本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，特別涉及一種來源于金線蓮的苯丙氨酸解氨酶基因。

背景技術：

金線蓮（anoectochilusroxburghii）是多年生草本植物，生長在福建、臺灣、廣東、廣西、海南、四川、貴州、云南等亞熱帶及熱帶地區(qū)，屬蘭科開唇蘭屬金線蓮種。金線蓮中重要藥理活性的物質(zhì)主要為：黃酮類化合物，甾體類化合物，三萜類化合物，糖類成分，生物堿，強心甙類，酯類，?；撬?，多種氨基酸，微量元素及無機元素等。在民間素有“藥王”、“金草”、“神草”、“鳥人參”等美稱。其中，金線蓮中的黃酮類化合物主要包括槲皮素和異鼠李素。黃酮類化合物的合成直接影響了金線蓮的藥用價值。

苯丙氨酸解氨酶(pal)是在次生代謝酶類中研究較多、較早、最詳盡的酶，它把植物的次生代謝與初生代謝聯(lián)系起來，是催化直接脫掉l-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。對金線蓮中黃酮類化合物合成上游苯丙氨酸代謝途徑的苯丙氨酸解氨酶（pal）基因的克隆的研究，是研究金線蓮中特定的目的次生代謝產(chǎn)物（如槲皮素和異鼠李素）富集的基礎，具有重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對藥用植物金線蓮的苯丙氨酸解氨酶基因開發(fā)研究的局限性，提供一種來源于植物金線蓮的苯丙氨酸解氨酶基因。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種來源于金線蓮的苯丙氨酸解氨酶基因，該基因序列具有如seqidno.1所述的核苷酸序列。

seqidno.1：

gcatccgattcgaaatcctggaggccattaccagcctcctcaacagcaagattacgccttgcctgccgctgaggggaaccatcaccgcctccggcgatcttgttcctctatcttacattgcgggtgtcttaaccggccgtcccaattgcaaggctataacagccgacggtgttattgtcaacgcagtagaggccttccgtcttgcaggaatctctagcgggttcttcgatcttcagcccaaggaagggctcgcacttgtcaatggaaccgccgtcggctccggcttcgcctccattgtcctgttcgaggcaaacatcctcgccgttatggcagtggttctctctctctgttttgcgaggtgatgcaggggaagccagagttcaccgaccacctcacccacaagctcaagcaccccccaggccagattgaggccgccgccaccatggagcacatactcgacggcagctcttacatgaagacggcgaagaagctccatgaactggaccctctccagaagccaaaacaggacagatacgctcttcgcacctcgccccaatggctcggccctcagattgaagtcatacgagctgcgacgaaatcaatcgaaagagagatcaactccgtcaacgacaaccccctcatcgatgtctcgaggaataaagctctccatggcgaaaatttccaaggaacccccattggcgtctccatggacaacaccag

本發(fā)明的優(yōu)點在于：以同源擴增拼接的方法得到金線蓮中pal基因的中間片段，這是一種新的pal基因序列。同時，這種擴增未知序列的方法操作簡單方便。

附圖說明

圖1為金線蓮pal基因中間片段電泳檢測結果圖。其中1為引物zu1\zd3擴增片段電泳結果。

圖2金線蓮pal基因同源擴增電泳檢測結果圖。注：1為引物zu1\zd1擴增片段電泳結果，2為引物zu2\zd2擴增片段電泳結果，3為引物zu3\zd3擴增片段電泳結果。

圖3金線蓮與b.finlaysoniana中pal基因相似性比對圖。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容作進一步的詳細描述。

但不應該將此理解為本發(fā)明上述主題范圍僅限于下述實驗例。在不脫離本發(fā)明上述技術思想的情況下，根據(jù)本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在下述各項實驗例中，將金線蓮的苯丙氨酸解氨酶簡稱為anpal。通過實驗例，最終得到來源于金線蓮的苯丙氨酸解氨酶序列（如seqidno.1所示）。

實施例1

本實施例為金線蓮總葉片rna的提取和純化，總rna提取使用北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物rnaout2.0提取試劑盒，cat#90404-50，包括下述步驟。

