本發(fā)明涉及生物技術(shù)及醫(yī)學領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種用于NKT細胞培養(yǎng)的融合蛋白、編碼基因及應(yīng)用，用以制備高增殖活性、高殺傷活性的NKT細胞。
背景技術(shù)：
：癌癥發(fā)病率從有記錄以來，一直呈上升的趨勢，特別是過去二三十年以來，以每年3％-5％的速度增長。全球新增癌癥病例有近一半出現(xiàn)在亞洲，其中大部分在中國。全國每分鐘約6人確診癌癥。近年來，隨著分子生物學和免疫學等學科的飛速發(fā)展，腫瘤的細胞免疫治療已成為繼手術(shù)、放療、化療后另一種新的腫瘤治療模式。細胞免疫治療作為治療腫瘤的新技術(shù)手段，是通過分離、活化、體外大量培養(yǎng)患者自身的抗腫瘤免疫細胞，再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，用患者自身的腫瘤殺傷細胞去消滅腫瘤。該治療方法以安全有效、副作用小、提高機體免疫力、殺傷微小殘留癌細胞、預(yù)防腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移等特點在臨床應(yīng)用上得到大力發(fā)展。此類免疫細胞的種類包括細胞因子誘導的殺傷性細胞(CIK細胞)，自然殺傷細胞(NK細胞)，腫瘤浸潤的淋巴細胞(TIL)，細胞毒性淋巴細胞(CTL細胞)等。傳統(tǒng)意義上我們認為免疫系統(tǒng)中主要的直接對抗腫瘤的細胞有兩種，即NK細胞和T細胞，而NKT細胞是NK細胞和T細胞的綜合體，同時具有NK細胞的非特異性殺傷功能和T細胞的特異性殺傷功能。NKT細胞的主要特征為T細胞受體(TCR)基因表達的恒定性、CD1d的限制性以及細胞因子產(chǎn)生的迅速、高水平性。NKT細胞既能增強免疫反應(yīng)又能抑制免疫反應(yīng)，從而在抗腫瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中發(fā)揮重要作用。細胞間粘附分子-1(intercellularcelladhesionmolecule-1，ICAM1-1)是一種重要的細胞粘附分子，是介導細胞與細胞或細胞與外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的膜表面糖蛋白。細胞黏連，生長，遷移，分化，凋亡的過程中扮演重要角色，且在傷口愈合，免疫應(yīng)答，胚胎發(fā)育，腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列過程中至關(guān)重要。Rothlein等于1986年在研究淋巴細胞粘附時第一次發(fā)現(xiàn)ICAM1-1促黏連的作用。ICAM-1的分子量介于76-114kDa,其中核心區(qū)域為55kDa。黏附因子多以受體配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用。淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocytefunctionalantigen-1，LFA-1)是ICAM1-1的主要受體。經(jīng)文獻查詢和序列比對，ICAM1-1N段Q28-T207的180個氨基酸為主要功能序列，在ICAM1-1與LFA-1分子結(jié)合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用并保持了其生物活性。纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是一種位于細胞外基質(zhì)中的多功能高分子糖蛋白，分子量約440KD。FN廣泛存在于動物組織和組織液中，并在進化過程中保守性很強。FN的表達，降解和組織結(jié)構(gòu)的異常與一系列生理病變相關(guān)，包括癌癥,糖尿病及纖維癥。在FN的多功能中，其重要功能之一是促進細胞的黏連生長。細胞的黏連是機體結(jié)構(gòu)得以維持，細胞生長的必要條件。FN因此作為細胞培養(yǎng)的基質(zhì)，促進多種細胞的貼壁。由于FN分子量大，全分子表達存在基因工程上的困難,因此FN多以功能多肽的形式被研究。美國專利第5198423號中指出FN含有三個關(guān)鍵的功能結(jié)構(gòu)域，即細胞結(jié)合域(cellbindingdomain)、肝素結(jié)合域(heparindomain)和CS-1區(qū)域。該多肽可參與細胞黏附，分化增值的主要生理功能。該多肽能夠與T細胞表面的整合素家族成員相結(jié)合，同時加入抗CD3抗體與T細胞的抗原受體相結(jié)合，兩者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，然后通過Ras途徑刺激T細胞的增殖和分化。在現(xiàn)有的外周血淋巴細胞制備方法中，淋巴細胞體外增殖的效率十分關(guān)鍵。如何提高外周血單個核細胞體外擴增效率依然是目前本領(lǐng)域尚待優(yōu)化的主要問題。另一方面，NKT細胞中主要的效應(yīng)是CD3/CD56雙陽性細胞，因此在提高細胞增殖數(shù)量的基礎(chǔ)上，提高CD3/CD56雙陽性細胞的比例顯得同樣重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中外周血單個核細胞(PBMC)體外擴增效率及NKT細胞中CD3/CD56雙陽性細胞所占比例均偏低的問題，本發(fā)明提供一種用于NKT細胞培養(yǎng)的融合蛋白、編碼基因及應(yīng)用，用以提高人體外周血單個核細胞體外擴增效率和NKT細胞中CD3/CD56雙陽性細胞所占比例。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)手段得以實現(xiàn)：提供一種用于NKT細胞培養(yǎng)的融合蛋白，是如下a)或b)的蛋白：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且與用于NKT細胞培養(yǎng)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供所述融合蛋白的編碼基因。本發(fā)明提供的所述編碼基因是如下1)或2)或3)的基因：1)其核苷酸序列是序列表中序列1；2)在嚴格條件下與序列1限定的DNA片段雜交且編碼與用于NKT細胞培養(yǎng)相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且編碼與用于NKT細胞培養(yǎng)相關(guān)蛋白的DNA分子。