本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。特別是涉及一種定性檢測棉花材料中MON531轉(zhuǎn)化體的PCR檢測試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)基因棉花是全球種植的主要轉(zhuǎn)基因作物之一，也是我國種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。2015年，我國轉(zhuǎn)基因棉花種植面積達(dá)到370萬公頃，占棉花總種植面積96％，高于2014年93％的比例。目前我國批準(zhǔn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因棉花主要有國內(nèi)研發(fā)的轉(zhuǎn)crylAb/Ac融合基因的抗蟲棉和轉(zhuǎn)基因crylAc基因的抗蟲棉MON531轉(zhuǎn)化體(http://www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/)。轉(zhuǎn)基因棉花MON531轉(zhuǎn)化體是由孟山都公司研發(fā)的抗蟲棉品種，已在美國、中國、加拿大、澳大利亞等20多個(gè)國家和地區(qū)批準(zhǔn)種植或允許用作食品飼料原料(http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp？EventID＝54)。

轉(zhuǎn)基因性狀與其他生物性狀一樣，可以根據(jù)其自交或雜交產(chǎn)生后代中的分離情況來判定其是純合或雜合。在育種過程中，獲得純合體是一個(gè)非常關(guān)鍵的步驟，也是保證種子質(zhì)量的重要的因素。傳統(tǒng)的區(qū)分轉(zhuǎn)基因植株純雜合方法是通過檢測自交產(chǎn)生的子一代是否發(fā)生分離以及計(jì)算分離比進(jìn)行的，不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且浪費(fèi)了子一代的寶貴資源。而快速高效地篩選純合植株，可顯著加快轉(zhuǎn)基因植株的育種進(jìn)程，因此鑒別轉(zhuǎn)基因植株純雜合方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

在分子水平上鑒別轉(zhuǎn)基因植株純雜合可以通過PCR方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)序列和兩端的基因組序列來鑒別單個(gè)植株或單粒種子的純雜合狀態(tài)。目前種植的棉花絕大部分屬于陸地棉品種，陸地棉的基因組是異源四倍體，也就是由具有高度相似的兩個(gè)二倍體組成。因此在鑒別轉(zhuǎn)基因棉花的純雜合時(shí)，插入位點(diǎn)基因組的擴(kuò)增會(huì)受到其同源染色體上序列的干擾，鑒別比較困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明比較了轉(zhuǎn)基因棉花MON531插入位點(diǎn)的棉花基因組序列與其同源染色體序列差異，設(shè)計(jì)和驗(yàn)證了特異性的引物組合，建立了快速鑒定轉(zhuǎn)基因棉花MON531純雜合方法，可檢測待待測棉花材料是MON531轉(zhuǎn)化體，并鑒別出特定個(gè)體的純雜合狀態(tài)。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

一種定性檢測棉花材料中MON531轉(zhuǎn)化體的PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括粉劑或溶液狀的以下三條引物

531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’，

531-TR：5‘-CTCGCACACGGCTTCGAC-3’，

531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括進(jìn)行PCR反應(yīng)的通用試劑。

一種鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲棉MON531轉(zhuǎn)化體純雜合狀態(tài)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)制備待測棉花材料的DNA作為模板，

(2)在PCR反應(yīng)體系中加入以下序列所示的三條引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’，

531-TR：5‘-CTCGCACACGGCTTCGAC-3’，

531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’。

(3)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，

擴(kuò)增出一條529bp條帶的樣品為純合的MON531轉(zhuǎn)化體，

同時(shí)擴(kuò)增出613bp和529bp兩條條帶的樣品為雜合MON531轉(zhuǎn)化體；

僅擴(kuò)增出613bp條帶的樣品不是或不含有MON531轉(zhuǎn)化體。

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

總體積20μL中GoGreenMaster Mix 10μL，10μmol/L的531-GF、531-GR和531-TR各1μL，DNA模板2μL，其余為超純水至20μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃保溫10min。

對于檢測有限群體中MON531轉(zhuǎn)化體的比例，也可以采用上述定性方法，具體如下：一種檢測棉花材料群體中轉(zhuǎn)基因抗蟲棉MON531轉(zhuǎn)化體含量的方法，包括如下步驟：

(1)隨機(jī)選取待測棉花材料群體中的多個(gè)材料，分別提取每種所選材料的DNA，

(2)采用以下三條引物組成的引物組對每種所選材料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’，

531-TR：5‘-CTCGCACACGGCTTCGAC-3’，

531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’。

(3)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，

擴(kuò)增出一條529bp條帶的樣品為純合的MON531轉(zhuǎn)化體，

同時(shí)擴(kuò)增出613bp和529bp兩條條帶的樣品為雜合MON531轉(zhuǎn)化體；

僅擴(kuò)增出613bp條帶的樣品不是或不含有MON531轉(zhuǎn)化體；

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

總體積20μL中GoGreenMaster Mix 10μL，10μmol/L的757-GF、757-GR和757-TR各1μL，DNA模板2μL，其余為超純水至。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃保溫10min。

本發(fā)明在MON531轉(zhuǎn)化體插入位點(diǎn)兩側(cè)基因組上設(shè)計(jì)引物，以及插入序列上設(shè)計(jì)引物，三條引物分別擴(kuò)增插入位點(diǎn)的棉花基因組序列和5’連接區(qū)序列，在MON531轉(zhuǎn)化體純合樣品中，僅能獲得5’連接區(qū)序列的529bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而在含有轉(zhuǎn)化體的基因組中，插入位點(diǎn)的引物之間的片段為包括完整插入片段的區(qū)域，預(yù)期超過10kb，這么長的片段在普通PCR條件下則不能獲得擴(kuò)增；而不含MON531轉(zhuǎn)化體的樣品中，僅能獲得棉花基因組序列的613bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，純合MON531轉(zhuǎn)化體植株僅擴(kuò)增得到一條529bp的片段，雜合植株得到529bp和613bp兩條條帶，不含MON531轉(zhuǎn)化體的植株只得到一條613bp的條帶，這與預(yù)期結(jié)果完全一致。因此，建立的MON531轉(zhuǎn)化體定性PCR方法能有效地鑒別MON531轉(zhuǎn)化體及其存在狀態(tài)。

