發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及激動人葡萄糖依賴性促胰島素多肽(gip)和胰高血糖素樣肽-1(glp-1)受體的雙重腸促胰島素肽模擬化合物，并且可用于治療2型糖尿病(t2d)。
背景技術(shù)：
：t2d是最常見的糖尿病形式，約占所有糖尿病的90％。t2d的特征在于由胰島素抗性引起的高血糖水平。目前針對t2d的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)包括飲食和運(yùn)動以及可用的口服和注射降糖藥物。然而，許多t2d患者仍然沒有得到充分控制。目前市售的腸促胰島素模擬物或二肽基肽酶iv(dpp-iv)抑制劑僅利用單一確立機(jī)制用于血糖控制。需要一種利用雙重作用機(jī)制的針對t2d的化合物。gip是42個氨基酸的胃腸調(diào)節(jié)肽，其通過在葡萄糖存在下刺激從胰腺β細(xì)胞分泌胰島素以及保護(hù)胰腺β細(xì)胞，在葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮生理作用。glp-1是37個氨基酸的肽，其刺激胰島素分泌、保護(hù)胰腺β細(xì)胞、并抑制胰高血糖素分泌、胃排空和食物攝入，導(dǎo)致體重減輕。gip和glp-1被稱為腸促胰島素；腸促胰島素受體信號傳導(dǎo)對葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵的生理相關(guān)作用。在正常生理學(xué)中，gip和glp-1在餐后從腸道分泌，這些腸促胰島素增強(qiáng)對食物的生理反應(yīng)，包括飽腹感、胰島素分泌和營養(yǎng)物質(zhì)處置。t2d患者具有受損的腸促胰島素反應(yīng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，glp-1類似物的給藥受到副作用(如惡心和嘔吐)的限制，因此最常見的是給藥不能實現(xiàn)全效血糖控制和體重減輕。單獨(dú)的gip在2型糖尿病人中具有非常適度的葡萄糖降低能力。天然gip和glp-1兩者可以被普遍存在的蛋白酶dppiv快速滅活，因此只能用于短期代謝控制。胰高血糖素是由胰腺產(chǎn)生的29個氨基酸的肽，當(dāng)與胰高血糖素受體結(jié)合時，發(fā)出信號使肝臟釋放葡萄糖，導(dǎo)致血糖升高。已知glp-2(與glp-1類似，從胰高血糖素原加工產(chǎn)生的肽)與腸道中的細(xì)胞增殖有關(guān)。因此，t2d患者的長期治療期間，應(yīng)最小化對胰高血糖素和glp-2受體的刺激，以便最大程度地降低葡萄糖并降低潛在的長期致癌風(fēng)險。在wo2013/164483、wo2014/192284和wo2011/119657中已經(jīng)描述了某些gip類似物表現(xiàn)出gip和glp-1兩者活性。dppiv在蛋白水解酶的外肽酶類中。在序列中引入非天然氨基酸可以增加任何給定肽的蛋白水解穩(wěn)定性。雖然使用非天然氨基酸可有助于肽對抗dppiv蛋白水解和其他形式降解的穩(wěn)定性，但是作為本發(fā)明的一部分，本申請人發(fā)現(xiàn)非天然氨基酸可以對gip和glp-1之間激動劑活性的平衡產(chǎn)生意想不到的影響。非天然氨基酸還增加了肽可能被視為外源物并引起不需要的免疫反應(yīng)(例如人免疫原性和注射位點(diǎn)反應(yīng))的可能性。脂肪酸通過其白蛋白結(jié)合基序，可以例如通過延長半衰期來改善肽的藥代動力學(xué)。雖然使用脂肪酸可以改善肽的半衰期，但作為本發(fā)明的一部分，申請人發(fā)現(xiàn)，脂肪酸鏈的長度、組成和位置、以及肽和脂肪酸鏈之間的接頭可以對gip和glp-1激動劑活性的平衡具有意想不到作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些glp-1類似物的耐受性可以防止一劑glp-1類似物達(dá)到更好的血糖控制和體重減輕的功效。glp-1類似物最常見的副作用是惡心和嘔吐，但有些化合物也可能影響心率。hpa軸是生理應(yīng)激反應(yīng)的一部分，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)glp-1刺激大鼠的hpa軸，導(dǎo)致增加的皮質(zhì)酮水平，提供與不良事件(例如心率增加)的潛在聯(lián)系。作為本發(fā)明的一部分，申請人意想不到地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的化合物不導(dǎo)致升高的皮質(zhì)酮水平(如大鼠模型中使用索馬魯肽(semaglutide)所見)，因此與glp-1r選擇性試劑相比，其可能給藥達(dá)到更高功效水平。仍然需要提供一種化合物，其是gip和glp-1受體的平衡共激動劑，但與相關(guān)的胰高血糖素和glp-2受體比較，表現(xiàn)出選擇性。此外，仍然需要提供一種化合物，其具有g(shù)ip和glp-1受體的平衡共激動劑活性，鑒于在動物模型中發(fā)現(xiàn)的活性，其可以提供體重減輕。此外，仍然需要提供一種化合物，其具有g(shù)ip和glp-1受體的平衡共激動劑活性，其提供對抗dppiv和其他降解形式的足夠穩(wěn)定性，但仍然保持低的免疫原性潛力。此外，仍然需要提供一種化合物，其具有g(shù)ip和glp-1受體的平衡共激動劑活性，其支持在人中每周一次給藥的可能性。技術(shù)實現(xiàn)要素：因此，與本領(lǐng)域中的某些gip-glp-1共激動劑化合物相比，本發(fā)明的某些化合物具有較低的免疫原性潛力和注射部位反應(yīng)。本發(fā)明的某些化合物具有基于動物能量消耗數(shù)據(jù)在患者中產(chǎn)生體重減輕的潛力。此外，本發(fā)明的某些化合物對gip和glp-1受體具有平衡共激動劑活性并且與胰高血糖素和glp-2受體相比表現(xiàn)出選擇性、具有低免疫原性潛力、和支持在人中每周一次給藥的藥代動力學(xué)(pk)特征。因此，本發(fā)明的一個實施方案提供式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps；其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)a-co-(ch2)b-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾，其中a為1至2，b為10至20；x3是phe或1-nal；并且c末端氨基酸任選被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:11)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)a-co-(ch2)b-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾，其中a為1至2，b為10至18；x3是phe；并且c末端氨基酸任選被酰胺化為c末端伯酰胺。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)a-co-(ch2)b-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾，其中a為1至2，b為10至18；x3是1-nal；并且c末端氨基酸任選被酰胺化為c末端伯酰胺。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)a-co-(ch2)b-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾，其中a為1至2，b為14至18；x3是phe或1-nal；并且c末端氨基酸任選被酰胺化為c末端伯酰胺。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了其中b為16至18的化合物。另外，本發(fā)明提供了其中b為18的化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)a-co-(ch2)b-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾，其中a為1，b為10至18；x3是phe或1-nal；并且c末端氨基酸任選被酰胺化為c末端伯酰胺。