本發(fā)明屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種豬鏈球菌2型弱毒株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬鏈球菌病是由多種溶血性鏈球菌引起的豬的一種多型性傳染病，該病的臨床特征是急性者表現(xiàn)為出血性敗血癥和腦炎，慢性者則表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎和淋巴結(jié)膿腫。該病通常的致病菌為豬鏈球菌。該菌血清型有33個(gè)之多，目前已知豬鏈球菌2型為高毒力血清型，可引起豬發(fā)病死亡，可致人畜共患，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)預(yù)防豬鏈球菌病多使用單價(jià)或多價(jià)滅活疫苗，取得一定成果。上個(gè)世紀(jì)70年代以來，商品化的C群鏈球菌弱毒疫苗廣泛應(yīng)用，對(duì)馬鏈球菌獸疫亞種引起的豬鏈球菌病起到很好的預(yù)防作用，大量臨床試驗(yàn)證據(jù)表明細(xì)菌性活疫苗對(duì)控制細(xì)菌病起到積極作用，具有早期預(yù)防，誘導(dǎo)黏膜免疫、細(xì)胞免疫等特點(diǎn)。因此，目前開發(fā)針對(duì)流行血清型豬鏈球菌2型的活疫苗具有積極的意義，對(duì)臨床上常年不斷發(fā)生的豬鏈球菌病的預(yù)防具有明顯優(yōu)勢(shì)。

目前我國針對(duì)豬鏈球菌2型的弱毒疫苗的研究多以基因工程構(gòu)建為主，以豬鏈球菌2型菌株為親本菌株，構(gòu)建單缺失/雙缺失等菌株，在一定程度上降低了豬鏈球菌菌的毒力，但是缺失菌株容易存在回復(fù)突變的可能，易造成菌株的毒力返強(qiáng)。自然弱毒株是在自然界中存在的，非人為改造的菌株，比目前以基因工程手段構(gòu)建的缺失弱毒菌株更加穩(wěn)定，不易產(chǎn)生毒力返強(qiáng)。本發(fā)明提供中所描述的豬鏈球菌是從健康豬中分離的自然弱毒株，毒力非常低，對(duì)仔豬不存在毒力，同時(shí)能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)豬鏈球菌2型產(chǎn)生抗體，既安全，又有效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供了一種豬鏈球菌2型弱毒株，所述菌株已于2017年1月4日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：豬鏈球菌2型(Streptococcus suis)XN，保藏編號(hào)：CCTCC NO：M2017003，地址：中國武漢武漢大學(xué)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種豬鏈球菌2型XN的應(yīng)用，該菌株為豬鏈球菌2型的自然弱毒株，利用該菌株可用于制備豬鏈球菌2型疫苗，制得的疫苗無致病性、免疫原性好、刺激抗體迅速。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

豬鏈球菌2型XN(SS2-XN株)的分離、篩選和鑒定：

申請(qǐng)人從2009年11月自湖北省咸寧某屠宰場(chǎng)屠宰豬的肺組織，經(jīng)各項(xiàng)鑒定證明為豬鏈球菌2型，所述菌株已于2017年1月4日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：豬鏈球菌2型(Streptococcus suis)XN，保藏編號(hào)：CCTCC NO：M2017003，地址：中國武漢武漢大學(xué)。

豬鏈球菌2型XN(SS2-XN株)的生物學(xué)特性鑒定如下：

豬鏈球菌2型XN為鏈球菌屬，大小0.1mm-1.0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊，在綿羊鮮血瓊脂平板上形成的菌落周圍可見β溶血環(huán)。新鮮培養(yǎng)物玻片固定后進(jìn)行定革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽性，個(gè)體呈圓球狀或卵圓形，與豬鏈球菌2型LT菌株(CCTCC NO：M2011282)的革蘭氏結(jié)果比較，多以短鏈或長(zhǎng)鏈排列(圖1)。

豬鏈球菌2型在LB瓊脂平皿上生長(zhǎng)較差，37℃溫箱培養(yǎng)20小時(shí)以上可見針尖大小菌落。在TSA平皿(含5％新生牛血清)上生長(zhǎng)良好，37℃溫箱培養(yǎng)12小時(shí)即見針尖大小菌落。