估計組織細胞的用量。每次微量提取一般需要100-120mg植物葉片。

先將新鮮植物組織剪成小塊（保存在rnalocker中的植物組織需用紙吸取rnalocker液體后再剪成小塊），放入10-15ml塑料離心管中，加入1ml65℃預熱的溶液a（用前需要搖晃均勻），然后用勻漿器勻漿5-20s。勻漿時會產(chǎn)生泡沫，但不影響提取效果。也可以使用液氮現(xiàn)磨法破碎植物組織，現(xiàn)磨完成后加入1ml溶液a，但效果比較差，因為研缽本質(zhì)是二氧化硅，在溶液a存在時會吸附rna。

將勻漿物或研磨物轉移至干凈的1.5ml塑料離心管中（可以不必轉移非液體的細胞碎片）。有的植物組織（比如果實）含有大量水分，勻漿液會多于1ml，轉移時也只取1ml。

在離心管中加入0.3ml的溶液b和0.2自備氯仿，在震蕩器上震蕩30s混勻，此時溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器震蕩時必須使管底溶液震蕩起來。

室溫12000rpm離心3-5min，兩相間約有5mm厚的細胞破碎物。

將上清液（約0.6ml）轉移到另一干凈的1.5ml塑料離心管中，下層有機相和中間層含有dna、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，避免觸及吸取。最好留下100ul上清液不取。

加入等體積的溶液c，充分顛倒混勻。

將一半溶液轉移到離心吸附柱（60911b）中，12000rpm室溫離心半分鐘，棄穿透液。注意不要跟用于rna提取的吸附柱（60911d）混用。

將剩下的一般溶液轉移到同一離心吸附柱中，12000rpm室溫離心半分鐘，棄穿透液。

將0.7ml通用洗柱液加入到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心10-30s，并棄穿透液。

12000rpm室溫離心10s，以便除去殘留液體。

將10ul（10u）的rnase-freednase加入到50ul37℃預熱的dna膜反應液中，吹打混勻配制成dnase工作液。

將dnase工作液用37℃預熱1min，然后全部加入到離心吸附柱中，室溫放置5min。注意：5min一般足夠降解大多數(shù)情況下的dna污染。如果有dna沒有徹底降解（可能由于樣品中殘留的雜志抑制了dnase的活性），此步的保溫時間可以適當延長到10min或15min。

直接在離心吸附柱中加入0.7ml通用洗柱液，蓋上蓋后顛掉數(shù)次混勻。

1200rpm室溫離心半分鐘，并棄穿透液。

再加0.3ml通用洗柱液到離心吸附柱，12000rmp室溫離心半分鐘，棄穿透液。

12000rpm室溫離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留乙醇會影響到rna的使用。

將離心吸附柱轉移到rnase-free收集管中，加入30-50ulrna洗脫液，室溫放置1-2min。

12000rpm室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為rna樣品。本產(chǎn)品提供的離心吸附柱吸附力強，一次洗脫不能全部將膜上rna洗下，如有必要，可以再加入30-50ulrna洗脫液一次。

實施例2

本實施例為anpal基因片段的克隆，方法如下。

以上述實施例1所得的純化的金線蓮葉片總rna作為模板，使用takara公司3’-fullracecoresetver.2.0(code:d314)試劑盒中的3’raceadaptor進行反轉錄，得到的cdna第一鏈，以同為蘭科植物的薄葉龍船花序列為參考序列，設計三對引物zu1/zd1、zu2/zd2、zu3/zd3。