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)a-co-(ch2)b-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾，其中a為2，b為10至18；x3是phe或1-nal；并且c末端氨基酸任選被酰胺化為c末端伯酰胺。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)a-co-(ch2)b-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾，其中a為1至2，b為10至18；x3是phe或1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺。在一個實施方案中，本發(fā)明提供下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps；其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)1-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:3)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps；其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)2-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:4)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps；其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)1-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:5)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps；其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)2-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:6)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)2-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:7)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)1-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:8)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)2-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:9)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供下式的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：yx1egtgtsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)1-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:10)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明化合物和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供治療2型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療2型糖尿病的方法，該方法還包括同時、分開或相繼地與有效量的一種或多種選自二甲雙胍(metformin)、噻唑烷二酮類、磺酰脲類、二肽基肽酶4抑制劑和鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的試劑組合施用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種改善2型糖尿病成人中血糖控制的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物作為飲食和運(yùn)動的輔助劑。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種在具有初始體重指數(shù)(bodymassindex)≥27和2型糖尿病的成人中長期體重管理的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物作為低熱量飲食和增加的身體活動的輔助劑。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療代謝綜合征的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療與胰島素抗性和糖尿病相關(guān)的血脂異常、肥胖和/或肝脂肪變性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物。另外，本發(fā)明提供了治療虛弱或增加骨強(qiáng)度的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的化合物用于治療。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的化合物用于治療2型糖尿病。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供，本發(fā)明的化合物，與選自二甲雙胍、噻唑烷二酮類、磺酰脲類、二肽基肽酶4抑制劑和鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的一種或多種試劑，同時、分開或相繼組合用于治療2型糖尿病。在一個實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的化合物作為飲食和運(yùn)動的輔助劑用于2型糖尿病成人中的血糖控制。在一個實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的化合物在具有初始體重指數(shù)≥27和2型糖尿病的成人中作為低熱量飲食和增加的身體活動的輔助劑用于長期體重管理。在一個實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的化合物在制備用于治療2型糖尿病的藥物中的用途。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的化合物與選自二甲雙胍、噻唑烷二酮類、磺酰脲類、二肽基肽酶4抑制劑和鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的一種或多種試劑同時、分開或相繼組合用于制備用于治療2型糖尿病的藥物中的用途。本發(fā)明提供顯示平衡的gip和glp-1活性的化合物。本文所用的對gip和glp-1的平衡活性是指，在體外結(jié)合測定法中化合物對gip受體和glp-1受體的親和力的摩爾比接近1:1，如1:1glp-1/gip、2:1glp-1/gip、3:2glp-1/gip、1:2glp-1/gip或2:3glp-1/gip。本發(fā)明提供，與胰高血糖素和glp-2受體相比，對gip和glp-1受體顯示出選擇性的化合物。在本文中用于與胰高血糖素活性相比提及gip和glp-1活性時，術(shù)語“選擇性”或“(與……相比)選擇性”是指，當(dāng)來自相應(yīng)的體外結(jié)合測定法的數(shù)據(jù)歸一化后，化合物對gip和glp-1顯示出比對胰高血糖素高1000、500或約100倍的效力。當(dāng)在本文中用于與glp-2活性相比提及gip和glp-1活性時，術(shù)語“選擇性”或“(與……相比)選擇性”是指，當(dāng)來自相應(yīng)的體外功能測定法的數(shù)據(jù)歸一化后，化合物對gip和glp-1顯示出比對glp-2高250、200、100或約50倍的效力。