一種豬鏈球菌2型XN的應(yīng)用，包括利用該鏈球菌制備成治療或預(yù)防豬鏈球菌病2型的疫苗，或者與其他有效成分制備成聯(lián)合疫苗。

優(yōu)選的，上述應(yīng)用中，所述疫苗的保護(hù)劑為明膠蔗糖保護(hù)劑，即疫苗中明膠的終含量為1.5％(g/ml)，蔗糖終含量為5％(g/ml)，疫苗的稀釋液為20％(g/ml)氫氧化鋁膠生理鹽水。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.本疫苗所用菌株對(duì)豬體無致病性，能較快的刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)同血清型的抗體。

2.本疫苗可以預(yù)防豬鏈球菌2型引起的疾病，對(duì)于同血清型的免疫保護(hù)效果達(dá)到90％以上，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，可應(yīng)用于豬場(chǎng)中種豬和仔豬對(duì)豬鏈球菌病的預(yù)防，降低豬場(chǎng)豬鏈球菌病的發(fā)病率，提高仔豬存活率。

附圖說明

圖1：豬鏈球菌2型LT株和豬鏈球菌2型XN革蘭氏染色對(duì)比圖。

圖1中A：豬鏈球菌2型LT菌株革蘭氏染色；圖1中B：豬鏈球菌2型XN革蘭氏染色。

圖2：一種豬鏈球菌通用引物擴(kuò)增的PCR示意圖；

其中泳道M：DNA分子Marker；泳道1：陰性對(duì)照(H₂O)，泳道2～5：豬鏈球菌分離菌株；泳道6：豬鏈球菌2型XN菌株。

圖3：一種豬鏈球菌2型引物擴(kuò)增的PCR示意圖；

其中泳道1：DNA分子Marker；泳道2～5：豬鏈球菌分離菌株；泳道6：豬鏈球菌2型XN。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的實(shí)施例。結(jié)合實(shí)施對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述和論證。但是該實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

豬鏈球菌2型XN的分離和鑒定

待分離的病料——各組織病料是申請(qǐng)人從2009年11月自湖北省咸寧某屠宰場(chǎng)屠宰豬的肺組織分離得到。其具體分離方法為：無菌采集肺部組織接種于TSA(購自美國BD公司)平皿上，37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)后觀察。挑取直徑為0.1mm-1.0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的小菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜。將純培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。然后用光學(xué)顯微鏡觀察，革蘭氏染色呈陽性，對(duì)其傳代純化。

豬鏈球菌2型的分類鑒定，采用PCR方法和玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行了鑒定，具體步驟如下：

(1)PCR方法鑒定：根據(jù)參考文獻(xiàn)(趙戰(zhàn)勤，2007年)合成豬鏈球菌通用引物和豬鏈球菌2型特異性引物。其中豬鏈球菌通用引物JP4和JP5是根據(jù)谷氨酸鹽脫氫酶基因(gdh，基因登錄號(hào)：gb|EF539838.1|)設(shè)計(jì)，

上游引物為JP4(5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’)；

下游引物為JP5(5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’)，可擴(kuò)增長(zhǎng)度為689bp的目的DNA片段(其PCR圖片見附圖2)。

豬鏈球菌2型的特異性引物是根據(jù)豬鏈球菌具有型特異性的莢膜多糖抗原基因cps2J(基因登錄號(hào)：JN024705.1)設(shè)計(jì)，上游引物為cps2J-F(5’-TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG-3’)，

下游引物為cps2J-R(5’-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’)，可擴(kuò)增長(zhǎng)度為557bp目的DNA片段(其PCR圖片見附圖3)。

(2)玻片凝集試驗(yàn)：將分離的豬鏈球菌2型XN接種TSB(購自美國BD公司)培養(yǎng)基，置37℃搖床170rpm/min，培養(yǎng)8小時(shí)，使OD600達(dá)到1.3～1.5，采用玻片凝集的方法對(duì)該菌液進(jìn)行血清學(xué)分型鑒定。操作方法如下：

