本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及提高比活的α-淀粉酶basamy突變體及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：α-淀粉酶是一種十分重要的酶制劑，能夠從淀粉分子內(nèi)部隨機(jī)切開(kāi)α-1,4糖苷鍵生成糊精和還原糖。α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵和紡織品工業(yè)。α-淀粉酶分布十分廣泛，遍及微生物至高等植物。相對(duì)于其他來(lái)源的α-淀粉酶，微生物來(lái)源的α-淀粉酶作用溫度廣，ph值范圍廣，生產(chǎn)成本低，因此微生物來(lái)源的α-淀粉酶被廣泛的應(yīng)用于各個(gè)工業(yè)領(lǐng)域。作為微生物α-淀粉酶中最重要的一類，芽孢桿菌α-淀粉酶是目前研究和應(yīng)用最為廣泛。沙漠芽胞桿菌(bacillussonorensis)α-淀粉酶簡(jiǎn)稱basamy，是一種中溫α-淀粉酶，其作用ph廣，適用于食品、造紙、飼料等工業(yè)領(lǐng)域。相對(duì)于其他芽孢桿菌α-淀粉酶，basamy比活低，生產(chǎn)成本高，限制了其在食品、造紙、飼料等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，提高basamy的比活，降低其生產(chǎn)成本，是basamy工業(yè)化應(yīng)用急需解決的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明對(duì)來(lái)源于索諾拉沙漠芽胞桿菌的α-淀粉酶basamy進(jìn)行分子改造，從而提高basamy的比活，降低生產(chǎn)成本，為α-淀粉酶basamy的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是提供提高比活的α-淀粉酶basamy突變體。本發(fā)明的再一目的是提供提高比活的α-淀粉酶basamy突變體的編碼基因。索諾拉沙漠芽胞桿菌的α-淀粉酶basamy的核苷酸序列和氨基酸序列分別如seqidno.1和seqidno.6所示。本發(fā)明采用定點(diǎn)飽和突變的方法對(duì)seqidno.6所示的α-淀粉酶basamy的第29位、第267位、第270位、第275位和第350位進(jìn)行分子改造，經(jīng)過(guò)高通量篩選確定了第29位、第267位、第270位、第275位和第350位這5個(gè)位點(diǎn)的最優(yōu)突變氨基酸。其中29位由l突變?yōu)閍最好，267位則是s突變?yōu)閝，270位則是s突變?yōu)閜，275位則是a突變?yōu)閥，350位則是d突變?yōu)間。同時(shí)采用易錯(cuò)pcr技術(shù)對(duì)seqidno.1所示的α-淀粉酶basamy的核苷酸序列進(jìn)行改造，從而獲得一系列的突變位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)高通量篩選獲得了6個(gè)有效突變體分別為a112r，l269f，k274s，q278s，s279q和l412c。在上述有效突變位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，分別一一進(jìn)行組合，最終得到了四個(gè)提高比活的bsamy突變體分別命名為basamy-1、basamy-2、basamy-3和basamy-4。這四個(gè)突變體的相對(duì)比活分別是basamy的130％，160％，180％和125％。basamy-1、basamy-2、basamy-3和basamy-4突變體的核苷酸序列如seqidno.2到seqidno.5所示，氨基酸序列如seqidno.7到seqidno.10所示。其中basamy-1包含的突變位點(diǎn)為l29a，a112r，s267q，k274s，q278s，s279q，d356g和l412c。其中basamy-2包含的突變位點(diǎn)為l29a，l269f，s270p，a275y，q278s，s279q，d356g和l412c。其中basamy-3包含的突變位點(diǎn)為l29a，a112r，l269f，k274s，a275y，q278s，s279q和l412c。其中basamy-4包含的突變位點(diǎn)為s267q，l269f，s270p，k274s，a275y，q278s，s279q和l412c。本發(fā)明通過(guò)蛋白理性改造和高通量篩選技術(shù)對(duì)索諾拉沙漠芽胞桿菌的α-淀粉酶basamy進(jìn)行分子改造，得到了四個(gè)比活提高的突變體。為索諾拉沙漠芽胞桿菌的α-淀粉酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1原始α-淀粉酶和突變體basamy-1至basamy-4的最適反應(yīng)ph圖2原始α-淀粉酶和突變體basamy-1至basamy-4的ph穩(wěn)定性圖3原始α-淀粉酶和突變體basamy-1至basamy-4的最適反應(yīng)溫度圖4原始α-淀粉酶和突變體basamy-1至basamy-4的熱穩(wěn)定性具體實(shí)施方式以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行；所述試劑和生物材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)驗(yàn)材料和試劑：1、菌株與載體索諾拉沙漠芽胞桿菌(bacillussonorensis)的α-淀粉酶購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)為10848、大腸桿菌菌株topl0、畢赤酵母x33、載體ppiczαa，載體pgapzαa，zeocin購(gòu)自invitrogen公司。2、酶與試劑盒q5高保真taq酶mix購(gòu)自neb公司，質(zhì)粒提取，膠純化，限制性內(nèi)切酶、試劑盒購(gòu)自上海生工公司。3、培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為lb(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％nacl，ph7.0)。lbz為lb培養(yǎng)基加25ug/mlzeocin。酵母培養(yǎng)基為ypd(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母篩選培養(yǎng)基為ypdz(ypd+100mg/lzeocin)。酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基bmgy(i％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％ynb、0.00004％biotin、1％甘油(v/v))和bmmy(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與bmgy相同)。實(shí)施例1、索諾拉沙漠芽胞桿菌(bacillussonorensis)的α-淀粉酶的克隆將索諾拉沙漠芽胞桿菌接入lb培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后，提取其基因組dna。根據(jù)已報(bào)道索諾拉沙漠芽胞桿菌α-淀粉酶的序列(genebank:aofm01000005.1)設(shè)計(jì)兩條引物(r：5'-ctgaattcatggtttacaaatgcaaacgg-3'和f：5'-cttctagactatcgttggacataaatcga-3')用于擴(kuò)增索諾拉沙漠芽胞桿菌α-淀粉酶基因。