本發(fā)明提供了一種用于治療患者中2型糖尿病的方法，包括向需要這種治療的患者施用有效量的本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明還提供了一種用于治療患者中2型糖尿病的方法，包括向需要這種治療的患者施用有效量的本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述施用是皮下的。本發(fā)明還提供了一種治療患者中2型糖尿病的方法，包括向需要這種治療的患者施用有效量的本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及同時、分開，或相繼施用有效量的一種或多種其他活性成分。在一個實施方案中，其他一種或多種活性成分是目前可獲得的口服降低葡萄糖的藥物，所述藥物來自在施用前被視為護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)的一類藥物(由諸如美國糖尿病協(xié)會(americandiabetesassociation)的行業(yè)指南確定)。本發(fā)明的化合物利用化學(xué)綴合至賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基的脂肪酸。該脂肪酸通過接頭綴合至賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基。接頭包含[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)a，其中a為1至2。脂肪酸和接頭中的γ-谷氨酸用作白蛋白結(jié)合劑，提供產(chǎn)生長效化合物的潛力。本發(fā)明的化合物包含位置20的賴氨酸，其通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)a-co-(ch2)b-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾，其中a為1至2，b為10至20。如實施例1和2的化學(xué)結(jié)構(gòu)所示，第一單元的[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基與賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基連接。然后將第二單元的[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；B接到第一單元的[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；陌被?。然后，將第一單元的γglu通過側(cè)鏈的γ-羧基基團(tuán)連接到第二單元的[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；陌被?。當(dāng)a＝2時，第二單元的γglu通過側(cè)鏈的γ-羧基與第一單元的γglu的α-氨基連接。最后，對稱的脂肪酸連接到第一(當(dāng)a＝1時)或第二(當(dāng)a＝2時)單元的γglu的α氨基上。本發(fā)明的化合物優(yōu)選配制成通過胃腸外途徑(例如皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或透皮)施用的藥物組合物。這樣的藥物組合物及其制備方法是本領(lǐng)域公知的。(參見例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy(d.b.troy編輯,第21版,lippincott,williams&wilkins,2006)。優(yōu)選的施用途徑是皮下。本發(fā)明的化合物可以與多種無機(jī)酸和有機(jī)酸中的任意反應(yīng)形成藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。藥學(xué)上可接受的鹽和制備它們的常用方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如p.stahl等人，handbookofpharmaceuticalsalts:properties,selectionanduse,第二修訂版(wiley-vch,2011)；s.m.berge,等人，“pharmaceuticalsalts,”journalofpharmaceuticalsciences,vol.66,no.1,1977年1月。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽包括三氟乙酸鹽、鹽酸鹽和乙酸鹽。如本文所用，術(shù)語“有效量”是指，本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的量或劑量，其以單個或多個劑量施用給患者時，在診斷或治療的患者中提供期望的效果。有效量可以由主治診斷醫(yī)師(作為本領(lǐng)域技術(shù)人員)，通過使用已知技術(shù)和通過觀察在類似情況下獲得的結(jié)果，容易地確定。在確定患者的有效量時，主治診斷醫(yī)師將考慮許多因素，包括但不限于：哺乳動物的種類；其大小、年齡和一般健康狀況；所涉及的具體疾病或病癥；疾病或病癥的累及程度或嚴(yán)重程度；個體患者的反應(yīng)；施用的具體化合物；施用方式；所施用的制劑的生物利用度特征；選擇的劑量方案；伴隨藥物的使用；和其他相關(guān)情況。如本文所用，術(shù)語“治療”包括抑制、減緩、停止或逆轉(zhuǎn)現(xiàn)有癥狀或病患的進(jìn)展或嚴(yán)重程度。如本文所用，“索馬魯肽”是指化學(xué)合成的glp-1類似物，其具有cas登記號910463-68-2中的肽骨架和整體化合物結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的某些化合物通常在寬劑量范圍內(nèi)有效。例如，每周一次給藥的劑量可以在每人每周約0.05至約30mg的范圍內(nèi)。本發(fā)明的某些化合物可以每天給藥。另外，本發(fā)明的某些化合物可以每周一次給藥。本發(fā)明的氨基酸序列含有二十種天然氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母或三字母代碼。另外，“aib”是α氨基異丁酸，“1-nal”是1-萘基丙氨酸。本發(fā)明還包括可用于合成本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受鹽的新的中間體和方法。本發(fā)明的中間體和化合物可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備。特別地，在下面的實施例中舉例說明了使用化學(xué)合成的方法。所描述的每一途徑的具體合成步驟可以以不同的方式組合，以制備本發(fā)明的化合物或其鹽。試劑和原料是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易獲得的。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)1-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:3)三氟乙酸鹽除了殘基aib2、aib13和k20之外，上述結(jié)構(gòu)含有標(biāo)準(zhǔn)單字母氨基酸代碼，其中aib2、aib13和k20氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)已經(jīng)展開。通過以下生成根據(jù)本發(fā)明的seqidno：3的肽：在symphony自動肽合成儀(ptiproteintechnologiesinc.)上使用fmoc/t-bu策略進(jìn)行固相肽合成，從rappam-rink酰胺樹脂開始，其中使用6當(dāng)量的用二異丙基碳二亞胺(dic)和羥基苯并三唑(hobt)活化的氨基酸(1：1：1摩爾比)在二甲基甲酰胺(dmf)中在25℃下90分鐘進(jìn)行偶聯(lián)。對于pro31、trp25、gln24、val23、phe22、lys20、gly4、glu3和aib2，延長偶聯(lián)(每個4h)對于改善粗肽質(zhì)量是必要的。