本發(fā)明還提供所述編碼基因的重組表達載體。本發(fā)明還提供所述融合蛋白、所述編碼基因、所述重組表達載體在NKT細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種人NKT細胞的體外制備方法，包括如下步驟：S100、包被細胞培養(yǎng)瓶：用杜氏磷酸鹽緩沖液配制包被液，所述包被液包括CD3單克隆抗體1-10μg/ml、如權(quán)利要求1中所述的融合蛋白5-25μg/ml；將所述包被液加入培養(yǎng)瓶中避光放置8-24h；S200、單個核細胞的制備：抽取人體外周血，使用淋巴細胞分離液分離得到單個核細胞，使用含有自體血漿、人CD3單克隆抗體的淋巴培養(yǎng)液重懸細胞得到細胞懸液；S300、NKT細胞的誘導擴增：移除包被液，加入所述細胞懸液至細胞培養(yǎng)瓶后，添加細胞因子形成持續(xù)的刺激，置于CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)獲得NKT細胞。在本發(fā)明提供的人NKT細胞的體外制備方法中，所述步驟S100中，所述包被液中所述融合蛋白的濃度為10-15μg/ml、所述人CD3單克隆抗體的濃度為4-7μg/ml；取包被液10ml，加入到75cm2培養(yǎng)瓶中，4℃避光放置過夜，備用。在本發(fā)明提供的人NKT細胞的體外制備方法中，所述步驟S200中，所述單個核細胞用DPBS清洗兩次，顯微鏡下觀察計數(shù)，使用含5％自體血漿、50ng/ml人CD3單克隆抗體的淋巴細胞培養(yǎng)液GT-T551重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞密度3×106個/ml。在本發(fā)明提供的人NKT細胞的體外制備方法中，所述步驟S300包括如下步驟：S301、移除包被液，用10mlDPBS輕輕漂洗一次，再用10mlGT-T551輕輕漂洗一次；S302、加入所述細胞懸液至該培養(yǎng)瓶，然后加入重組人干擾素-γ至終濃度為500-1000IU/ml，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；S303、分別加入重組人白介素-2至終濃度為500-1000IU/ml、重組人白介素12至終濃度5-50ng/ml、白介素15至終濃度5-50ng/ml；之后每3天向該細胞培養(yǎng)瓶中補加細胞培養(yǎng)液，補加的細胞培養(yǎng)液為含有0.5％自體血漿、50ng/ml的人CD3單克隆抗體、1000IU/ml重組人白介素-2、10ng/ml重組人白介素12、10ng/ml重組人白介素15的GT-T551培養(yǎng)基。在本發(fā)明提供的人NKT細胞的體外制備方法中，所述步驟S303中，分別加入重組人白介素-2至終濃度為1000IU/ml、重組人白介素12至終濃度10ng/ml、白介素15至終濃度10ng/ml。本發(fā)明的融合蛋白ICAM1-FN用于NKT細胞培養(yǎng)，并在細胞培養(yǎng)全過程中加入人CD3單克隆抗體，重組人白介素2，白介素12，白介素15，更好的刺激了淋巴細胞的增殖，同時提高CD3/CD56雙陽性細胞所占比例，從而使得外周血單個核細胞體外擴增效率是傳統(tǒng)方法的2倍，所得細胞中CD3/CD56雙陽性細胞所占比例是傳統(tǒng)方法的2-10倍，增強了NKT細胞的殺瘤活性，本發(fā)明的NKT細胞制備方法相對于傳統(tǒng)方法殺瘤活性提高15-35％。附圖說明圖1為IPTG誘導前后及不同濃度IPTG誘導的BL21表達的ICAM1-FN融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖；A為純化前，B為純化后；圖2為ICAM1-FN融合蛋白表達的WesternBlot檢測結(jié)果；圖3為實施例1中NKT細胞生長曲線；圖4為PI染色檢測NKT細胞活率的流式細胞檢測圖譜；圖5為實施例1和對比實施例1中得到的NKT細胞的表型流式細胞檢測圖譜；其中，A為對比實施例1中得到的NKT檢測結(jié)果；B為實施例1得到的NKT檢測結(jié)果；圖6為實施例(A)和對比例(B)中得到的NKT細胞的殺瘤活性檢測結(jié)果圖；其中，A為對比實施例1中得到的NKT殺傷效率；B為實施例1得到的NKT殺傷效率。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明的實施方案中構(gòu)建了人細胞間粘附分子-1(ICAM1-1)功能結(jié)構(gòu)域(Q28-T207)和人纖連蛋白(Fibronectin)功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白ICAM1-FN，并在大腸桿菌BL21進行表達純化。經(jīng)優(yōu)化劑量的重組ICAM1-FN蛋白與人源CD3單克隆抗體包被細胞培養(yǎng)瓶，用于培養(yǎng)人體外周血分離出的單個核細胞。在單個核細胞(PBMC)的培養(yǎng)過程中，于細胞培養(yǎng)液中加入少于包被濃度的人CD3單克隆抗體進行持續(xù)刺激。誘導10-13天后得到NKT細胞，檢測并確定各項指標均可達到NKT細胞標準。本發(fā)明的實施方案中重組ICAM1-FN蛋白遵循分子克隆指南，本發(fā)明實施例提供一種人NKT細胞的體外制備方法，包括一種在NKT細胞的前體細胞培養(yǎng)前用中含有有效量的ICAM1-FN融合蛋白和人CD3單克隆抗體的包被液包被細胞培養(yǎng)瓶的步驟，和在所述人細胞因子誘導的殺傷細胞的誘導及培養(yǎng)全過程中在細胞培養(yǎng)液中添加人CD3單克隆抗體，重組人白介素2，白介素12，白介素15的步驟；其中所述融合蛋白為人細胞間粘附分子-1(ICAM-1)功能結(jié)構(gòu)域和人纖連蛋白(Fibronectin)功能結(jié)構(gòu)域融合蛋白。所述人CD3單克隆抗體在所述細胞培養(yǎng)液中的濃度低于在所述包被液中的濃度。本發(fā)明的NKT細胞制備方法在包被階段引入了融合蛋白ICAM1-FN，使淋巴細胞在貼壁生長中得到有效的刺激。本發(fā)明且在細胞培養(yǎng)全過程中加入人CD3單克隆抗體，重組人白介素2，白介素12，白介素15，以形成持續(xù)的誘導刺激。該實施例方法優(yōu)化了外周血單個核細胞體外擴增效率以及得到的NKT細胞中CD3/CD56雙陽性細胞所占比例。因而增強了NKT細胞的殺瘤活性，有希望提高細胞免疫治療的效果。