取潔凈玻片1張，用微量移液器吸取3μl豬鏈球菌(SS)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(購自丹麥哥本哈根國立血清研究所)滴于載玻片上，另吸取3μl生理鹽水做對(duì)照，然后吸取3μl菌液分別加入血清和生理鹽水中，充分混勻(注：每次加樣都要更換移液器的TIP頭)。輕輕搖動(dòng)載玻片，1～2min后觀察結(jié)果。血清與待檢菌液混合后出現(xiàn)明顯可見的凝集塊，液體變?yōu)橥该鳎}水對(duì)照滴仍為均勻混濁狀態(tài)，即判定為凝集反應(yīng)陽性。若血清與菌液混合后為均勻混濁狀態(tài)，沒有出現(xiàn)明顯可見的凝集塊判定為陰性。玻片凝集試驗(yàn)表明，本發(fā)明分離的豬鏈球菌2型XN僅與豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清發(fā)生凝集反應(yīng)，不與其他血清型凝集。

豬鏈球菌2型LT株和豬鏈球菌2型XN革蘭氏染色對(duì)比發(fā)現(xiàn)：豬鏈球菌2型LT株多以單個(gè)或雙個(gè)排列，而豬鏈球菌2型XN株多以多個(gè)或成串排列(圖1)。

所述菌株已于2017年1月4日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：豬鏈球菌2型(Streptococcus suis)XN，保藏編號(hào)：CCTCC NO：M2017003，地址：中國武漢武漢大學(xué)。

實(shí)施例2

豬鏈球菌2型XN的毒力試驗(yàn)

1.1 豬鏈球菌2型XN(SS2-XN)對(duì)小鼠的感染試驗(yàn)

使用4周齡昆明系小鼠測(cè)定豬鏈球菌2型XN致病力。用報(bào)道的已知強(qiáng)毒菌株LT株(CCTCC NO：M2011282)作為參照。每株細(xì)菌分為3個(gè)劑量組(3×10⁹CFU、5×10⁸CFU、5×10⁷CFU)，每個(gè)劑量組用10只小鼠皮下接種，每只接種0.5ml的菌懸液。觀察7日，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

表1 豬鏈球菌2型菌株的毒力差異

*HV高致病力：致死劑量≤5×10⁸CFU,MV中等致病力：致死劑量為≤3×10⁹CFU,LV低致病力：3×10⁹CFU不致死。

表1的結(jié)果表明，用3×10⁹CFU的SS2-XN菌株接種10只昆明鼠，對(duì)昆明鼠無致病性。

1.2 豬鏈球菌2型XN(SS2-XN)對(duì)仔豬感染試驗(yàn)

仔豬試驗(yàn)前需檢測(cè)血清抗體確認(rèn)豬鏈球菌2型抗體陰性，方可用于該試驗(yàn)。按照試驗(yàn)菌株數(shù)將仔豬隨機(jī)分組，通過頸部肌肉注射方法接種測(cè)試菌株的新鮮培養(yǎng)物。剩下兩組作為對(duì)照，一組接種2ml PBS，另一組接種1.2×10⁶CFU的LT株菌液2ml。連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計(jì)發(fā)病與死亡情況。結(jié)果如表2所示。

表2 豬鏈球菌2型XN菌株對(duì)仔豬致病性

由表2結(jié)果表明，豬鏈球菌2型XN以1.1×10¹⁰CFU肌肉接種仔豬，不會(huì)對(duì)仔豬產(chǎn)生任何影響。

實(shí)施例3：

豬鏈球菌2型XN在制備豬鏈球菌病2型疫苗中的應(yīng)用：

1.1 明膠蔗糖穩(wěn)定劑的制備

明膠蔗糖保護(hù)劑，為含12％(g/ml)明膠、40％(g/ml)蔗糖的溶液。

1.1.1 精確稱取進(jìn)口明膠顆粒(Sigma公司)1200g，加入10L配液瓶中，然后注入約8L注射用水(pH值應(yīng)為6.8～7.2)，65℃水溫條件下充分?jǐn)嚢?，溶解均勻?/p>

1.1.2 精密稱取蔗糖(國藥集團(tuán))4000g，加入上述配液瓶中，同樣條件溶解均勻。

1.1.3 注射用水補(bǔ)足配液瓶中溶液體積至10L。

1.1.4 滅菌 116℃高壓滅菌30分鐘，備用。

1.1.5 儲(chǔ)存 在2-8℃冰箱保存。使用前放入37℃溫箱預(yù)熱。

1.2 生產(chǎn)用種子菌的制備

1.2.1 一級(jí)種子菌的繁殖及檢驗(yàn) 取豬鏈球菌2型XN(SS2-XN)凍存菌種接種含5％新生牛血清TSA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20～24小時(shí)，選5個(gè)以上典型菌落，混合接種含5％新生牛血清TSA斜面若干個(gè)，37℃培養(yǎng)16～20小時(shí)，經(jīng)純粹檢查合格作為一級(jí)種子。2～8℃保存，應(yīng)不超過7日，在培養(yǎng)基上傳代，應(yīng)不超過5代。