使用fmoc-lys(alloc)-oh構(gòu)件(buildingblock)進(jìn)行l(wèi)ys20偶聯(lián)(正交保護(hù)基團(tuán))，以便稍后在合成過程中進(jìn)行脂肪酸結(jié)構(gòu)部分的位點(diǎn)特異性連接。以下條件用于位置12的fmoc-ile-oh偶聯(lián)：25℃，fmoc-ile-oh(6當(dāng)量)、pybop(6當(dāng)量)和diea(12當(dāng)量)，在dmf中，24小時。如上所述，使用dic-hobt方案，以boc-tyr(tbu)-oh形式引入n-末端殘基。在完成上述肽-樹脂延伸之后，在存在phsih3作為清除劑下，使用催化量的pd(pph3)4除去存在于lys20中的alloc保護(hù)基。使用fmoc/t-bu策略以延伸lys20側(cè)鏈的另外偶聯(lián)/去保護(hù)循環(huán)涉及fmoc-nh-peg2-ch2cooh(chempep目錄號#280102)、fmoc-glu(oh)-otbu(chempep目錄號#100703)和hooc-(ch2)18-cootbu)。在所有偶聯(lián)中，在25℃，使用3當(dāng)量的構(gòu)件與pybop(3當(dāng)量)和diea(6當(dāng)量)在dmf中4小時。在含有90:4:2:2:2(v/v)的三氯乙酸(tfa)：三異丙基硅烷：1,2-乙二硫醇：水：苯甲硫醚的溶液中、在25℃、2小時同時完成從樹脂切割和側(cè)鏈保護(hù)基去除，然后用冷乙醚沉淀。在c18柱上用水/乙腈(含有0.05％v/v的tfa)梯度，通過反相hplc色譜法，將粗肽純化至>99％純度(15-20％純化產(chǎn)率)，其中合并合適的級分并冷凍干燥。在基本上如上所述進(jìn)行的合成中，通過分析性反相hplc檢查實施例1的純度，并使用lc/ms確認(rèn)了化合物身份(觀察值：m+3h+/3＝1605.2；計算值m+3h+/3＝1605.5；觀察值：m+4h+/4＝1204.3；計算值m+4h+/4＝1204.4)。實施例2tx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)2-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:4)三氟乙酸鹽除了殘基aib2、aib13、k20和1-nal22之外，上述結(jié)構(gòu)含有標(biāo)準(zhǔn)單字母氨基酸代碼，其中這些氨基酸殘基aib2、aib13、k20和1-nal22的結(jié)構(gòu)已經(jīng)展開。與以上實施例1中所述類似地，合成根據(jù)本發(fā)明的seqidno：4的肽。以下條件用于位置22的fmoc-1nal-oh的偶聯(lián)：25℃，fmoc-1nal-oh(6當(dāng)量)、pybop(6當(dāng)量)和diea(12當(dāng)量)，在dmf中4小時。實施例3yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)1-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:5)三氟乙酸鹽與以上實施例1中所述類似地，合成根據(jù)本發(fā)明的seqidno：5的化合物。實施例4yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)2-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:6)三氟乙酸鹽與以上實施例1中所述類似地，合成根據(jù)本發(fā)明的seqidno：6的化合物。實施例5yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)2-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:7)三氟乙酸鹽與以上實施例1中所述類似地，合成根據(jù)本發(fā)明的seqidno：7的化合物。實施例6yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)1-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:8)三氟乙酸鹽與以上實施例1中所述類似地，合成根據(jù)本發(fā)明的seqidno：8的化合物。實施例7yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)2-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:9)三氟乙酸鹽與以上實施例1中所述類似地，合成根據(jù)本發(fā)明的seqidno：9的化合物。實施例8yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)1-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺(seqidno:10)三氟乙酸鹽與以上實施例1中所述類似地，合成根據(jù)本發(fā)明的seqidno：10的化合物。測定法以下提供了幾種測定法中用于實施例的條件和數(shù)據(jù)：體外功能和選擇性、免疫原性分析、藥代動力學(xué)和體內(nèi)2型糖尿病模型。體外功能和選擇性對人glp-1和gip受體的體外結(jié)合效力使用從過表達(dá)人glp1rcdna或人gip-rcdna的克隆細(xì)胞系獲得的粗細(xì)胞膜，通過測量結(jié)合親和力(ki)，評估本發(fā)明化合物對人gip和glp-1受體的體外結(jié)合效力。人葡萄糖依賴性促胰島素多肽受體結(jié)合測定法使用克隆到pcdna3.1(promega)-neor質(zhì)粒中的hgip-r(usdin,t.b.,gruber,c.,modi,w.andbonner,t.i.,genbank:aaa84418.1)。將hgip-r-pcdna3.1/neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢細(xì)胞cho-s，用于懸浮培養(yǎng)，并在500μg/ml遺傳霉素(invitrogen)存在下選擇。使用來自懸浮培養(yǎng)物的細(xì)胞，制備粗質(zhì)膜。在含有25mmtrishclph7.5、1mmmgcl2、dnase1，20μ/ml和rochecompletetm抑制劑(不含edta)的低滲緩沖液中，在冰上裂解細(xì)胞。細(xì)胞懸浮液使用研杵沖擊25次、用玻璃dounce均質(zhì)器均質(zhì)化。勻漿物在4℃、1800×g離心15分鐘。收集上清液，將沉淀重懸浮于低滲緩沖液中并重新均質(zhì)化。將混合物以1800×g離心15分鐘。將第二上清液與第一上清液組合。將組合的上清液以1800×g重新離心15分鐘以澄清。將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到高速管中，并在4℃下以25,000×g離心30分鐘。將膜沉淀物重懸浮于均質(zhì)化緩沖液中，并以冷凍等分試樣儲存在-80℃冷凍器中直至使用。gip通過i-125-乳過氧化物酶法(markalonis,j.j.,biochem.j.113:299(1969))進(jìn)行放射性碘化，并通過反相hplc(perkin-elmerlifeandanalyticalsciencesnex-402)純化。比活性為2200ci/mmol。通過使用冷hgip進(jìn)行同源競爭而非飽和結(jié)合，進(jìn)行kd測定。使用臨近閃爍分析法(spa)進(jìn)行受體結(jié)合測定，其中事先用1％無脂肪酸bsa(gibco，7.5％bsa)封閉小麥胚芽凝集素(wga)珠(perkinelmerlifeandanalyticalsciences)。結(jié)合緩沖液含有25mmhepes，ph7.4、2.5mmcacl2、1mmmgcl2、0.1％無脂肪酸bsa、0.003％tween20和rochecompletetm抑制劑(無edta)。將hgip和本發(fā)明化合物溶于100％dmso中并保存在-20℃。將化合物系列稀釋在結(jié)合緩沖液中。接下來，將10μl稀釋的化合物或100％dmso轉(zhuǎn)移到含有40μl測定結(jié)合緩沖液或冷gip(最終0.1μmnsb)的3632透明底測定板中。