zu1:gcatccgattcgaaatcctg；

zd1:gtgaactctggcttcccctgc；

zu2:ggccgtcccaattccaaag；

zd2:cttcaatttgaggtccgagcc；

zu3:ctctccgctctgttttgcgag；

zd3:ctggtgttgtccatggagacg；

以前述的cdna第一鏈作為模板，以設計的引物zu1和zd1進行金線蓮的苯丙氨酸解氨酶cdna中間片段的擴增。

擴增體系為：

taqpluspcrmastermix20ul，

cdna模板2ul，

2*引物（zu和zd）2ul，

ddh2o16ul；

擴增程序為：

95℃，30min；

95℃，30s，59℃，30s，72℃，30s（30個循環(huán)）；

72℃，8min；12℃保溫。

以前述的cdna第一鏈作為模板，以設計的引物zu2和zd2進行金線蓮的苯丙氨酸解氨酶cdna中間片段的擴增。

擴增體系為：

taqpluspcrmastermix20ul，

cdna模板2ul，

2*引物（zu和zd）2ul，

ddh2o16ul；

擴增程序為：

95℃，30min；

95℃，30s，62℃，30s，72℃，30s（30個循環(huán)）；

72℃，8min；12℃保溫。

以前述的cdna第一鏈作為模板，以設計的引物zu3和zd3進行金線蓮的苯丙氨酸解氨酶cdna中間片段的擴增。

擴增體系為：

taqpluspcrmastermix20ul，

cdna模板2ul，

2*引物（zu和zd）2ul，

ddh2o16ul；

擴增程序為：

95℃，30min；

95℃，30s，60℃，30s，72℃，30s（30個循環(huán)）；

72℃，8min；12℃保溫。

取所得擴增產(chǎn)物20ul經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠100v電泳30min，goldenview染色后紫外線檢查擴增片段，結果如圖2所示。

擴增得到的產(chǎn)物為anpal基因cdna中間片段，通過包括下述步驟的方法克隆測序，得到三個片段序列如seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所述。

seqidno.2

gcatccgattcgaaatcctggaggccattaccagcctcctcaacagcaagattacgccttgcctgccgctgaggggaaccatcaccgcctccggcgatcttgttcctctatcttacattgcgggtgtcttaaccggccgtcccaattgcaaggctataacagccgacggtgttattgtcaacgcagtagaggccttccgtcttgcaggaatctctagcgggttcttcgatcttcagcccaaggaagggctcgcacttgtcaatggaaccgccgtcggctccggcttcgcctccattgtcctgttcgaggcaaacatcctcgccgttatggcagtggttctctctctctgttttgcgaggtgatgcaggggaagccagagttcac

seqidno.3

ggccgtcccaattgcaaggctataacagccgacggtgttattgtcaacgcagtagaggccttccgtcttgcaggaatctctagcgggttcttcgatcttcagcccaaggaagggctcgcacttgtcaatggaaccgccgtcggctccggcttcgcctccattgtcctgttcgaggcaaacatcctcgccgttatggcagtggttctctctctctgttttgcgaggtgatgcaggggaagccagagttcaccgaccacctcacccacaagctcaagcaccccccaggccagattgaggccgccgccaccatggagcacatactcgacggcagctcttacatgaagacggcgaagaagctccatgaactggaccctctccagaagccaaaacaggacagatacgctcttcgcacctcgccccaatggctcggccctcagattgaag

seqidno.4

ctctctctctgttttgcgaggtgatgcaggggaagccagagttcaccgaccacctcacccacaagctcaagcaccccccaggccagattgaggccgccgccaccatggagcacatactcgacggcagctcttacatgaagacggcgaagaagctccatgaactggaccctctccagaagccaaaacaggacagatacgctcttcgcacctcgccccaatggctcggccctcagattgaagtcatacgagctgcgacgaaatcaatcgaaagagagatcaactccgtcaacgacaaccccctcatcgatgtctcgaggaataaagctctccatggcgaaaatttccaaggaacccccattggcgtctccatggacaacaccag

目的片段的回收：

將擴增出來的特異條帶用干凈的刀片在紫外燈下快而準的從瓊脂糖中挖出，置于1.5ml離心管中，用凝膠回收試劑盒（omega公司的e.z.n.a.tmgelextractionkit）回收膠中的dna片段。

連接反應：

將回收的dna片段克隆與takara公司的pmd19-t載體中。連接反應采用連接試劑盒（takara公司），連接體系總體積10ul，16℃連接過夜。

感受態(tài)細胞的制備：

從lb平板上挑取新活化的e.colidh5a單菌落，接種于3-5mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，225r/min振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長后期。將該菌液懸浮液以1：:10-1:50的比例接種于100mllb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3h至od600=0.35-0.5左右。

將培養(yǎng)液轉入離心管，冰上放置10min，然后于4℃下3000r/min離心10min.