優(yōu)選地，本發(fā)明實施例的人NKT細胞體外制備方法中，所述細胞培養(yǎng)瓶的包被液中，所述融合蛋白濃度為5-25μg/ml，優(yōu)選濃度為10-15μg/ml，所述人CD3單克隆抗體濃度為1-10μg/ml，優(yōu)選濃度為4-7μg/ml，最優(yōu)選濃度為5μg/ml。重組人白介素2的濃度為500-1000IU/ml，最優(yōu)選濃度為1000IU/ml，白介素12的濃度為5-50ng/ml，最優(yōu)選濃度為10ng/ml，白介素15的濃度為5-50ng/ml，最優(yōu)選濃度為10ng/ml。優(yōu)選地，NKT細胞體外制備中，所述細胞培養(yǎng)液中人CD3單克隆抗體濃度為50-100ng/ml。優(yōu)選地，本發(fā)明實施例的人NKT細胞體外制備方法中，所述融合蛋白中人細胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域(ICAM1-1)和人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域(FN)通過柔性肽連接，所述柔性肽序列為GGGGSGGGGS。優(yōu)選地，本發(fā)明實施例的人NKT細胞體外制備方法中，所述含有柔性肽的人細胞間粘附分子-1功能結(jié)構(gòu)域和人纖連蛋白功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的DNA序列為序列表中序列2。具體序列如下，其中下劃線且加大部分為柔性肽GGGGSGGGGS的cDNA序列：ATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCCGCGCTGCCCGCACTCCTGGTCCTGCTCGGGGCTCTGTTCCCAGGACCTGGCAATGCCCAGACATCTGTGTCCCCCTCAAAAGTCATCCTGCCCCGGGGAGGCTCCGTGCTGGTGACATGCAGCACCTCCTGTGACCAGCCCAAGTTGTTGGGCATAGAGACCCCGTTGCCTAAAAAGGAGTTGCTCCTGCCTGGGAACAACCGGAAGGTGTATGAACTGAGCAATGTGCAAGAAGATAGCCAACCAATGTGCTATTCAAACTGCCCTGATGGGCAGTCAACAGCTAAAACCTTCCTCACCGTGTACTGGACTCCAGAACGGGTGGAACTGGCACCCCTCCCCTCTTGGCAGCCAGTGGGCAAGAACCTTACCCTACGCTGCCAGGTGGAGGGTGGGGCACCCCGGGCCAACCTCACCGTGGTGCTGCTCCGTGGGGAGAAGGAGCTGAAACGGGAGCCAGCTGTGGGGGAGCCCGCTGAGGTCACGACCACGGTGCTGGTGAGGAGAGATCACCATGGAGCCAATTTCTCGTGCCGCACTGAACTGGACCTGCGGCCCCAAGGGCTGGAGCTGTTTGAGAACACCTCGGCCCCCTACCTTAGGGGTCCGGGGCCCGGGCTGCTGCTGCTGGCCGTCCTGTGCCTGGGGACAGCGGTGCCCTCCACGGGAGCCTCGAAGAGCAAGAGGCAGGCTCAGCAAATGGTTCAGCCCCAGTCCCCGGTGGCTGTCAGTCAAAGCAAGCCCGGTTGTTATGACAATGGAAAACACTATCAGATAAATCAACAGTGGGAGCGGACCTACCTAGGCAATGCGTTGGTTTGTACTTGTTATGGAGGAAGCCGAGGTTTTAACTGCGAGAGTAAACCTGAAGCTGAAGAGACTTGCTTTGACAAGTACACTGGGAACACTTACCGAGTGGGTGACACTTATGAGCGTCCTAAAGACTCCATGATCTGGGACTGTACCTGCATCGGGGCTGGGCGAGGGAGAATAAGCTGTACCATCGCAAACCGCTGCCATGAAGGGGGTCAGTCCTACAAGATTGGTGACACCTGGAGGAGACCACATGAGACTGGTGGTTACATGTTAGAGTGTGTGTGTCTTGGTAATGGAAAAGGAGAATGGACCTGCAAGCCCATAGCTGAGAAGTGTTTTGATCATGCTGCTGGGACTTCCTATGTGGTCGGAGAAACGTGGGAGAAGCCCTACCAAGGCTGGATGATGGTAGATTGTACTTGCCTGGGAGAAGGCAGCGGACGCATCACTTGCACTTCTAGAAATAGATGCAACGATCAGGACACAAGGACATCCTATAGAATTGGAGACACCTGGAGCAAGAAGGATAATCGAGGAAACCTGCTCCAGTGCATCTGCACAGGCAACGGCCGAGGAGAGTGGAAGTGTGAGAGGCACACCTCTGTGCAGACCACATCGAGCGGATCTGGCCCCTTCACCGATGTTCGTGCAGCTGTTTACCAACCGCAGCCTCACCCCCAGCCTCCTCCCTATGGCCACTGTGTCACAGACAGTGGTGTGGTCTACTCTGTGGGGATGCAGTGGCTGAAGACACAAGGAAATAAGCAAATGCTTTGCACGTGCCTGGGCAACGGAGTCAGCTGCCAAGAGACAGCTGTAACCCAGACTTACGGTGGCAACTCAAATGGAGAGCCATGTGTCTTACCATTCACCTACAATGGCAGGACGTTCTACTCCTGCACCACAGAAGGGCGACAGGACGGACATCTTTGGTGCAGCACAACTTCGAATTATGAGCAGGACCAGAAATACTCTTTCTGCACAGACCACACTGTTTTGGTTCAGACTCGAGGAGGAAATTCCAATGGTGCCTTGTGCCACTTCCCCTTCCTATACAACAACCACAATTACACTGATTGCACTTCTGAGGGCAGAAGAGACAACATGAAGTGGTGTGGGACCACACAGAACTATGATGCCGACCAGAAGTTTGGGTTCTGCCCCATGGCTGCCCACGAGGAAATCTGCACAACCAATGAAGGGGTCATGTACCGCATTGGAGATCAGTGGGATAAGCAGCATGACATGGGTCACATGATGAGGTGCACGTGTGTTGGGAATGGTCGTGGGGAATGGACATGCATTGCCTACTCGCAGCTTCGAGATCAGTGCATTGTTGATGACATCACTTACAATGTGAACGACACATTCCACAAGCGTCATGAAGAGGGGCACATGCTGAACTGTACATGCTTCGGTCAGGGTCGGGGCAGGTGGAAGTGTGATCCCGTCGACCAATGCCAGGATTCAGAGACTGGGACGTTTTATCAAATTGGAGATTCATGGGAGAAGTATGTGCATGGTGTCAGATACCAGTGCTACTGCTATGGCCGTGGCATTGGGGAGTGGCATTGCCAACCTTTACAGACCTATCCAAGCTCAAGTGGTCCTGTCGAAGTATTTATCACTGAGACTCCGAGTCAGCCCAACTCCCACCCCATCCAGTGGAATGCACCACAGCCATCTCACATTTCCAAGTACATTCTCAGGTGGAGACCTGTGAGTATCCCACCCAGAAACCTTGGATAC優(yōu)選地，在所述融合蛋白的構(gòu)建過程中，所述人細胞間粘附分子-1及人纖連蛋白由PCR法得到拼接到一起的目的基因序列為序列表中序列1。具體序列如下：MAPSSPRPALPALLVLLGALFPGPGNAQTSVSPSKVILPRGGSVLVTCSTSCDQPKLLGIETPLPKKELLLPGNNRKVYELSNVQEDSQPMCYSNCPDGQSTAKTFLTVYWTPERVELAPLPSWQPVGKNLTLRCQVEGGAPRANLTVVLLRGEKELKREPAVGEPAEVTTTVLVRRDHHGANFSCRTELDLRPQGLELFENTSAPYGGGGSGGGGSLRGPGPGLLLLAVLCLGTAVPSTGASKSKRQAQQMVQPQSPVAVSQSKPGCYDNGKHYQINQQWERTYLGNALVCTCYGGSRGFNCESKPEAEETCFDKYTGNTYRVGDTYERPKDSMIWDCTCIGAGRGRISCTIANRCHEGGQSYKIGDTWRRPHETGGYMLECVCLGNGKGEWTCKPIAEKCFDHAAGTSYVVGETWEKPYQGWMMVDCTCLGEGSGRITCTSRNRCNDQDTRTSYRIGDTWSKKDNRGNLLQCICTGNGRGEWKCERHTSVQTTSSGSGPFTDVRAAVYQPQPHPQPPPYGHCVTDSGVVYSVGMQWLKTQGNKQMLCTCLGNGVSCQETAVTQTYGGNSNGEPCVLPFTYNGRTFYSCTTEGRQDGHLWCSTTSNYEQDQKYSFCTDHTVLVQTRGGNSNGALCHFPFLYNNHNYTDCTSEGRRDNMKWCGTTQNYDADQKFGFCPMAAHEEICTTNEGVMYRIGDQWDKQHDMGHMMRCTCVGNGRGEWTCIAYSQLRDQCIVDDITYNVNDTFHKRHEEGHMLNCTCFGQGRGRWKCDPVDQCQDSETGTFYQIGDSWEKYVHGVRYQCYCYGRGIGEWHCQPLQTYPSSSGPVEVFITETPSQPNSHPIQWNAPQPSHISKYILRWRPVSIPPRNLGY使用三字母表示氨基酸，則具體序列如下：MetAlaProSerSerProArgProAlaLeuProAlaLeuLeuValLeuLeuGlyAlaLeuPheProGlyProGlyAsnAlaGlnThrSerValSerProSerLysValIleLeuProArgGlyGlySerValLeuValThrCysSerThrSerCysAspGlnProLysLeuLeuGlyIleGluThrProLeuProLysLysGluLeuLeuLeuProGlyAsnAsnArgLysValTyrGluLeuSerAsnValGlnGluAspSerGlnProMetCysTyrSerAsnCysProAspGlyGlnSerThrAlaLysThrPheLeuThrValTyrTrpThrProGluArgValGluLeuAlaProLeuProSerTrpGlnProValGlyLysAsnLeuThrLeuArgCysGlnValGluGlyGlyAlaProArgAlaAsnLeuThrValValLeuLeuArgGlyGluLysGluLeuLysArgGluProAlaValGlyGluProAlaGluValThrThrThrValLeuValArgArgAspHisHisGlyAlaAsnPheSerCysArgThrGluLeuAspLeuArgProGlnGlyLeuGluLeuPheGluAsnThrSerAlaProTyrGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerLeuArgGlyProGlyProGlyLeuLeuLeuLeuAlaValLeuCysLeuGlyThrAlaValProSerThrGlyAlaSerLysSerLysArgGlnAlaGlnGlnMetValGlnProGlnSerProValAlaValSerGlnSerLysProGlyCysTyrAspAsnGlyLysHisTyrGlnIleAsnGlnGlnTrpGluArgThrTyrLeuGlyAsnAlaLeuValCysThrCysTyrGlyGlySerArgGlyPheAsnCysGluSerLysProGluAlaGluGluThrCysPheAspLysTyrThrGlyAsnThrTyrArgValGlyAspThrTyrGluArgProLysAspSerMetIleTrpAspCysThrCysIleGlyAlaGlyArgGlyArgIleSerCysThrIleAlaAsnArgCysHisGluGlyGlyGlnSerTyrLysIleGlyAspThrTrpArgArgProHisGluThrGlyGlyTyrMetLeuGluCysValCysLeuGlyAsnGlyLysGlyGluTrpThrCysLysProIleAlaGluLysCysPheAspHisAlaAlaGlyThrSerTyrValValGlyGluThrTrpGluLysProTyrGlnGlyTrpMetMetValAspCysThrCysLeuGlyGluGlySerGlyArgIleThrCysThrSerArgAsnArgCysAsnAspGlnAspThrArgThrSerTyrArgIleGlyAspThrTrpSerLysLysAspAsnArgGlyAsnLeuLeuGlnCysIleCysThrGlyAsnGlyArgGlyGluTrpLysCysGluArgHisThrSerValGlnThrThrSerSerGlySerGlyProPheThrAspValArgAlaAlaValTyrGlnProGlnProHisProGlnProProProTyrGlyHisCysValThrAspSerGlyValValTyrSerValGlyMetGlnTrpLeuLysThrGlnGlyAsnLysGlnMetLeuCysThrCysLeuGlyAsnGlyValSerCysGlnGluThrAlaValThrGlnThrTyrGlyGlyAsnSerAsnGlyGluProCysValLeuProPheThrTyrAsnGlyArgThrPheTyrSerCysThrThrGluGlyArgGlnAspGlyHisLeuTrpCysSerThrThrSerAsnTyrGluGlnAspGlnLysTyrSerPheCysThrAspHisThrValLeuValGlnThrArgGlyGlyAsnSerAsnGlyAlaLeuCysHisPheProPheLeuTyrAsnAsnHisAsnTyrThrAspCysThrSerGluGlyArgArgAspAsnMetLysTrpCysGlyThrThrGlnAsnTyrAspAlaAspGlnLysPheGlyPheCysProMetAlaAlaHisGluGluIleCysThrThrAsnGluGlyValMetTyrArgIleGlyAspGlnTrpAspLysGlnHisAspMetGlyHisMetMetArgCysThrCysValGlyAsnGlyArgGlyGluTrpThrCysIleAlaTyrSerGlnLeuArgAspGlnCysIleValAspAspIleThrTyrAsnValAsnAspThrPheHisLysArgHisGluGluGlyHisMetLeuAsnCysThrCysPheGlyGlnGlyArgGlyArgTrpLysCysAspProValAspGlnCysGlnAspSerGluThrGlyThrPheTyrGlnIleGlyAspSerTrpGluLysTyrValHisGlyValArgTyrGlnCysTyrCysTyrGlyArgGlyIleGlyGluTrpHisCysGlnProLeuGlnThrTyrProSerSerSerGlyProValGluValPheIleThrGluThrProSerGlnProAsnSerHisProIleGlnTrpAsnAlaProGlnProSerHisIleSerLysTyrIleLeuArgTrpArgProValSerIleProProArgAsnLeuGlyTyr以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的實現(xiàn)進行詳細描述。實施例11.ICAM1-FN質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)人的ICAM1-1和FN基因序列，設(shè)計兩對引物：人ICAM1-1的正向引物P1，反向引物P2；人FN的正向引物P3，反向引物P4。并通過兩步PCR獲得目的基因序列。引物序列如下：ICAM1-F：5′-CATCATCATCATCATCAGACATCTGTGTCCCC-3′ICAM1-R:5′–GTAGGGGGCCGAGGTGTT-CT-3′FN-F:5′-CTTAGGGGTCCGGGGCCCGG-GCT-3′FN-R:5′-AGACTGCAGGTCGACGTATCCAAGGTTTCTGGGTGGGATACTC-3′ICAM1-F引物5’端引入NdeI酶切位點(下劃線且斜體部分)，ICAM1-R引物5’端引入編碼柔性肽的cDNA(下劃線加粗部分)，以含有人ICAM1-1cDNA序列的質(zhì)粒(購自O(shè)rigene)為模板。FN-F引物5’端引入柔性肽GGGGSGGGGS的cDNA序列(下劃線加粗部分)，F(xiàn)N-R引物5’端引入HindIII酶切位點(下劃線且斜體部分)，以購自O(shè)rigene的質(zhì)粒為模板，擴增人FN的功能區(qū)域。所得兩段基因序列分別以ICAM1和FN命名。通過常規(guī)PCR得到。。PCR反應(yīng)體系如下:DNA模板20ng，100nM正向引物，100nM反向引物，Taq聚合酶0.5μl，緩沖液5μl，10mMdNTP，雙蒸水至50μl。PCR反應(yīng)條件如下：95度5分鐘，(94度30秒，57度30秒，72度45秒)，2-34循環(huán)，72度10分鐘，4度保存目的基因。ICAM1-FN與pGEM-T載體連接，構(gòu)建得到pGEMT-ICAM1-FN質(zhì)粒。重組質(zhì)粒在E.coliDH5a感受態(tài)細胞(Promega)中進行轉(zhuǎn)化孵育，再通過氨芐青霉素篩選處理后于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中再次孵育。用ICAM-1-F和FN-R引物對菌液進行PCR鑒定，PCR結(jié)束經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，具有目的基因條帶的菌液為陽性菌液，保存菌種，對質(zhì)粒進行測序鑒定。2.表達載體pColdII-ICAM1-FN的構(gòu)建及ICAM1-FN的表達用內(nèi)切酶NdeI、HindIII將ICAM-FN融合蛋白從質(zhì)粒pGEMT-ICAM1-FN中切除并克隆至pColdII質(zhì)粒，以用于蛋白表達。重組質(zhì)粒在感受態(tài)細胞BL21(DE)中進行轉(zhuǎn)化孵育。用ICAM-1-F和FN-R引物對菌液進行PCR鑒定并測序鑒定。經(jīng)測序鑒定的陽性菌接種至含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600達到0.6時加入0.1-1mM的IPTG進行低溫(15℃)誘導表達。分別在誘導前和誘導3h時取樣1ml，用于目的蛋白表達的檢測。3.目的蛋白的表達及鑒定收集誘導前和誘導3h的菌液各1ml，10000g，4℃，離心5min收集細胞沉淀，菌體沉淀用80μl細菌裂解液重懸，在樣品中加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴10min制備蛋白樣品。蛋白上樣于8％蛋白膠，目的蛋白分子量約為83kDa.蛋白膠(SDS-PAGE)結(jié)果見圖1A.如圖1A所示，目的蛋白以可溶蛋白形式表達。在不同濃度的IPTG誘導下表達量不同。