然后，加入90μl膜(3μg/孔)、50μl[125i]gip(perkinelmerlifeandanalyticalsciences，反應(yīng)終濃度為0.15nm)和50μlwga珠(150μg/孔)，密封，并在平板振蕩器上混合1分鐘。在室溫下放置12小時后，用閃爍計數(shù)器讀取板。以化合物存在下i-125-gip比結(jié)合百分?jǐn)?shù)，計算結(jié)果。通過i-125-gip的比結(jié)合百分?jǐn)?shù)vs加入的化合物濃度的非線性回歸，得出絕對ic50濃度。使用cheng-prusoff公式將ic50濃度轉(zhuǎn)化為ki。glp-1受體結(jié)合法測定使用從293hek膜分離的克隆的人胰高血糖素樣肽1受體(hglp-1r)(grazianomp,heypj,borkowskid,chicchigg,stradercd,biochembiophysrescommun.196(1):141-6,1993)。將hglp-1rcdna亞克隆到表達(dá)質(zhì)粒phd(完全γ-羧基化重組人蛋白c(抗血栓形成因子)的反式激活表達(dá)，grinnell,b.w.,berg,d.t.,walls,j.andyan,s.b.bio/technology5:1189-1192,1987)。將該質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染到293hek細(xì)胞中，并用200μg/ml潮霉素選擇。使用來自懸浮培養(yǎng)物的細(xì)胞制備粗質(zhì)膜。在含有25mmtrishcl，ph7.5、1mmmgcl2、dnase1，20μ/ml和rochecompletetm抑制劑(不含edta)的低滲緩沖液中，在冰上裂解細(xì)胞。細(xì)胞懸浮液使用研杵沖擊25次、用玻璃dounce均質(zhì)器均質(zhì)化。勻漿物在4℃、1800×g離心15分鐘。收集上清液，將沉淀重懸浮于低滲緩沖液中并重新均質(zhì)化。將混合物以1800×g離心15分鐘。將第二上清液與第一上清液組合。將組合的上清液以1800×g重新離心15分鐘以澄清。將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到高速管中，并在4℃下以25,000×g離心30分鐘。將膜沉淀物重懸浮于均質(zhì)化緩沖液中，并以冷凍等分試樣儲存在-80℃冷凍器中直至使用。胰高血糖素樣肽1(glp-1)通過i-125-乳過氧化物酶法進(jìn)行放射性碘化，并通過反相hplc在perkin-elmerlifeandanalyticalsciences(nex-308)純化。比活性為2200ci/mmol。因為i-125glp-1材料中高的丙醇含量，通過同源競爭而不是飽和結(jié)合進(jìn)行kd測定。kd估計為0.329nm，并用于計算所有測試化合物的ki值。使用臨近閃爍分析法(spa)進(jìn)行受體結(jié)合測定，其中事先用1％無脂肪酸bsa(gibco)封閉小麥胚芽凝集素(wga)珠。結(jié)合緩沖液含有25mmhepes，ph7.4、2.5mmcacl2、1mmmgcl2、0.1％無脂肪酸bsa、0.003％tween20和rochecompletetm抑制劑(無edta)。將胰高血糖素樣肽1以1mg/ml溶于100％dmso中并以30μl等分冷凍保存在-20℃。將胰高血糖素樣肽1等分試樣稀釋并在1小時內(nèi)用于結(jié)合測定中。將肽類似物溶于100％dmso并在100％dmso中系列稀釋。接下來，將10μl稀釋的本發(fā)明化合物或100％dmso轉(zhuǎn)移到含有40μl測定結(jié)合緩沖液或冷胰高血糖素(最終1μmnsb)的3632透明底測定板中。然后，加入90μl膜(0.5μg/孔)、50μli-125胰高血糖素樣肽1(反應(yīng)終濃度為0.15nm)和50μlwga珠(150μg/孔)，密封，并在平板振蕩器上混合1分鐘。在室溫放置12小時后，用perkinelmerlifeandanalyticalsciencestrilux閃爍計數(shù)器讀取板。以化合物存在下i-125-胰高血糖素樣肽1比結(jié)合百分?jǐn)?shù)計算結(jié)果。通過i-125-胰高血糖素樣肽1的比結(jié)合百分?jǐn)?shù)vs.加入的化合物濃度的非線性回歸，得出絕對ic50濃度。使用cheng-prusoff公式，將ic50濃度轉(zhuǎn)化為ki。在基本上如本測定法中所述進(jìn)行的實驗中，本發(fā)明的某些化合物顯示出約0.5-4.0的hglp-1r/hgipr比(表1)。將摩爾結(jié)合比，相對于天然gip和glp-1混合物的相應(yīng)摩爾比，進(jìn)行歸一化。基于gip(ki＝0.175nm)和glp-1(ki＝0.793nm)的結(jié)合數(shù)據(jù)，該歸一化因子為4.53。1.48的值表明實施例1的平衡共激動劑活性。表1：受體結(jié)合親和力，ki，nm(sem，n)平均值表示為幾何平均值，其中括號中給出平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)和重復(fù)次數(shù)(n)。限定符(>)表示數(shù)據(jù)未達(dá)到50％抑制，使用測定中測試的最高濃度計算ki。功能性hgip-r、hglp-1r和hgcgr測定。對于人gip、glp-1和胰高血糖素受體，在表達(dá)這些受體的hek-293克隆細(xì)胞系中測定本發(fā)明化合物對這些受體的體外功能活性。在40μl測定體積中，在補(bǔ)充有1xglutamaxtm(gibcocat#35050)、0.25％fbs、0.05％級分vbsa、250μmibmx和20mmhepes的dmem(gibcocat#31053)中，用本發(fā)明的化合物處理過表達(dá)每種受體的細(xì)胞系。在室溫下孵育60分鐘后，使用cisbiocampdynamic2htrf測定試劑盒(bedford，ma)定量測定產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)camp增加。簡言之，通過在細(xì)胞裂解緩沖液(20μl)中加入camp-d2綴合物、然后還在細(xì)胞裂解緩沖液(20μl)中加入抗體抗camp-eu3+-cryptate，檢測細(xì)胞內(nèi)的camp水平。所得的競爭性測定物在室溫下孵育至少60分鐘，然后使用perkinelmer儀器在320nm激發(fā)和665nm和620nm發(fā)射下檢測。設(shè)想單位(envisionunits)(665nm/620nm發(fā)射*10,000)與存在的camp量成反比，并且使用camp標(biāo)準(zhǔn)曲線將其轉(zhuǎn)化為每孔的nmcamp。每個孔中產(chǎn)生的camp量(nm)被轉(zhuǎn)化為用人gip(1-42)nh2、人glp-1(7-36)nh2或人胰高血糖素對照觀察到的最大反應(yīng)的百分比。通過使用最大反應(yīng)百分比vs.本發(fā)明化合物濃度的非線性回歸分析，擬合至四參數(shù)邏輯斯諦方程，得出相對ec50值和最大百分?jǐn)?shù)(emax)。在基本上如本測定法所述進(jìn)行的實驗中，本發(fā)明的某些化合物表現(xiàn)出對人gip和glp-1受體的活性，同時也顯示出對這些受體超出對胰高血糖素受體的選擇性。在表2中，針對天然hgip(1-42)nh2、hglp-1(7-36)nh2和人胰高血糖素對照以及本發(fā)明的某些化合物，顯示了對這些受體的功能效力。表2.對人gip、glp-1和胰高血糖素受體的功能效力(ec50)ec50的平均值表示為幾何平均值+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)，括號中顯示重復(fù)次數(shù)(n)。emax的平均值表示為算術(shù)平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差。nd表示沒有檢測到激動劑活性。限定符(>)表示無法測定ec50。所有顯示的值都至三位有效數(shù)字。功能激活hgip-r細(xì)胞以在分泌腸促胰島素的細(xì)胞系中產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)camp通過化合物在glutag細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)camp的能力來證明本發(fā)明化合物的hgip-r功能活性，glutag細(xì)胞是穩(wěn)定的、永生化、相對分化的鼠腸內(nèi)分泌細(xì)胞系，其表達(dá)胰高血糖素原基因并以被調(diào)節(jié)的方式分泌胰高血糖素樣肽。