1.2.2 二級(jí)菌種繁殖及檢驗(yàn) 取一級(jí)種子菌接種含5％新生牛血清TSB培養(yǎng)基，37℃，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)8～10小時(shí)，經(jīng)純粹檢查合格作為二級(jí)菌種。2～8℃保存，應(yīng)不超過7日。

1.3 制苗用培養(yǎng)基 為含5％新生牛血清TSB培養(yǎng)基。

1.4 制苗菌液的制備 取檢驗(yàn)合格的二級(jí)種子菌按體積比2％接種含5％(ml/ml)新生牛血清TSB培養(yǎng)基，置50升發(fā)酵罐，裝液量是30升，發(fā)酵罐37℃發(fā)酵培養(yǎng)10小時(shí)，控制及維持發(fā)酵罐通氣量(1.5VVM)、溶解氧濃度(60％)、攪拌速率(100r/min)、pH值(7.2±0.2)，放罐時(shí)的菌濃度為15億/ml。根據(jù)疫苗規(guī)格，菌液可用高速離心法濃縮用于配苗。

1.5 半成品檢驗(yàn)

1.5.1 純粹檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)純粹。

1.5.2 活菌計(jì)數(shù) 取制苗菌液按《中國獸藥典》附錄進(jìn)行計(jì)數(shù)。每毫升菌液含活菌數(shù)應(yīng)不低于4.0×10⁹CFU，作為配苗計(jì)算頭份的參考。

1.6 配苗及分裝 將檢驗(yàn)合格的菌液混合后，加入2.1中制備的明膠蔗糖穩(wěn)定劑，使其最終明膠含量為1.5％(g/ml)，蔗糖含量為5％(g/ml)，充分混合均勻，定量分裝，考慮凍干損失，每頭份含活菌數(shù)應(yīng)不少于7.0×10⁸CFU。

1.7 凍干 分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥，完成后置－15℃以下保存。

1.8 疫苗稀釋液的制備

本發(fā)明所述的疫苗稀釋液為鋁膠鹽水稀釋液，成分為20％(g/ml)氫氧化鋁膠生理鹽水。

1.8.1 使用注射用水配制0.85％生理鹽水8000ml。

1.8.2 稱取氫氧化鋁凝膠原膠(LV公司)2000g置上述生理鹽水中，充分?jǐn)嚢杈鶆颉?/p>

1.8.3 注射用水(pH值應(yīng)為6.8～7.2)補(bǔ)足配液瓶中溶液體積至10L

1.8.4 滅菌 116℃高壓滅菌30分鐘，備用。

1.8.5 分裝 潔凈條件下定量分裝100ml/瓶，立即蓋上滅菌膠塞并壓鋁塑蓋。

按上述步驟制備三批疫苗，批號(hào)分別為201201、201202、201203，用疫苗稀釋液稀釋至每頭份(2ml)活菌含量不少于5.0×10⁸CFU，用于以下實(shí)施例。

實(shí)施例4：

疫苗(豬鏈球菌2型XN)的安全性試驗(yàn)：

1.1 對(duì)斷奶仔豬一次單劑量接種的安全性

將制備的3批疫苗分別通過頸部肌肉接種28～35日齡健康斷奶仔豬，每批疫苗注射5頭，每頭以1次單劑量(含活菌5.0×10⁸CFU)2ml接種，觀察14日，并測(cè)定體溫。