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物純化回收，分別連接到表達(dá)載體ppiczαa和ppgapzαa，得到表達(dá)載體ppiczαa-basamy和pgapzαa-basamy。實(shí)施例2、理性定點(diǎn)突變以上述ppiczαa-basamy為模板，以表中的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，具體地?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系如下：q5高保真taq酶mix23ul對(duì)應(yīng)突變體引物1ul對(duì)應(yīng)突變體引物1ulppiczαa-basamy(20ng)2ul加水至50ul反應(yīng)程序如下：瓊脂糖電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增結(jié)果，純化回收pcr產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶dpni將原始質(zhì)粒分解，將分解完的產(chǎn)物才用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌top10，通過(guò)菌液pcr驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化子，提取驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，從而確定相應(yīng)的突變體。將測(cè)序正確的突變體，用saci線性化，轉(zhuǎn)入畢赤酵母x33。實(shí)施例3、高通量篩選高比活突變菌株將實(shí)施例2中的酵母重組轉(zhuǎn)化子用牙簽逐個(gè)挑至24孔板，每個(gè)孔中加入1ml含有bmgy培養(yǎng)基，30℃，220rpm培養(yǎng)24h左右，離心去上清。再分別加入1.6mlbmmy培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，離心取上清，將上述上清液分別取出200μl至96孔板，進(jìn)行α-淀粉酶酶活測(cè)定。α-淀粉酶酶活檢測(cè)參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《gb/t24401-2009》進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)過(guò)高通量篩選得到5個(gè)有效突變位點(diǎn)分別為l29a，s267q，s270p，a275y和d350g。這5個(gè)突變體的相對(duì)比活如表1所示。表1原始α-淀粉酶和突變體α-淀粉酶相對(duì)比活編號(hào)相對(duì)比活(％)原始α-淀粉酶100l29a115s267q120s270p125a275y119d350g128實(shí)施例4、易錯(cuò)pcr非理性改造以上述pgapzαa-basamy為模板，進(jìn)行易錯(cuò)pcr隨機(jī)突變擴(kuò)增，具體地?cái)U(kuò)增方法是：第一輪擴(kuò)增：以載體啟動(dòng)子引物aox5-f和aox3-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：反應(yīng)程序如下：回收第一輪pcr產(chǎn)物，去1μl稀釋50-100倍用作第二輪pcr的模板；第二，第三輪易錯(cuò)pcr以α-淀粉酶特異性引物r及f替代引物aox5-f和aox3-r為反應(yīng)引物，重復(fù)pcr反應(yīng)。取第二、三輪的產(chǎn)物用xbai和ecori進(jìn)行雙酶切，連接至pgapzαa載體上的ecori和xbai位點(diǎn)之間。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化x33，在ypdz平板培養(yǎng)篩選突變菌株。經(jīng)過(guò)高通量篩選獲得了6個(gè)有效突變體分別為a112r，l269f，k274s，q278s，s279q和l412c。這6個(gè)突變體的相對(duì)比活如表2所示。表2原始α-淀粉酶和突變體α-淀粉酶相對(duì)比活編號(hào)相對(duì)比活(％)原始α-淀粉酶100a112r121l269f130k274s126q278s131s279q123l412c125實(shí)施例5、組合突變進(jìn)行組合突變，通過(guò)實(shí)驗(yàn)最終得到4個(gè)組合突變分別命名為basamy-1、basamy-2、basamy-3、basamy-4。其中basamy-1包含的突變位點(diǎn)為l29a，a112r，s267q，k274s，q278s，s279q，d356g和l412c。其中basamy-2包含的突變位點(diǎn)為l29a，l269f，s270p，a275y，q278s，s279q，d356g和l412c。其中basamy-3包含的突變位點(diǎn)為l29a，a112r，l269f，k274s，a275y，q278s，s279q和l412c。其中basamy-4包含的突變位點(diǎn)為s267q，l269f，s270p，k274s，a275y，q278s，s279q和l412c。實(shí)施例6、原始α-淀粉酶及α-淀粉酶突變體的比活分析分別將原始α-淀粉酶和突變體α-淀粉酶進(jìn)行純化，純化方法為鎳柱純化。將純化好的α-淀粉酶和突變體α-淀粉酶分別測(cè)定相應(yīng)的酶活并計(jì)算出比活。以突變體比活除以原始α-淀粉酶比活，來(lái)計(jì)算突變體的相對(duì)比活。最終basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的相對(duì)比活分別為130％，160％，180％和125％。實(shí)施例7、原始α-淀粉酶及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)ph及ph穩(wěn)定性參照國(guó)標(biāo)方法測(cè)定原始α-淀粉酶basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)ph。basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)ph如圖1所示。由圖1可知，突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適ph值幾乎和baamy一樣，均為6.0。將basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4分別在ph4-8條件下室溫處理2小時(shí)，然后參照國(guó)標(biāo)的方法測(cè)定酶活，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知突變體basamy-1、basamy-2、basamy-3和basamy-4的ph穩(wěn)定性與basamy一致。實(shí)施例8、原始α-淀粉酶及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性參照國(guó)標(biāo)方法測(cè)定basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)溫度，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)溫度均為60℃。將basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4分別在50℃-90℃條件下水浴處理30分鐘，然后參照國(guó)標(biāo)的方法測(cè)定酶活，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的熱穩(wěn)定性與basamy一致。當(dāng)前第1頁(yè)12