最終選用0.5mMIPTG誘導3h,為目的蛋白表達的誘導條件。按照上述處理蛋白，進行western-blot(免疫印跡)檢測。檢測結(jié)果見圖2。陽性菌對應(yīng)孔道在分子量83kD處有條帶，而空白對照菌孔道無相應(yīng)條帶。4.重組ICAM1-FN的純化取轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pColdII-ICAM1-FN的陽性菌液10000g，4℃，離心5min，收集菌體。菌體重懸于細菌裂解液，冰浴超聲裂解菌體至菌液變澄清。將超聲破碎后的菌體懸液12000g，4℃，離心10min，收集上清液，上樣，用Ni2+-NTA柱親和層析純化目的蛋白，并先后用25和300mmol/L的咪唑進行洗脫。最終以pH7.5的PB進行透析，0.22μm的濾膜進行過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。將純化后的目的蛋白樣品進行SDS-PAGE檢測，檢測結(jié)果見圖1B。5.NKT細胞的制備杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)中加入含人CD3單克隆抗體5μg/ml，ICAM1-FN融合蛋白10μg/ml配置包被液。取包被液10ml，加入到75cm2培養(yǎng)瓶中，4℃避光放置過夜，備用。抽取健康志愿者外周血50ml，肝素抗凝，室溫離心(700g，20分)；吸取上層血漿，置于水浴鍋中56℃、30分。然后4℃靜止15分后，離心(900g，30分)，取自體血漿4℃保存?zhèn)溆?。取上?00g，20分離心后下部細胞成分，加入D-PBS至50ml，混勻，緩慢加到2個裝有20ml人淋巴細胞分離液的50ml離心管中，室溫離心(800g，15分)。吸取白膜層細胞，加入到裝有5ml的RPMI1640的50ml離心管中。加入RPMI1640至總體積為50ml，離心(600g，10分鐘)，棄上清。再次加入50mlRPMI，離心(600g，10分鐘)，棄上清。最后用含5％的上述制備的血漿、50ng/ml人CD3單克隆抗體的淋巴細胞培養(yǎng)液GT-T551重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞密度3×106個/ml。將包被過夜的75cm2培養(yǎng)瓶棄掉包被液，用10mlDPBS和10mlGT-T551各漂洗一次。并將上述得到的細胞懸液加入該75cm2培養(yǎng)瓶，然后加入終濃度為1000IU/ml的重組人干擾素-γ(INF-γ)，放入培養(yǎng)箱24h。24小時候分別加入加入：終濃度為1000IU/ml的重組人白介素-2(IL-2)，終濃度10ng/ml的重組人白介素12(IL-12)，終濃度10ng/ml的白介素15(IL-15)。并每3天向該細胞培養(yǎng)瓶中補含有GT-T551培養(yǎng)基，5％自體血漿，50ng/ml的人CD3單克隆抗體、1000IU/ml重組人白介素-2(IL-2)、10ng/ml重組人白介素12(IL-12)、10ng/ml重組人白介素15(IL-15)的細胞培養(yǎng)液。6.NKT細胞各項指標檢測細胞增殖分別于第0d、4d、8d、10d、12d對上述步驟中培養(yǎng)的細胞取樣，進行細胞計數(shù)，繪制細胞增殖曲線如圖3所示。于第12d對上述培養(yǎng)的細胞經(jīng)熒光染料PI(碘化丙啶)染色，通過流式細胞檢測得到NKT細胞的活率達到96％以上。檢測結(jié)果如圖4所示。于第12d對上述培養(yǎng)的細胞進行淋巴細胞表型檢測，檢查CD3+/CD56+細胞比例。BDCalibur流式細胞儀進行的檢測結(jié)果如圖5所示。上述步驟中第12d得到的NKT細胞與被CFSE(羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯)染色的腫瘤細胞K562混合培養(yǎng)一段時間后，用PI進行染色，其中CFSE和PI雙標記的細胞即為NKT細胞殺傷的腫瘤細胞。檢測結(jié)果如圖6所示。對比實施例1步驟1-4同實施例1。NKT細胞的制備過程中僅包被液成分與實施例不同。具體包被方法如下：取含有人CD3單克隆抗體5μg/ml及人FN活性片段10μg/ml的DPBS包被液10ml，加入到75cm2培養(yǎng)瓶中，4℃避光放置過夜，備用。實驗結(jié)果(1)細胞增殖檢測實施例1和對比實施例1中的細胞取樣計數(shù)結(jié)果如表1所示。繪制細胞生長曲線，如圖3所示。表1D0(*108)D5(*108)D8(*108)D10(*108)D12(*108)實施例10.31.10±0.1523.15±2.87143.68±4.92365.49±7.36對比實施例10.30.63±0.1220.81±4.7888.32±4.29224.37±7.90由表1及圖3可看出，本發(fā)明的方法制備的NKT細胞平均增殖倍數(shù)是1418.3±19.76；傳統(tǒng)方法制備的NKT細胞平均增殖倍數(shù)是747.9±18.40。本發(fā)明的方法制備的NKT細胞增殖活力明顯高于傳統(tǒng)方法，約為傳統(tǒng)方法的2倍。(2)細胞死亡率檢測實施例1中的細胞取樣經(jīng)熒光染料PI(碘化丙啶)染色，通過流式細胞檢測得到NKT細胞的活率達到96％以上，如圖4所示。(3)細胞表型檢測細胞表型的流式細胞儀檢測結(jié)果見圖5。本發(fā)明的方法制備的NKT細胞表型結(jié)果為：CD3+/CD56+T細胞比例為70-80％(圖5右，Data002)，傳統(tǒng)方法制備的NKT中CD3+/CD56+T細胞比例為30-40％(圖5左，Data001)。(4)NKT細胞殺瘤活性用BDCalibur流式細胞儀檢測分別由本發(fā)明的方法(實施例1)和傳統(tǒng)方法(對比實施例1)制備的NKT的殺瘤活性，檢測結(jié)果見圖6。在效靶比1：1的條件下，本發(fā)明的方法制備的NKT細胞殺瘤率為30-40％，傳統(tǒng)方法的NKT細胞殺瘤率為10-20％。本發(fā)明提供的細胞因子誘導的殺傷細胞的制備方法顯著增加了外周血單個核細胞體外擴增效率及NKT細胞中CD3/CD56雙陽性細胞所占比例，同時也提高了NKT細胞中CD3/CD8細胞的比例，并增強了NKT細胞的殺瘤活性。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。