1.2 對(duì)斷奶仔豬一次超劑量接種的安全性

將3批疫苗分別通過頸部肌肉接種28～35日齡健康斷奶仔豬，每批疫苗注射5頭，每頭超劑量(含活菌1.0×10¹⁰CFU)接種，觀察14日。并測(cè)定體溫。

2.試驗(yàn)結(jié)果

2.1 疫苗對(duì)斷奶仔豬1次單劑量接種的安全性

接種后，仔豬體溫、呼吸情況、精神狀況、食欲等均正常，未見異常變化。說明該疫苗對(duì)斷奶仔豬安全性很好(表3)。

表3 3批疫苗單劑量接種28～35日齡斷奶仔豬后的平均體溫

2.2 疫苗對(duì)斷奶仔豬1次超劑量重復(fù)接種的安全性

3 批疫苗分別通過頸部肌肉以超劑量(含活菌1.0×10¹⁰CFU)接種28～35日齡健康斷奶仔豬，所有豬在整個(gè)觀察期間體溫?zé)o明顯升高，呼吸、食欲、精神狀態(tài)都正常(表4)，表明該疫苗對(duì)斷奶仔豬1次超劑量接種是安全的。

表4 3批疫苗單超量1次接種28～35日齡斷奶仔豬后的平均體溫

實(shí)施例5：

疫苗(豬鏈球菌2型XN)免疫效力試驗(yàn)

1 材料與方法

1.1 疫苗

實(shí)施例3制備的三批疫苗(豬鏈球菌2型XN株)，批號(hào)分別為201201、201202、201203。

1.2 效檢菌株

豬鏈球菌血清2型LT株(CCTCC NO：M2011282)，用于攻毒試驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購買自湖北咸寧市神童牧業(yè)公司的28～35日齡斷奶仔豬(長(zhǎng)大)，經(jīng)豬鏈球菌2型抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體陰性。

1.4 抗體檢測(cè)方法

使用武漢科前生物有限公司生產(chǎn)的豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行血清抗體水平測(cè)定

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將28～35日齡豬鏈球菌血清2型抗體陰性仔豬隨機(jī)分成3個(gè)免疫組(分別免疫201201、201202、201203批疫苗)與1個(gè)空白對(duì)照組(未免疫)，每組5頭。其中免疫組仔豬每頭頸部肌肉接種疫苗1頭份(5.0×10⁸CFU)。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，不進(jìn)行免疫。免疫28天后，采集并分離各組豬群血清，使用豬鏈球菌2型抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)特異性抗體水平，耳靜脈注射致死劑量(1.2×10⁶CFU)的LT株菌懸液進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒后觀察14天，統(tǒng)計(jì)保護(hù)與死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 于首免后7天、14天、21天、28天采集并分離豬群血清，使用豬鏈球菌2型ELISA試劑盒檢測(cè)抗體水平。具體結(jié)果如表5，表6和表7所示。

表5 201201批疫苗抗體檢測(cè)記錄

表6 201202批疫苗抗體檢測(cè)記錄

表7 201203批疫苗抗體檢測(cè)記錄

如表5、表6和表7結(jié)果所示，3批疫苗免疫仔豬后7天、14天、21、28天抗體檢測(cè)結(jié)果表明，仔豬在免疫后7天有80％以上仔豬ELISA抗體即能轉(zhuǎn)陽，隨后抗體逐漸升高。

2.2 3批豬鏈球菌病活疫苗免疫28天后，對(duì)免疫仔豬及非免疫仔豬進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。攻毒后空白組仔豬24小時(shí)內(nèi)均開始發(fā)病，3天內(nèi)相繼發(fā)病且最終死亡4頭；201201、201202批疫苗免疫組攻毒后豬群均未觀察到明顯臨床癥狀，5/5保護(hù)；201203批疫苗免疫組攻毒后各出現(xiàn)1頭發(fā)病，保護(hù)率為4/5。

表8 不同批次疫苗(豬鏈球菌2型XN)免疫效力試驗(yàn)

實(shí)施例7：

疫苗的與國內(nèi)產(chǎn)品對(duì)比試驗(yàn)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用疫苗

實(shí)施例3制備的3批豬鏈球菌2型弱毒疫苗，批號(hào)為201201、201202、201203；由武漢科前生物有限公司生產(chǎn)的豬鏈球菌病滅活疫苗(2型LT株+7型YZ株+C群XS株)，簡(jiǎn)稱科前滅活苗。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

28～35日齡健康斷奶仔豬(長(zhǎng)大)，使用武漢科前豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體陰性，由湖北咸寧市神童牧業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.3 疫苗效力比較試驗(yàn)