在補(bǔ)充有5.5mm葡萄糖、10％fbs和2mm谷氨酰胺的dmem培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2、95％濕度，保持細(xì)胞。在測定之前，胰蛋白酶處理細(xì)胞、沉淀并以20,000個細(xì)胞/孔的密度接種到96孔組織培養(yǎng)測定板中。使細(xì)胞貼壁，并在37℃、5％co2下孵育48小時。在測定當(dāng)天，從細(xì)胞中傾出培養(yǎng)基，并向細(xì)胞中加入50μl含有濃度范圍(0.001-3μm)的化合物的ebss緩沖液(0.1％bsa、2mm葡萄糖和0.25mmibmx)。將板在37℃孵育1小時，并使用cisbiodynamic2camphtrf試劑盒(bedford，ma)測定camp水平。將25μl抗camp穴狀化合物(cryptate)和25μlcampd2加入到每孔中，并在室溫下孵育板1小時。在tecangeniospro上，在620nm和665nm讀取板。從665nm/620nm比值乘以10000，計算結(jié)果，并使用camp標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化為每孔的nmcamp。使用4參數(shù)非線性邏輯斯蒂算法，用graphpad分析數(shù)據(jù)。在基本上如本測定法所述進(jìn)行的實驗中，本發(fā)明的某些化合物顯示劑量依賴性的、glutag細(xì)胞中增強(qiáng)的camp積累(表3)。天然glp-1對照在測試的所有濃度下都不能誘導(dǎo)camp的任何變化，表明該細(xì)胞系統(tǒng)僅表達(dá)gip受體；由此，證明本發(fā)明的某些化合物可以通過gip受體發(fā)揮作用。表3：glutag細(xì)胞中的ec50?；衔锲骄鵨c50,nm(n)實施例31610(1)實施例72746(1)實施例42186(1)實施例22918(1)實施例11494(2)天然gip11.62(3)測量瞬時表達(dá)人glp-2受體的hek293細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)camp通過測量hek293細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)camp來證明在本發(fā)明化合物存在下的hglp-2r功能活性。將這些細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中傳代，在懸浮液中用promegafugene6試劑和pcdna3.1表達(dá)載體中人全長glp-2rcdna進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并使其在加濕的37℃、5％co2環(huán)境中貼壁到組織培養(yǎng)瓶。在大約48小時增殖后，提起(lift)細(xì)胞、株化(strain)，用受控冷凍速率冷凍保存，10％dmso作為冷凍保護(hù)劑。在隨后的測定中，解凍來自相同細(xì)胞冷凍物的單個測定即用的小瓶以最小化測定間的差異。在細(xì)胞測定當(dāng)天，用含有0.5％fbs的invitrogen31053dmem交換冷凍培養(yǎng)基。在處理前，計數(shù)細(xì)胞存活力并在37℃平衡約1至2小時。將本發(fā)明的化合物溶于dmso中，并立即稀釋于含0.1％級分vbsa和非特異性磷酸二酯酶抑制劑ibmx的dmem培養(yǎng)基中。在37℃處理時間為30分鐘。最終的dmso濃度不超過1.1％，最終的ibmx濃度為250μm。通過均相時間分辨熒光技術(shù)(cisbiobioassays，bedford，ma)，使用dynamic2測定法測量環(huán)amp。相應(yīng)camp濃度由比值計算法和外部標(biāo)準(zhǔn)推出。使用四參數(shù)邏輯斯蒂方程，檢驗測試化合物的s形劑量反應(yīng)，并與天然c18?；潴w進(jìn)行比較。在基本上如本測定法所述進(jìn)行的實驗中，對于受體活化，c18?；娜薵lp-2對照具有1.71nm的ec50值，而本發(fā)明的某些化合物具有約100x至1000x更高的ec50值。本發(fā)明某些化合物的ec50值表現(xiàn)出，不利于glp-2受體的選擇性。表4：hek293細(xì)胞中g(shù)lp-2r功能活性測定。化合物relec50(nm)nglp2-c18-二酸1.8574實施例3199.34實施例71,8004實施例44052實施例12384實施例216122嚙齒動物胰島的胰島素分泌為了評估本發(fā)明化合物在呈現(xiàn)生理性glp-1r和gip-r表達(dá)水平的胰島素分泌系統(tǒng)中對胰島素分泌的作用，測試了化合物對野生型嚙齒動物胰島的胰島素分泌的影響。在雄性c57bl/6小鼠(22-26g)或雄性sprague-dawley大鼠(約250g)中膽總管插管后，用hank's緩沖液(3ml用于小鼠或10ml用于大鼠，其含有2％bsa和0.75mg/mlclzyme膠原酶(vitacyte))擴(kuò)張胰腺。隨后，在37℃在hank's緩沖液中消化組織11-13分鐘(小鼠)或14-16分鐘(大鼠胰腺)。在含有10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的rpmi-1640培養(yǎng)基(invitrogen)中培養(yǎng)純化的胰島(histopaque-1100梯度[sigma-aldrich]，以750x重力，18分鐘)過夜，并在補(bǔ)充有0.1％bsa和2.8mm葡萄糖的earle’s平衡鹽溶液(ebss)中通過饑餓預(yù)調(diào)節(jié)。然后將胰島在補(bǔ)充有0.1％bsa、2.8-11.2mm葡萄糖和遞增水平的化合物的ebss(invitrogen)中孵育(6批，4個胰島/條件)。glp-1(7-36)酰胺(30nm)用作陽性對照。使用msd胰島素測定法(mesoscale，gaithersburg，md)經(jīng)90分鐘測定上清液中的胰島素。如表5所示，本發(fā)明的某些化合物劑量依賴性地增加自大鼠和小鼠胰島的胰島素分泌。表5.嚙齒動物胰島的胰島素分泌免疫原性分析使用計算機(jī)(insilico)預(yù)測程序(如epivax計算機(jī)分析)，評估本發(fā)明化合物的免疫原性風(fēng)險。還通過離體法測定在本發(fā)明化合物存在下培養(yǎng)的t細(xì)胞應(yīng)答(3h-胸苷攝取和il-2細(xì)胞因子分泌)來評估本發(fā)明化合物的免疫原性風(fēng)險。使用epivax免疫信息工具，對本發(fā)明的化合物進(jìn)行計算機(jī)評估以預(yù)測施用后的免疫應(yīng)答。該分析利用9-mer框架結(jié)合給定的人白細(xì)胞抗原白細(xì)胞抗原(hla)等位基因的概率，然后檢測這些epi-bars。對于實施例1，約+1.13的epimatrix評分表明，與天然gip肽骨架(epimatrix評分為+15.4)相比，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的潛力低得多。來自wo2011/119657的gip/glp-1共激動劑實施例的評分為+29.5。此外，通過在代表全球hla同種異型群的50名健康供體組群中表征cd4+t細(xì)胞增殖和il-2細(xì)胞因子分泌，檢查本發(fā)明化合物的預(yù)測臨床免疫原性。本發(fā)明的某些化合物顯示，暴露后的t細(xì)胞刺激和il-2分泌程度不超過與已知或陽性免疫原性化合物相關(guān)的閾值，表明產(chǎn)生臨床免疫原性的風(fēng)險低。藥代動力學(xué)食蟹猴中的藥代動力學(xué)。使用食蟹猴(cynomolgusmonkey)，闡明本發(fā)明化合物的體內(nèi)藥代動力學(xué)性質(zhì)。在20mm檸檬酸鹽緩沖液(ph7.0)中以0.21ml/kg的體積，施用單個靜脈內(nèi)或皮下劑量(0.2mg/kg)的化合物。在給藥后2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、204、240和312小時，從每只動物收集血液。通過lc/ms法測定本發(fā)明化合物的血漿濃度。