝星狀細胞密度一致的密度層，能夠?qū)⒏涡菭罴毘浞指患岣吒涡菭罴毎牡寐?。具體實施方式為了讓本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。選取65只大小相近、種類相同、肝臟大小約為1~2g的健康小鼠作為實驗對象，將65只健康小鼠隨機分為13個試驗組，試驗組1采用實施例1進行試驗，試驗組2采用實施例2進行試驗，以此類推。實施例1本實施例的肝星狀細胞分離制備方法，包括如下步驟：一、配制實驗試劑灌注液i：取緩沖液i；灌注液ii：取緩沖液ii，每毫升緩沖液ii加入0.3mg鏈霉蛋白酶e；灌注液iii：取緩沖液ii，每毫升緩沖液ii加入0.6mg膠原酶d；平衡溶液：取緩沖液iii；解離液：取緩沖液ii，每毫升緩沖液ii加入0.5mg鏈霉蛋白酶e、0.5mg膠原酶d和0.02mg脫氧核糖核酸酶；離心液a：取緩沖液iii，每毫升緩沖液iii加入0.2gnycodenz密度梯度分離試劑；離心液b：取緩沖液iii，每毫升緩沖液iii加入0.1gnycodenz密度梯度分離試劑。其中，緩沖液i每升包括下述重量份的各組分：nacl8000mg，kcl400mg，nah2po4·h2o88.17mg，na2hpo4120.45mg，hepes2380mg，nahco3350mg，egta190mg，glucose900mg，其余為h2o；緩沖液ii每升包括下述重量份的各組分：nacl8000mg，kcl400mg，nah2po4·h2o88.17mg，na2hpo4120.45mg，hepes2380mg，nahco3350mg，cacl2·2h2o560mg，其余為h2o；所述緩沖液iii每升包括下述重量份的各組分：kcl370mg，mgcl2·6h2o210mg，mgso4·7h2o70mg，na2hpo459.6mg，kh2po430mg，glucose991mg，nahco3227mg，cacl2·2h2o225mg，其余為h2o。二、分離制備肝星狀細胞s1.灌注：用25g留置針插入下腔靜脈，灌注開始后結(jié)扎肝動脈，剪斷肝門靜脈，由肝門靜脈以5ml/min的速度用灌注液i灌注5min、再以5ml/min的速度用灌注液ii灌注5min、最后以5ml/min的速度用灌注液iii灌注5min。；s2.剝離：將步驟s1處理后的肝臟置于20ml平衡溶液中漂洗并剪碎，均分至2個50ml離心管中，補加預熱的解離液至50ml，在37℃溫度下孵育20min得到單細胞懸液，將單細胞懸液用70ul的無菌篩過濾后，在4℃下以500rpm離心1min，棄上清，用含150ul脫氧核糖核酸酶i的10ml平衡溶液重懸細胞的細胞懸液；s3.分離：將步驟s2得到的細胞懸液補加平衡溶液至36ml，再加入14ml離心液a，混勻后平均分至4個預先加入4ml離心液b的15ml離心管中，最后加入1.5ml平衡溶液，在4℃下以300rpm離心20min，回收渾濁帶即得肝星狀細胞。實施例2本實施例除了緩沖液i、緩沖液ii、緩沖液iii各組分的重量份組成不同外，其他同實施例1。所述緩沖液i每升包括下述重量份的各組分：nacl7500mg，kcl380mg，nah2po4·h2o85mg，na2hpo4110mg，hepes2300mg，nahco3320mg，egta170mg，glucose850mg，其余為h2o；所述緩沖液ii每升包括下述重量份的各組分：nacl7500mg，kcl380mg，nah2po4·h2o85mg，na2hpo4110mg，hepes2300mg，nahco3320mg，cacl2·2h2o520mg，其余為h2o。所述緩沖液iii每升包括下述重量份的各組分：kcl345mg，mgcl2·6h2o190mg，mgso4·7h2o65mg，na2hpo455mg，kh2po427.5mg，glucose940mg，nahco3210mg，cacl2·2h2o205mg，其余為h2o。