1.3.1 免疫程序

將50頭健康斷奶仔豬(豬鏈球菌2型抗體檢測(cè)陰性)隨機(jī)等分為5組，每組10頭。

1組仔豬免疫科前滅活疫苗(2型LT株+7型YZ株+C群XS株)，肌肉注射，2ml/頭。

2～4組仔豬分別免疫實(shí)施例3制備的三批的豬鏈球菌弱毒疫苗(SS2-XN株)，每頭頸部肌肉注射1頭份，接種時(shí)間同科前滅活疫苗。

第5組為空白對(duì)照組，不進(jìn)行任何疫苗的接種。

1.3.2 抗體測(cè)定

免疫科前滅活苗(1組)與免疫本室試制活疫苗(2－5組)的仔豬于免疫后第7、14、21、28天采血分離血清，使用科前豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體。血清抗體檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)如下：樣品OD630nm值≥0.35，判為陽性；樣品OD630值＜0.35，判為陰性。

抗體水平差異使用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05表明兩者差異顯著。

1.4.3 攻毒保護(hù)性試驗(yàn)

本發(fā)明活疫苗與科前滅活疫苗免疫28天，對(duì)包括空白對(duì)照的所有免疫仔豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。檢驗(yàn)用菌株為豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株LT株，攻毒方式為耳靜脈注射，攻毒劑量為致死劑量(1.2×10⁶CFU/mL，1mL/頭)。比較2種疫苗的免疫效力。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬鏈球菌2型抗體水平比較結(jié)果

免疫科前滅活苗組與本發(fā)明提供的活疫苗組于首免后7、14、21和28天采血，用豬鏈球菌2型和ELISA試劑盒檢測(cè)特異性抗體，操作步驟及判定標(biāo)準(zhǔn)詳見說明書，結(jié)果如下。

由表9與表10看出，3批本室試制活疫苗免疫仔豬7天后即能有效誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，抗體陽性率超過60％，14天后仔豬抗體陽性率達(dá)到100％，且OD630nm值均值超過0.5，免疫28天后上升至均值0.7左右；科前滅活苗一次免疫后第14天仔豬抗體開始轉(zhuǎn)陽，到21天時(shí)抗體陽性率達(dá)到100％，均值超過0.5，攻毒前(免疫第28天)抗體上升至0.8左右。

表9 仔豬免疫豬鏈球菌2型活疫苗血清抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

注：每孔測(cè)定值OD_630nm≥0.35，判定為陽性；每孔測(cè)定值OD_630nm＜0.35，判定為陰性。

表10 仔豬免疫滅活疫苗血清抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

通過對(duì)各組疫苗免疫后抗體水平的比較，結(jié)果表明活疫苗接種7天、14天時(shí)抗體水平顯著高于滅活疫苗組(p<0.05)，科前滅活疫苗誘導(dǎo)抗體隨接種時(shí)間穩(wěn)步上升，至28天時(shí)超過活疫苗誘導(dǎo)的抗體水平，但差異不顯著。

2.2 免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 免疫28天攻毒結(jié)果

本發(fā)明提供的活疫苗與科前滅活疫苗免疫28天后，對(duì)包括空白對(duì)照的所有免疫仔豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。攻毒后觀察發(fā)病和死亡情況，計(jì)算每批疫苗的保護(hù)率。

由表11與表12數(shù)據(jù)看出，未免疫對(duì)照組仔豬經(jīng)攻毒后全部發(fā)病，死亡9頭，攻毒試驗(yàn)成立。三批本室試制活疫苗免疫仔豬經(jīng)攻毒后提供的保護(hù)率分別為9/10、9/10、10/10，與科前滅活苗保護(hù)率無明顯差異。

表11 豬鏈球菌2型活疫苗免疫仔豬攻毒試驗(yàn)保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果(免疫28天)

表12 商品化滅活疫苗免疫仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果(免疫28天)

攻毒實(shí)驗(yàn)可以看出本室研制的豬鏈球菌2型活疫苗與科前滅活疫苗(一次免疫)攻毒保護(hù)率相當(dāng)，均在90％以上，能對(duì)豬群起到針對(duì)豬鏈球菌病有效保護(hù)。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果亦證明按照推薦免疫程序接種活疫苗(SS2-XN株)針對(duì)豬鏈球菌2型的免疫效力與滅活疫苗一致。