簡言之，從1xpbs(150μl)稀釋的100％猴血漿樣品(50μl)提取本發(fā)明的化合物，并與n-丁醇(400μl)混合。形成三個不同的液體層，其中化合物位于頂層。將200μl的體積轉(zhuǎn)移到v-底96孔板中，使用加熱的氮?dú)飧稍铮⒂?00μl30％乙腈/0.1％甲酸重構(gòu)。將20μl重構(gòu)樣品注射到supelcoanalyticaldiscoverybio寬c53μm柱上。將柱流出物導(dǎo)入thermoq-exactive質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測和定量。在基本上如本測定法所述進(jìn)行的實驗中，實施例1在皮下給藥后約8小時達(dá)到平均最大血漿濃度。平均半衰期為55小時，平均清除率為0.73ml/hr/kg。生物利用度約為83％。該數(shù)據(jù)支持實施例1的每周一次給藥的可能性。本發(fā)明其他化合物的數(shù)據(jù)總結(jié)在表6中。表6：向雄性食蟹猴單次皮下給藥0./2mgkg后平均藥代動力學(xué)參數(shù)n＝2，auc0-inf＝從0到無窮大的曲線下面積，cl/f＝清除率/生物利用度，tmax＝到最大濃度的時間，cmax＝最大血漿濃度，t1/2＝半衰期。劑量效價強(qiáng)度估計使用大鼠中靜脈內(nèi)葡萄糖耐量試驗(ivgtt)來估計本發(fā)明化合物與索馬魯肽相比的相對效價強(qiáng)度(potency)。向大鼠施用單次皮下(sc)劑量0.1-10nmol/kg的各化合物，并在給藥后16小時向每只大鼠施用ivgtt。在ivgtt時測量暴露，并且對于暴露反應(yīng)建模，將響應(yīng)于ivgtt的胰島素auc用作主要終點(diǎn)。使用emax模型，將實施例1的暴露反應(yīng)曲線與索馬魯肽進(jìn)行比較。在基本上如該測定法所述進(jìn)行的實驗中，對于這些劑量水平，實施例1的暴露基本上與索馬魯肽相同(藥物水平高于測定法定量限)。兩個數(shù)據(jù)集同時進(jìn)行擬合，兩個化合物的e0和emax值被限制為相同。只有ed50值針對化合物分別擬合。索馬魯肽的ed50值估計為0.6+/-0.2nmol/kg。實施例1的效價強(qiáng)度被估計為相對于索馬魯肽的相對效價強(qiáng)度，是索馬魯肽效價強(qiáng)度的1.7+/-0.6倍。針對食蟹猴中兩個分子之間的cl/f(表觀清除率)差異以及還針對分子量差異，進(jìn)行調(diào)整后，對于實施例1，與1mg索馬魯肽等價的估計平均人劑量為約1.3mg/周。2型糖尿病靜脈內(nèi)施用葡萄糖后大鼠體內(nèi)的胰島素分泌(ivgtt)將雄性wistar大鼠(harlanlabs，indianapolis，in)按體重隨機(jī)分組，并在葡萄糖施用前16小時s.c.給藥1.5ml/kg，然后禁食。劑量為賦形劑(vehicle)、0.1、0.3、1、3和10nmol/kg。將動物稱重，然后用戊巴比妥鈉(nembutalsodiumsolution；ovationpharmaceuticals)i.p.給藥(65mg/kg，30mg/ml)麻醉。在零時間收集血樣到edta管中，之后施用葡萄糖(0.5mg/kg，5ml/kg)。在葡萄糖后2、4、6、10、20和30分鐘收集血樣。使用hitachi分析儀(roche)測定血漿葡萄糖水平，并通過msd胰島素測定法(mesoscale，gaithersburg，md)測量血漿胰島素。如表7所示，本發(fā)明的某些化合物劑量依賴性地增強(qiáng)i.v.注射葡萄糖之后的胰島素分泌。在表7中給出胰島素的ed50和胰島素分泌的最大增加(以胰島素曲線下面積量度)。表7.大鼠ivgtt測定中胰島素分泌的增強(qiáng)化合物ed50(nmol/kg)％胰島素的最大增加auc實施例31.00314+/-38％實施例31.42219+/-19％實施例62.58289+/-4％實施例74.33335+/-35％實施例71.10278+/-26％實施例86.13324+/-30％索馬魯肽0.70231+/-13％實施例21.62233+/-19％實施例10.87298+/-17％實施例51.02349+/-39％在飲食誘導(dǎo)的肥胖(dio)小鼠中對體重減輕、身體組成和肝脂肪變性的影響在c57/bl6dio小鼠中評估本發(fā)明化合物對dio小鼠的體重減輕、身體組成和肝脂肪變性的影響。這些動物雖然不是糖尿病，但是在給予高脂肪(60％kcal來自脂肪)飲食12周后，顯示胰島素抗性、血脂異常和肝脂肪變性，這些都是代謝綜合征的特征。在本研究中，使用23-24周齡的雄性飲食誘導(dǎo)的肥胖(dio)c57/b16雄性小鼠，每只體重41-49g，具有初始脂肪量為10.5-17.5g。動物分別安置在溫度控制(24℃)的設(shè)施中，12小時光/暗循環(huán)(照明在22：00)，并可自由獲得食物和水。在適應(yīng)該設(shè)施2周后，根據(jù)體重將小鼠隨機(jī)分配至處理組(n＝5/組)，因此每組具有相似的起始平均體重。賦形劑對照、本發(fā)明的化合物(劑量范圍10-100nmol/kg)或長效glp1類似物索馬魯肽(30nmol/kg)溶解在賦形劑(20mm檸檬酸鹽緩沖液，ph7.0)中，在黑暗周期開始前30-90分鐘，通過sc注射施用給自由攝食的dio小鼠，每三天一次，持續(xù)15天。在第1、4、7、10和13天進(jìn)行sc注射。在整個研究中測量每日體重和食物攝取量。通過減去在第一次注射化合物之前相同動物的體重來計算體重的絕對變化。在第0天和第14天，使用回波醫(yī)療系統(tǒng)(houston，tx)儀器通過核磁共振(nmr)測量總脂肪量。在第15天，使用accu-chek血糖儀(roche)從尾靜脈血測量血糖，然后處死動物，取出肝臟并冷凍。在hitachimodularp臨床分析儀上測量肝臟甘油三酯(從處死時收集的肝勻漿物確定)和血漿膽固醇。使用單因素方差分析(one-wayanova)以及隨后通過dunnett′s多重比較檢驗，進(jìn)行組間的統(tǒng)計學(xué)比較。使用非線性擬合工具在graphpadprism中確定體重減輕降低的ed50。在基本上如該測定法所述進(jìn)行的實驗中，本發(fā)明的某些化合物以劑量依賴的方式降低體重和脂肪量(表8-13)，與索馬魯肽相比，在降低體重方面可以是3-5倍更有效。實施例1的體重減輕百分比的ed50為5.422nmol/kg(95％置信區(qū)間[nmol/kg]＝2.2至13.6)。發(fā)現(xiàn)降低的體重主要是由于脂肪量的減少。表8.dio小鼠中體重或脂肪量變化的百分?jǐn)?shù)**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001相對于對照組(one-wayanova，dunnett’s).結(jié)果表示為每組5只小鼠的平均值±sem。表9.dio小鼠的體重或脂肪量變化的百分?jǐn)?shù)****p＜0.0001相對于對照組(one-wayanova，dunnett’s).結(jié)果表示為每組5只小鼠的平均值±sem。表10.dio小鼠中體重或脂肪量變化的百分?jǐn)?shù)****p＜0.001相對于對照組(one-wayanova，dunnett’s).結(jié)果表示為每組5只小鼠的平均值±sem。表11.dio小鼠的血糖、血漿膽固醇和血漿甘油三酯*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001相對于對照組(one-wayanova，dunnett’s).結(jié)果表示為每組5只小鼠的平均值±sem。表12.dio小鼠的血糖、血漿膽固醇和肝臟甘油三酯*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001相對于對照組(one-wayanova，dunnett’s).結(jié)果表示為每組5只小鼠的平均值±sem。表13.dio小鼠的血糖和血漿膽固醇*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001相對于對照組(單因素方差分析，dunnett's)。結(jié)果表示為每組5只小鼠的平均值±sem。對dio小鼠能量代謝的影響在26周齡的c57/bl6dio雄性小鼠(重量為43-50g)中評估了本發(fā)明的化合物對dio小鼠中能量代謝的影響。