本發(fā)明涉及一種益生菌篩選方法，尤其是一種操作簡單、篩選效率高的用于建立臨床營養(yǎng)菌種資源庫的益生菌篩選方法。
背景技術(shù)：
益生菌是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。人體、動物體內(nèi)有益的細(xì)菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳桿菌、雙歧桿菌、放線菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌等等。益生菌可治療的疾病較多，如參與維生素的合成，參與膽固醇代謝，調(diào)節(jié)膽固醇相關(guān)性疾??；防治過敏（食物過敏，哮喘，鼻炎），預(yù)防濕疹；治療抗生素相關(guān)腹瀉、緩解ibs、ibd、細(xì)菌性陰道炎，泌尿生殖道感染、壞死性小腸結(jié)腸炎；控制高血壓，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能和障礙；抗幽門螺旋菌感染；提高免疫抵抗感染；也可調(diào)節(jié)乳糖不耐癥等等。由于單個(gè)菌種功能具有局限性，因此已有文獻(xiàn)報(bào)道將以上各類微生物復(fù)配而成的復(fù)合活性益生菌治療疾病效果更好。但是，現(xiàn)有益生菌的篩選方法復(fù)雜、效率低，故目前能夠真正用于臨床和營養(yǎng)的菌株有限，難以建立臨床營養(yǎng)菌種資源庫，臨床復(fù)配沒有理論根據(jù)，不能針對個(gè)體化差異進(jìn)行調(diào)整，導(dǎo)致治療效果不夠理想。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種操作簡單、篩選效率高的用于建立臨床營養(yǎng)菌種資源庫的益生菌篩選方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種用于建立臨床營養(yǎng)菌種資源庫的益生菌
篩選方法，其特征在于依次按照如下步驟進(jìn)行：
a.分別采集代謝功能好、免疫力強(qiáng)及抗感染能力強(qiáng)的人群新鮮糞便為標(biāo)本；
b.用選擇性培養(yǎng)基篩選出各種益生菌菌株；
c.通過試驗(yàn)進(jìn)一步篩選出具有促進(jìn)抑菌、生物拮抗功能的優(yōu)良益生菌菌株、具有促進(jìn)代謝功能的優(yōu)良益生菌菌株及促進(jìn)免疫功能的優(yōu)良益生菌菌株：
c.1.根據(jù)基本生物特性進(jìn)行篩選
進(jìn)行對酸性環(huán)境和膽汁的耐受能力、細(xì)菌的粘附能力試驗(yàn)，將耐受能力好、粘附能力強(qiáng)的菌株作為初步篩選菌株進(jìn)行下一步篩選；
c.2.定植抗力功能體外篩選
對初步篩選的菌株進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，篩選能有效抑制病菌的益生菌菌株，所述病菌為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和白色念珠菌；
c.3.促進(jìn)代謝功能體外篩選
通過檢測初步篩選的菌株的胰蛋白酶、胃蛋白酶、胞外蛋白酶、肽酶、乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶等活性，篩選具有不同代謝功能的益生菌菌株；
c.4促進(jìn)免疫功能體外篩選
以pbmc作為體外免疫篩選的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，檢測初步篩選的菌株對pbmc細(xì)胞因子分泌的影響，篩選免疫刺激功能強(qiáng)的益生菌菌株。
所述a步驟采集標(biāo)本后向樣本中添加益生菌培養(yǎng)基及羊血，4℃保存最多4天。
本發(fā)明首先是建立基于功能的定向收集體系提高初篩效率；進(jìn)而建立了適宜的糞便標(biāo)本運(yùn)送保存體系，延長了糞便標(biāo)本的有效運(yùn)送時(shí)間2~4倍，保證了分離存活的益生菌菌種數(shù)量；最后按照特定的優(yōu)選試驗(yàn)方法分別篩選出具有促進(jìn)抑菌及生物拮抗功能、促進(jìn)代謝功能和促進(jìn)免疫功能功能的優(yōu)良菌種，操作簡單、篩選效率高，可用于建立臨床營養(yǎng)菌種資源庫，以便針對個(gè)體化差異進(jìn)行益生菌復(fù)配選用，提高治療效果。
具體實(shí)施方式
一種用于建立臨床營養(yǎng)菌種資源庫的益生菌篩選方法，依次按照如下步驟進(jìn)行：
a.分別采集代謝功能好、免疫力強(qiáng)及抗感染能力強(qiáng)的人群新鮮糞便為標(biāo)本；如采集的標(biāo)本需要長時(shí)間運(yùn)輸，則向樣本中添加益生菌培養(yǎng)基及羊血，4℃
保存最多4天；
b.用選擇性培養(yǎng)基篩選出各種益生菌菌株；
c.通過試驗(yàn)進(jìn)一步篩選出具有促進(jìn)抑菌、生物拮抗功能的優(yōu)良益生菌菌株、具有促進(jìn)代謝功能的優(yōu)良益生菌菌株及促進(jìn)免疫功能的優(yōu)良益生菌菌株：
c.1.根據(jù)基本生物特性進(jìn)行篩選
進(jìn)行對酸性環(huán)境和膽汁的耐受能力、細(xì)菌的粘附能力試驗(yàn)，將耐受能力好、粘附能力強(qiáng)的菌株作為初步篩選菌株進(jìn)行下一步篩選；
c.2.定植抗力功能體外篩選
對初步篩選的菌株進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，篩選能有效抑制病菌的益生菌菌株，所述病菌為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和白色念珠菌；
c.3.促進(jìn)代謝功能體外篩選體系
通過檢測初步篩選的菌株的胰蛋白酶、胃蛋白酶、胞外蛋白酶、肽酶、乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶等活性，篩選具有不同代謝功能的益生菌菌株；
c.4促進(jìn)免疫功能體外篩選體系
以較易于分離培養(yǎng)且具有較好的免疫刺激反應(yīng)的pbmc（外周血單個(gè)核細(xì)胞）作為體外免疫篩選的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，檢測初步篩選的菌株對pbmc細(xì)胞因子分泌的影響，篩選免疫刺激功能強(qiáng)的益生菌菌株。
實(shí)驗(yàn)：
耐酸性能力低和耐酸性能力高的菌株分為兩組，分別對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，耐酸性能力低和耐酸性能力高的菌株抑菌能力有顯著差別（p<0.05）。耐酸性能力與抑菌能力相關(guān)（大腸埃希菌r=0.465，p<0.05；金黃色葡萄球菌r=0.384，p<0.05）。因此，可以通過c.1初步篩選出具有一定抑菌能力的益生菌。