棄去上清，用預冷的0.05mol/l的cacl2溶液10ml輕輕懸浮細胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000r/min離心10min。

棄上清，加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細胞懸浮液。

感受態(tài)細胞分裝成100ul的小份，貯存于-70℃可保存半年。

質(zhì)粒dna的轉化：

從-70℃冰箱中取出一管大腸桿菌感受態(tài)細胞dh5a，置于冰上融化。

在無菌條件下加入10ml連接反應液，輕輕震蕩混勻后，在冰上放置30min。

42℃水浴熱擊90s，不要搖動，之后迅速放入冰浴冷卻2-3min.

加入890ul無amp的lb液體培養(yǎng)基，混勻后，37℃、150r/min搖床振搖培養(yǎng)，溫育1h。

取100ul已轉化的菌液涂于一個lbamp的培養(yǎng)平板上，正面朝上放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，用封口膜封住，然后倒轉培養(yǎng)皿，37℃避光培養(yǎng)12-16h；隨后篩選陽性菌落。

重組菌落的鑒定和保存

從外觀上看，一般白色且圓的菌落為陽性，通過菌液pcr進行進一步鑒定。

在過夜培養(yǎng)的平板上用滅菌的小槍頭挑取幾個白色菌落，分別點種于0.1g/lamp的lb液體培養(yǎng)基的1.5ml離心管中，37℃，150r/min振搖培養(yǎng)4-6h。

取1ul菌懸液作為模板，用引物zu1/zd3進行pcr擴增，pcr反應條件中裂解時間延長至5min，用1%的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。如果產(chǎn)物為目的條帶時，此菌落為陽性克隆，否則為陰性。同時設不加菌懸液的陰性對照。

取已經(jīng)鑒定的陽性克隆的菌落懸浮液750ul，加入250ul的滅菌甘油，混勻后，用液氮速凍，置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

最后送英俊生物技術公司測序，所得序列在ncbi的blastn進行比對分析，驗證克隆片段正確。

實施例3

本實施例為anpal基因克隆，方法如下。

將上述實施例2所得三個片段進行拼接，得到金線蓮苯丙氨酸解氨酶基因序列，通過ncbi里orffinder工具分析開放閱讀框，并使用設計上游引物zu1和下游zd3如下：

zu1：gcatccgattcgaaatcctg；

zd3：ctggtgttgtccatggagacg。

以拼接得到的cdna全長為模板，以上游引物zu和zd進行pcr擴增。

擴增體系為：

dntpmixture(2.5mmeach)4ul，

2*引物(zu1/zd3)1ul，

cdna模板1ul，

5*primestarbuffer(mg2+plus)0.5ul，

primestarhsdnaploymerase0.5ul，

ddh2o32.5ul；

擴增程序為：

98℃，30s；60℃，30s；72℃，1min30s(30個循環(huán))，12℃保溫。

取所得擴增產(chǎn)物經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠100v電泳30min，goldenview染色后紫外線檢查擴增片段，結果如圖1所示。

擴增得到的產(chǎn)物為anpal基因cdna中間片段，通過包括下述步驟的方法克隆測序，得到片段序列如seqidno.1所述。

克隆測序參照實驗例2的測序方法，將電泳檢測后的產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收，再將回收的產(chǎn)物克隆到19-t載體上，轉化e.colidh5a感受態(tài)細胞，以zu1和zd3為引物，經(jīng)菌液pcr驗證后，將菌液松英俊生物技術公司測序。

實施例4

本實施例為anpal基因序列比對，方法如下。

將實施例3得到的序列seqidno.1在nationalcenterforbiotechnologyinformation（cnbi，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）中比對，其中有643個核苷酸序列與b.finlaysonianamrnaforphenylalanineammonia-lyase成功匹配，具體如圖3所示。因此可以分析得知，本發(fā)明序列seqidno.1屬于苯丙氨酸解氨酶基因。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>三明學院