小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)在溫度控制(24℃)的設(shè)施中，12小時光/暗循環(huán)(照明在22:00)，并可自由獲得食物td95217(teklad)和水。在適應(yīng)設(shè)施2周后，將小鼠基于體重隨機(jī)分配至處理組(n＝6/組)，因此每組具有相似的起始平均體重。將動物放置在phenomaster/labmaster量熱計(tsesystems，chesterfield，mo)中適應(yīng)環(huán)境3天。賦形劑對照(20mm檸檬酸鹽緩沖液，ph7.0，10ml/kg)、本發(fā)明的化合物或長效glp1類似物索馬魯肽(30nmol/kg)，在黑暗周期開始前30-90分鐘，皮下施用給自由攝食的dio小鼠，每三天一次，持續(xù)22天。使用開路量熱系統(tǒng)(open-circuitcalorimetrysystem)，通過如所述的間接量熱法，測量熱和呼吸商(rer)。rer是產(chǎn)生的二氧化碳體積(vco2)與消耗的o2體積(vo2)的比率?？紤]全身重量，熱計算為：vo2＝flowml*(v1+v2)/n2ref*動物體重*100)vco2＝flowml*dco2/動物體重*100)熱＝(cvo2*vo2+cvco2*vco2)/1000；其中cvo2＝3.941；cvco2＝1.106在基本上如該測定法所述進(jìn)行的實驗中，用實施例1處理的小鼠與對照組相比，從第2周開始，其代謝率顯著增加10至15％，并在整個處理期間維持該效果。然而，索馬魯肽對代謝率沒有影響。對于實施例1，代謝率的增加部分說明了，與索馬魯肽處理相比，通過實施例1的處理觀察到的額外體重減輕。對dio小鼠胃排空的影響在23周齡飲食誘導(dǎo)的肥胖(dio)雄性小鼠(harlan)中評估本發(fā)明的化合物對dio小鼠胃排空的影響。小鼠禁食16-17小時。在禁食期開始時，小鼠皮下給藥賦形劑對照(20mm檸檬酸鹽緩沖液，ph7.0)；遞增劑量的本發(fā)明化合物(3、10、30和100nmol/kg)或長效glp1類似物索馬魯肽(30nmol/kg)。第二天，通過經(jīng)口管飼，給小鼠施用0.5ml(0.5克)新鮮制備的半流體飲食(2分鐘間隔)。此時除去水，以防止稀釋施用的飲食。在飲食施用后兩小時，將小鼠用co2氣體分兩分鐘安樂死。夾住心臟和幽門開口，取出胃，然后移走夾具，將全胃稱重。然后將胃切開并將內(nèi)容物除去。將胃洗滌、干燥并重新稱重以評估胃中的食物含量。胃排空量％等于100×(1-(胃中的殘留食物/口服施用的食物))。在基本上如該測定法所述進(jìn)行的實驗中，實施例1以劑量依賴性的方式減緩半流體飲食的胃排空速率。在10nmol/kg+/-劑量下觀察到胃排空的最大抑制(表14)。表14.瘦的c57/bl6dio小鼠中半流體飲食的胃排空。處理劑量(nmol/kg)胃排空百分?jǐn)?shù)(平均值±sem)賦形劑(n＝5)069.50+/-6.60索馬魯肽(n＝5)3030.56+/-7.53**實施例1(n＝4)349.11+/-8.52實施例1(n＝5)109.76+/-7.69****實施例1(n＝5)3026.53+/-8.14**實施例1(n＝5)10018.45+/-6.87***使用單因素方差分析(one-wayanova)以及隨后通過dunnett's多重比較檢驗，進(jìn)行組間的統(tǒng)計學(xué)比較。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001相對于對照組。結(jié)果表示為每組4-5只小鼠的平均值±sem。在spraguedawley大鼠中血漿皮質(zhì)酮測量如在某些已發(fā)表的研究中所提示的，升高的血漿皮質(zhì)酮水平是對gip和glp-1類似物可能降低的耐受性的指征。使用spraguedawley大鼠(harlan，indianapolis)評估血漿皮質(zhì)酮水平，所述spraguedawley大鼠重約220g，在操作前適應(yīng)環(huán)境至少72小時。然后向大鼠s.c.給藥賦形劑(20mm檸檬酸鹽緩沖液，ph7)、索馬魯肽(10nmol/kg)或本發(fā)明化合物3、10或30nmol/kg，其中每個劑量組8只大鼠。16小時后將大鼠斷頭。將血液在冰上收集到edta管中，然后在eppendorf5402臺面離心機(jī)中以8000rpm離心5分鐘。將血漿儲存在-80℃直到分析。對于皮質(zhì)酮分析，通過在hplc級甲醇、h2o中系列稀釋和加入5％活性炭處理的大鼠血清(bioreclamation,ratsrm-strpd-hev)，制備皮質(zhì)酮標(biāo)準(zhǔn)品(sigma，27840)。用pbs稀釋大鼠血漿樣品，用冷甲醇沉淀，在-20℃下孵育20分鐘，然后在4℃用eppendorf5417r以14,000rpm離心。提取上清液，在n2氣流下蒸發(fā)，并在meoh/h2o(1:1)溶液中重構(gòu)。在裝有xselectcshc183.5μmhplc柱(2.1mm×30mm)(waters#186005254)的lc/ms上分析樣品。在基本上如該測定法所述進(jìn)行的實驗中，實施例1表明在任何所測試的劑量下血漿皮質(zhì)酮水平均沒有增加，而索馬魯肽與對照組相比有約4倍的增加。表15：spraguedawley大鼠中血漿皮質(zhì)酮分析氨基酸序列seqidno:1(人gip)yaegtfisdysiamdkihqqdfvnwllaqkgkkndwkhnitqseqidno:2(人glp-1)haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrseqidno:3yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)1-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺。seqidno：4yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)2-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺。seqidno：5yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)1-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺。seqidno：6yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)2-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺。seqidno：7yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)2-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺。seqidno：8yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)1-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺。seqidno：9yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)2-co-(ch2)16-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺。seqidno：10yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)2-(γglu)1-co-(ch2)18-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾；x3是1-nal；并且c末端氨基酸被酰胺化為c末端伯酰胺。seqidno：11yx1egtftsdysix2ldkiaqkax3vqwliaggpssgappps其中x1是aib；x2是aib；在位置20的k通過用([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙?；?2-(γglu)a-co-(ch2)b-co2h綴合至k側(cè)鏈的ε-氨基而化學(xué)修飾，其中a為1至2，b為10至20；x3是phe或1-nal；并且c末端氨基酸任選被酰胺化為c末端伯酰胺。當(dāng)前第1頁12