序列表<110>深圳中健生物技術(shù)有限公司<120>一種用于NKT細胞培養(yǎng)的融合蛋白、編碼基因及應(yīng)用<130><160>2<210>1<211>2619<212>DNA<213>人工序列<400>1ATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCCGCGCTGCCCGCACTCCTGGTCCTGCTCGGGGCTCTG60TTCCCAGGACCTGGCAATGCCCAGACATCTGTGTCCCCCTCAAAAGTCATCCTGCCCCGG120GGAGGCTCCGTGCTGGTGACATGCAGCACCTCCTGTGACCAGCCCAAGTTGTTGGGCATA180GAGACCCCGTTGCCTAAAAAGGAGTTGCTCCTGCCTGGGAACAACCGGAAGGTGTATGAA240CTGAGCAATGTGCAAGAAGATAGCCAACCAATGTGCTATTCAAACTGCCCTGATGGGCAG300TCAACAGCTAAAACCTTCCTCACCGTGTACTGGACTCCAGAACGGGTGGAACTGGCACCC360CTCCCCTCTTGGCAGCCAGTGGGCAAGAACCTTACCCTACGCTGCCAGGTGGAGGGTGGG420GCACCCCGGGCCAACCTCACCGTGGTGCTGCTCCGTGGGGAGAAGGAGCTGAAACGGGAG480CCAGCTGTGGGGGAGCCCGCTGAGGTCACGACCACGGTGCTGGTGAGGAGAGATCACCAT540GGAGCCAATTTCTCGTGCCGCACTGAACTGGACCTGCGGCCCCAAGGGCTGGAGCTGTTT600GAGAACACCTCGGCCCCCTACGGCGGTGGCGGTAGCGGTGGTGGTGGTTCTCTTAGGGGT660CCGGGGCCCGGGCTGCTGCTGCTGGCCGTCCTGTGCCTGGGGACAGCGGTGCCCTCCACG720GGAGCCTCGAAGAGCAAGAGGCAGGCTCAGCAAATGGTTCAGCCCCAGTCCCCGGTGGCT780GTCAGTCAAAGCAAGCCCGGTTGTTATGACAATGGAAAACACTATCAGATAAATCAACAG840TGGGAGCGGACCTACCTAGGCAATGCGTTGGTTTGTACTTGTTATGGAGGAAGCCGAGGT900TTTAACTGCGAGAGTAAACCTGAAGCTGAAGAGACTTGCTTTGACAAGTACACTGGGAAC960ACTTACCGAGTGGGTGACACTTATGAGCGTCCTAAAGACTCCATGATCTGGGACTGTACC1020TGCATCGGGGCTGGGCGAGGGAGAATAAGCTGTACCATCGCAAACCGCTGCCATGAAGGG1080GGTCAGTCCTACAAGATTGGTGACACCTGGAGGAGACCACATGAGACTGGTGGTTACATG1140TTAGAGTGTGTGTGTCTTGGTAATGGAAAAGGAGAATGGACCTGCAAGCCCATAGCTGAG1200AAGTGTTTTGATCATGCTGCTGGGACTTCCTATGTGGTCGGAGAAACGTGGGAGAAGCCC1260TACCAAGGCTGGATGATGGTAGATTGTACTTGCCTGGGAGAAGGCAGCGGACGCATCACT1320TGCACTTCTAGAAATAGATGCAACGATCAGGACACAAGGACATCCTATAGAATTGGAGAC1380ACCTGGAGCAAGAAGGATAATCGAGGAAACCTGCTCCAGTGCATCTGCACAGGCAACGGC1440CGAGGAGAGTGGAAGTGTGAGAGGCACACCTCTGTGCAGACCACATCGAGCGGATCTGGC1500CCCTTCACCGATGTTCGTGCAGCTGTTTACCAACCGCAGCCTCACCCCCAGCCTCCTCCC1560TATGGCCACTGTGTCACAGACAGTGGTGTGGTCTACTCTGTGGGGATGCAGTGGCTGAAG1620ACACAAGGAAATAAGCAAATGCTTTGCACGTGCCTGGGCAACGGAGTCAGCTGCCAAGAG1680ACAGCTGTAACCCAGACTTACGGTGGCAACTCAAATGGAGAGCCATGTGTCTTACCATTC1740ACCTACAATGGCAGGACGTTCTACTCCTGCACCACAGAAGGGCGACAGGACGGACATCTT1800TGGTGCAGCACAACTTCGAATTATGAGCAGGACCAGAAATACTCTTTCTGCACAGACCAC1860ACTGTTTTGGTTCAGACTCGAGGAGGAAATTCCAATGGTGCCTTGTGCCACTTCCCCTTC1920CTATACAACAACCACAATTACACTGATTGCACTTCTGAGGGCAGAAGAGACAACATGAAG1980TGGTGTGGGACCACACAGAACTATGATGCCGACCAGAAGTTTGGGTTCTGCCCCATGGCT2040GCCCACGAGGAAATCTGCACAACCAATGAAGGGGTCATGTACCGCATTGGAGATCAGTGG2100GATAAGCAGCATGACATGGGTCACATGATGAGGTGCACGTGTGTTGGGAATGGTCGTGGG2160GAATGGACATGCATTGCCTACTCGCAGCTTCGAGATCAGTGCATTGTTGATGACATCACT2220TACAATGTGAACGACACATTCCACAAGCGTCATGAAGAGGGGCACATGCTGAACTGTACA2280TGCTTCGGTCAGGGTCGGGGCAGGTGGAAGTGTGATCCCGTCGACCAATGCCAGGATTCA2340GAGACTGGGACGTTTTATCAAATTGGAGATTCATGGGAGAAGTATGTGCATGGTGTCAGA2400TACCAGTGCTACTGCTATGGCCGTGGCATTGGGGAGTGGCATTGCCAACCTTTACAGACC2460TATCCAAGCTCAAGTGGTCCTGTCGAAGTATTTATCACTGAGACTCCGAGTCAGCCCAAC2520TCCCACCCCATCCAGTGGAATGCACCACAGCCATCTCACATTTCCAAGTACATTCTCAGG2580TGGAGACCTGTGAGTATCCCACCCAGAAACCTTGGATAC2619<210>2<211>873<212>PRT<213>人工序