實施例3本實施例除了緩沖液i、緩沖液ii、緩沖液iii各組分的重量份組成不同外，其他同實施例1。所述緩沖液i每升包括下述重量份的各組分：nacl8500mg，kcl420mg，nah2po4·h2o95mg，na2hpo4130mg，hepes2500mg，nahco3380mg，egta220mg，glucose950mg，其余為h2o；所述緩沖液ii每升包括下述重量份的各組分：nacl8500mg，kcl420mg，nah2po4·h2o95mg，na2hpo4130mg，hepes2500mg，nahco3380mg，cacl2·2h2o600mg，其余為h2o。所述緩沖液iii每升包括下述重量份的各組分：kcl395mg，mgcl2·6h2o230mg，mgso4·7h2o75mg，na2hpo465mg，kh2po432.5mg，glucose1050mg，nahco3250mg，cacl2·2h2o245mg，其余為h2o。實施例4本實施例除了緩沖液i、緩沖液ii、緩沖液iii各組分的重量份組成不同外，其他同實施例1。所述緩沖液i每升包括下述重量份的各組分：nacl7000mg，kcl350mg，nah2po4·h2o80mg，na2hpo4100mg，hepes2200mg，300mg，egta150mg，glucose800mg，其余為h2o；所述緩沖液ii每升包括下述重量份的各組分：nacl7000mg，kcl350mg，nah2po4·h2o80mg，na2hpo4100mg，hepes2200mg，nahco3300mg，cacl2·2h2o500mg，其余為h2o。所述緩沖液iii每升包括下述重量份的各組分：kcl320~420mg，mgcl2·6h2o170mg，mgso4·7h2o60mg，na2hpo450mg，kh2po425mg，glucose890mg，nahco3190mg，cacl2·2h2o185mg，其余為h2o。實施例5本實施例除了緩沖液i、緩沖液ii、緩沖液iii各組分的重量份組成不同外，其他同實施例1。所述緩沖液i每升包括下述重量份的各組分：nacl9000mg，kcl450mg，nah2po4·h2o100mg，na2hpo4140mg，hepes2600mg，nahco3400mg，egta250mg，glucose1000mg，其余為h2o；所述緩沖液ii每升包括下述重量份的各組分：nacl9000mg，kcl450mg，nah2po4·h2o100mg，na2hpo4140mg，hepes2600mg，nahco3400mg，cacl2·2h2o620mg，其余為h2o。所述緩沖液iii每升包括下述重量份的各組分：kcl420mg，mgcl2·6h2o250mg，mgso4·7h2o80mg，na2hpo470mg，kh2po435mg，glucose1100mg，nahco3270mg，cacl2·2h2o265mg，其余為h2o。實施例6本實施例與實施例1除了灌注液ii和灌注液iii各組分重量份組成不同外，其他同實施例1。灌注液ii：取緩沖液ii，每毫升緩沖液ii加入0.22mg鏈霉蛋白酶e；灌注液iii：取緩沖液ii，每毫升緩沖液ii加入0.52mg膠原酶d；實施例7本實施例與實施例1除了灌注液ii和灌注液iii各組分重量份組成不同外，其他同實施例1。灌注液ii：取緩沖液ii，每毫升緩沖液ii加入0.38mg鏈霉蛋白酶e；灌注液iii：取緩沖液ii，每毫升緩沖液ii加入0.68mg膠原酶d；實施例8本實施例與實施例1除了解離液各組分重量份組成不同外，其他同實施例1。