<120>一種來源于金線蓮的苯丙氨酸解氨酶基因

<130>10

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>720

<212>dna

<213>序列1

<400>1

gcatccgattcgaaatcctggaggccattaccagcctcctcaacagcaagattacgcctt60

gcctgccgctgaggggaaccatcaccgcctccggcgatcttgttcctctatcttacattg120

cgggtgtcttaaccggccgtcccaattgcaaggctataacagccgacggtgttattgtca180

acgcagtagaggccttccgtcttgcaggaatctctagcgggttcttcgatcttcagccca240

aggaagggctcgcacttgtcaatggaaccgccgtcggctccggcttcgcctccattgtcc300

tgttcgaggcaaacatcctcgccgttatggcagtggttctctctctctgttttgcgaggt360

gatgcaggggaagccagagttcaccgaccacctcacccacaagctcaagcaccccccagg420

ccagattgaggccgccgccaccatggagcacatactcgacggcagctcttacatgaagac480

ggcgaagaagctccatgaactggaccctctccagaagccaaaacaggacagatacgctct540

tcgcacctcgccccaatggctcggccctcagattgaagtcatacgagctgcgacgaaatc600

aatcgaaagagagatcaactccgtcaacgacaaccccctcatcgatgtctcgaggaataa660

agctctccatggcgaaaatttccaaggaacccccattggcgtctccatggacaacaccag720

<210>2

<211>384

<212>dna

<213>序列2

<400>2

gcatccgattcgaaatcctggaggccattaccagcctcctcaacagcaagattacgcctt60

gcctgccgctgaggggaaccatcaccgcctccggcgatcttgttcctctatcttacattg120

cgggtgtcttaaccggccgtcccaattgcaaggctataacagccgacggtgttattgtca180

acgcagtagaggccttccgtcttgcaggaatctctagcgggttcttcgatcttcagccca240

aggaagggctcgcacttgtcaatggaaccgccgtcggctccggcttcgcctccattgtcc300

tgttcgaggcaaacatcctcgccgttatggcagtggttctctctctctgttttgcgaggt360

gatgcaggggaagccagagttcac384

<210>3

<211>444

<212>dna

<213>序列3

<400>3

ggccgtcccaattgcaaggctataacagccgacggtgttattgtcaacgcagtagaggcc60

ttccgtcttgcaggaatctctagcgggttcttcgatcttcagcccaaggaagggctcgca120

cttgtcaatggaaccgccgtcggctccggcttcgcctccattgtcctgttcgaggcaaac180

atcctcgccgttatggcagtggttctctctctctgttttgcgaggtgatgcaggggaagc240

cagagttcaccgaccacctcacccacaagctcaagcaccccccaggccagattgaggccg300

ccgccaccatggagcacatactcgacggcagctcttacatgaagacggcgaagaagctcc360

atgaactggaccctctccagaagccaaaacaggacagatacgctcttcgcacctcgcccc420

aatggctcggccctcagattgaag444

<210>4

<211>382

<212>dna

<213>序列

<400>4

ctctctctctgttttgcgaggtgatgcaggggaagccagagttcaccgaccacctcaccc60

acaagctcaagcaccccccaggccagattgaggccgccgccaccatggagcacatactcg120

acggcagctcttacatgaagacggcgaagaagctccatgaactggaccctctccagaagc180

caaaacaggacagatacgctcttcgcacctcgccccaatggctcggccctcagattgaag240

tcatacgagctgcgacgaaatcaatcgaaagagagatcaactccgtcaacgacaaccccc300

tcatcgatgtctcgaggaataaagctctccatggcgaaaatttccaaggaacccccattg360

gcgtctccatggacaacaccag382

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gcatccgattcgaaatcctg20

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gtgaactctggcttcccctgc21

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

ggccgtcccaattccaaag19

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cttcaatttgaggtccgagcc21

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

ctctccgctctgttttgcgag21

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

ctggtgttgtccatggagacg21