列<400>2MetAlaProSerSerProArgProAlaLeu10ProAlaLeuLeuValLeuLeuGlyAlaLeu20PheProGlyProGlyAsnAlaGlnThrSer30ValSerProSerLysValIleLeuProArg40GlyGlySerValLeuValThrCysSerThr50SerCysAspGlnProLysLeuLeuGlyIle60GluThrProLeuProLysLysGluLeuLeu70LeuProGlyAsnAsnArgLysValTyrGlu80LeuSerAsnValGlnGluAspSerGlnPro90MetCysTyrSerAsnCysProAspGlyGln100SerThrAlaLysThrPheLeuThrValTyr110TrpThrProGluArgValGluLeuAlaPro120LeuProSerTrpGlnProValGlyLysAsn130LeuThrLeuArgCysGlnValGluGlyGly140AlaProArgAlaAsnLeuThrValValLeu150LeuArgGlyGluLysGluLeuLysArgGlu160ProAlaValGlyGluProAlaGluValThr170ThrThrValLeuValArgArgAspHisHis180GlyAlaAsnPheSerCysArgThrGluLeu190AspLeuArgProGlnGlyLeuGluLeuPhe200GluAsnThrSerAlaProTyrGlyGlyGly210GlySerGlyGlyGlyGlySerLeuArgGly220ProGlyProGlyLeuLeuLeuLeuAlaVal230LeuCysLeuGlyThrAlaValProSerThr240GlyAlaSerLysSerLysArgGlnAlaGln250GlnMetValGlnProGlnSerProValAla260ValSerGlnSerLysProGlyCysTyrAsp270AsnGlyLysHisTyrGlnIleAsnGlnGln280TrpGluArgThrTyrLeuGlyAsnAlaLeu290ValCysThrCysTyrGlyGlySerArgGly300PheAsnCysGluSerLysProGluAlaGlu310GluThrCysPheAspLysTyrThrGlyAsn320ThrTyrArgValGlyAspThrTyrGluArg330ProLysAspSerMetIleTrpAspCysThr340CysIleGlyAlaGlyArgGlyArgIleSer350CysThrIleAlaAsnArgCysHisGluGly360GlyGlnSerTyrLysIleGlyAspThrTrp370ArgArgProHisGluThrGlyGlyTyrMet380LeuGluCysValCysLeuGlyAsnGlyLys390GlyGluTrpThrCysLysProIleAlaGlu400LysCysPheAspHisAlaAlaGlyThrSer410TyrValValGlyGluThrTrpGluLysPro420TyrGlnGlyTrpMetMetValAspCysThr430CysLeuGlyGluGlySerGlyArgIleThr440CysThrSerArgAsnArgCysAsnAspGln450AspThrArgThrSerTyrArgIleGlyAsp460ThrTrpSerLysLysAspAsnArgGlyAsn470LeuLeuGlnCysIleCysThrGlyAsnGly480ArgGlyGluTrpLysCysGluArgHisThr490SerValGlnThrThrSerSerGlySerGly500ProPheThrAspValArgAlaAlaValTyr510GlnProGlnProHisProGlnProProPro520TyrGlyHisCysValThrAspSerGlyVal530ValTyrSerValGlyMetGlnTrpLeuLys540ThrGlnGlyAsnLysGlnMetLeuCysThr550CysLeuGlyAsnGlyValSerCysGlnGlu560ThrAlaValThrGlnThrTyrGlyGlyAsn570SerAsnGlyGluProCysValLeuProPhe580ThrTyrAsnGlyArgThrPheTyrSerCys590ThrThrGluGlyArgGlnAspGlyHisLeu600TrpCysSerThrThrSerAsnTyrGluGln610AspGlnLysTyrSerPheCysThrAspHis620ThrValLeuValGlnThrArgGlyGlyAsn630SerAsnGlyAlaLeuCysHisPheProPhe640LeuTyrAsnAsnHisAsnTyrThrAspCys650ThrSerGluGlyArgArgAspAsnMetLys660TrpCysGlyThrThrGlnAsnTyrAspAla670AspGlnLysPheGlyPheCysProMetAla680AlaHisGluGluIleCysThrThrAsnGlu690GlyValMetTyrArgIleGlyAspGlnTrp700AspLysGlnHisAspMetGlyHisMetMet710ArgCysThrCysValGlyAsnGlyArgGly720GluTrpThrCysIleAlaTyrSerGlnLeu730ArgAspGlnCysIleValAspAspIleThr740TyrAsnValAsnAspThrPheHisLysArg750HisGluGluGlyHisMetLeuAsnCysThr760CysPheGlyGlnGlyArgGlyArgTrpLys770CysAspProValAspGlnCysGlnAspSer780GluThrGlyThrPheTyrGlnIleGlyAsp790SerTrpGluLysTyrValHisGlyValArg800TyrGlnCysTyrCysTyrGlyArgGlyIle810GlyGluTrpHisCysGlnProLeuGlnThr820TyrProSerSerSerGlyProValGluVal830PheIleThrGluThrProSerGlnProAsn840SerHisProIleGlnTrpAsnAlaProGln850ProSerHisIleSerLysTyrIleLeuArg860TrpArgProValSerIleProProArgAsn870LeuGlyTyr873當前第1頁1 2 3