取緩沖液ii，每毫升緩沖液ii加入0.45mg鏈霉蛋白酶e、0.45mg膠原酶d和0.015mg脫氧核糖核酸酶；實施例9本實施例與實施例1除了解離液各組分重量份組成不同外，其他同實施例1。取緩沖液ii，每毫升緩沖液ii加入0.55mg鏈霉蛋白酶e、0.55mg膠原酶d和0.025mg脫氧核糖核酸酶；實施例10本實施例與實施例1除了離心液a和離心液b各組分重量份組成不同外，其他同實施例1。離心液a：取緩沖液iii，每毫升緩沖液iii加入0.15gnycodenz密度梯度分離試劑；離心液b：取緩沖液iii，每毫升緩沖液iii加入0.08gnycodenz密度梯度分離試劑。實施例11本實施例與實施例1除了離心液a和離心液b各組分重量份組成不同外，其他同實施例1。離心液a：取緩沖液iii，每毫升緩沖液iii加入0.25gnycodenz密度梯度分離試劑；離心液b：取緩沖液iii，每毫升緩沖液iii加入0.12gnycodenz密度梯度分離試劑。實施例12本實施例與實施例1除了分離制備肝星狀細胞步驟不同外，其他同實施例1。s1.灌注：用25g留置針插入下腔靜脈，灌注開始后結(jié)扎肝動脈，剪斷肝門靜脈，由肝門靜脈以5ml/min的速度用灌注液i灌注5min、再以5ml/min的速度用灌注液ii灌注5min、最后以5ml/min的速度用灌注液iii灌注5min。；s2.剝離：將步驟s1處理后的肝臟置于20ml平衡溶液中漂洗并剪碎，均分至2個50ml離心管中，補加預熱的解離液至50ml，在37℃溫度下孵育20min得到單細胞懸液，將單細胞懸液用70ul的無菌篩過濾后，在4℃下以500rpm離心1min，棄上清，用含145ul脫氧核糖核酸酶i的8ml平衡溶液重懸細胞的細胞懸液；s3.分離：將步驟s2得到的細胞懸液補加平衡溶液至36ml，再加入14ml離心液a，混勻后平均分至4個預先加入4ml離心液b的15ml離心管中，最后加入1.5ml平衡溶液，在4℃下以300rpm離心20min，回收渾濁帶即得肝星狀細胞。實施例13本實施例與實施例1除了分離制備肝星狀細胞步驟不同外，其他同實施例1。s1.灌注：用25g留置針插入下腔靜脈，灌注開始后結(jié)扎肝動脈，剪斷肝門靜脈，由肝門靜脈以5ml/min的速度用灌注液i灌注5min、再以5ml/min的速度用灌注液ii灌注5min、最后以5ml/min的速度用灌注液iii灌注5min。；s2.剝離：將步驟s1處理后的肝臟置于20ml平衡溶液中漂洗并剪碎，均分至2個50ml離心管中，補加預熱的解離液至50ml，在37℃溫度下孵育20min得到單細胞懸液，將單細胞懸液用70ul的無菌篩過濾后，在4℃下以500rpm離心1min，棄上清，用含155ul脫氧核糖核酸酶i的12ml平衡溶液重懸細胞的細胞懸液；s3.分離：將步驟s2得到的細胞懸液補加平衡溶液至36ml，再加入14ml離心液a，混勻后平均分至4個預先加入4ml離心液b的15ml離心管中，最后加入1.5ml平衡溶液，在4℃下以300rpm離心20min，回收渾濁帶即得肝星狀細胞。實驗結(jié)果：項目細胞得率（%）細胞存活率（%）細胞純度（%）試驗組191%96%95%試驗組288%90%88%試驗組385%86%89%試驗組483%88%80%試驗組580%85%82%試驗組682%80%83%試驗組783%84%85%試驗組882%88%83%試驗組985%85%82%試驗組1082%83%81%試驗組1188%89%85%試驗組1283%85%91%試驗組1388%81%86%由以上檢測數(shù)據(jù)可以看出，采用本發(fā)明的肝星狀細胞分離制備方法制備肝星狀細胞具有較高的細胞得率、細胞存活率、細胞純度，其中，采用實施例1所述制備方法制備肝星狀細胞的細胞得率、細胞存活率、細胞純度均達到90%以上，其細胞存活率及細胞純度均達到95%以上，具有明顯的優(yōu)越性。當前第1頁12