綜上，因此本發(fā)明為特異性鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲棉MON531轉(zhuǎn)化體提供了便利，這些方法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、靈敏度高、特異性好、所需實(shí)驗(yàn)條件不高，鑒于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉MON531轉(zhuǎn)化體在我國已經(jīng)批準(zhǔn)商業(yè)化種植，因此有非常高的實(shí)用價(jià)值。

附圖說明

圖1.轉(zhuǎn)基因棉花MON531轉(zhuǎn)化體PCR檢測的引物位置示意圖

圖2.鑒定引物531-GF和531-GR的設(shè)計(jì)示意圖

A：531-GF；B：531-GR；

其中1：MON531轉(zhuǎn)化體基因組序列；

2：棉花Dt_chr8染色體序列；

3：棉花At_chr3染色體序列；

4：棉花Dt_chr4染色體序列

圖3.轉(zhuǎn)基因棉花MON531轉(zhuǎn)化體單株鑒定圖譜

1,2,4-6：非MON531單株；3,8：MON531純合單株；7：MON531雜合單株；

圖4.MON531雜合單株自交后代種子鑒定圖譜

1-30：30粒源自雜合單株的自交種子；31：非MON531種子；32：空白對照；M：DL2000

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1.引物設(shè)計(jì)

本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)在于MON531轉(zhuǎn)化體棉花基因組上的正向引物和反向引物的設(shè)計(jì)。

通過序列比對發(fā)現(xiàn)，MON531轉(zhuǎn)化體(http://gmdd.shgmo.org/sequence/view/30)插入位點(diǎn)位于棉花D亞基因組8號染色體(簡寫為Dt_chr8)染色體上，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其插入位點(diǎn)的基因組序列還與棉花A亞基因組3號染色體(簡寫為At_chr3)和棉花D亞基因組4號染色體(簡寫為Dt_chr4)染色體上的序列有較高的相似性。

通過將MON531轉(zhuǎn)化體插入位點(diǎn)上游棉花基因組序列與At_chr3和Dt_chr4染色體序列進(jìn)行逐一比對，檢索到序列531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’與At_chr3相差一個(gè)堿基，與Dt_chr4有較大差異(圖2A)，因此將其作為正向基因組引物。

同樣的方法，將MON531轉(zhuǎn)化體插入位點(diǎn)下游棉花基因組序列與At_chr3和Dt_chr4染色體序列進(jìn)行逐一比對，檢索到序列531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’與At_chr3相差一個(gè)堿基，與Dt_chr4也相差一個(gè)堿基(圖2B)，因此將其作為反向基因組引物。

本發(fā)明在MON531轉(zhuǎn)化體插入位點(diǎn)兩側(cè)基因組上設(shè)計(jì)引物，以及插入序列上設(shè)計(jì)引物，三條引物如下：

531-GF：5‘-GAAAGAACTAAACAATTAGTACCC-3’，

531-TR：5‘-CTCGCACACGGCTTCGAC-3’，

531-GR：5‘-AAACCAATGCCACCCCACTG-3’(Seq ID No.3)，如圖1所示。

其中531-GF/531-TR擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镸ON531轉(zhuǎn)化體的5‘端棉花基因組與轉(zhuǎn)基因序列的連接區(qū)，531-GF/531-TR對MON531轉(zhuǎn)化體的擴(kuò)增序列，529bp，如Seq ID No.4所示；

531-GF/531-GR擴(kuò)增片段為棉花基因組序列，位于棉花基因組(陸地棉)的Dt_chr8染色體的37518889-37519501位，擴(kuò)增序列為613bp。而在含有轉(zhuǎn)化體的基因組中，插入位點(diǎn)的引物之間的片段為包括完整插入片段的區(qū)域，預(yù)期超過10kb，這么長的片段在普通PCR條件下則不能獲得擴(kuò)增；因此即僅能在不含MON531轉(zhuǎn)化體的樣品中，獲得棉花基因組序列的613bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，如Seq ID No.5.所示；

三條引物聯(lián)合使用，在雜合體可以擴(kuò)增出兩條條帶。

可用于常規(guī)PCR方法快速準(zhǔn)確鑒定田間棉花單株或單粒棉花種子中的MON531轉(zhuǎn)化體的純雜合狀態(tài)。

實(shí)施例2.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉MON531轉(zhuǎn)化體的定性PCR檢測方法

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1轉(zhuǎn)基因抗蟲棉材料

鄂雜棉1號(潤富棉839)(生廠商：湖北中香米業(yè)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號：2009-10，審定編號：鄂審棉001-2000)，2010年購自湖北省棉花種子市場。在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室種植，經(jīng)單株篩選鑒定、自交繁殖等獲得MON531轉(zhuǎn)化體的純合材料和雜合材料。

1.2試劑

分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker等購自大連寶生物工程有限公司。

其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由北京三博生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

PCR擴(kuò)增儀：型號S1000(Bio-Rad公司)

核酸電泳儀：DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)

凝膠成像系統(tǒng)：BiospectrumAC(UVP公司)

其它儀器包括：離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。

2實(shí)驗(yàn)方法和過程

2.1樣品前處理

溫室種植的棉花材料，分別取單株葉片。

2.2棉花基因組DNA提取

依照植物DNA提取試劑盒(TIANGEN生物技術(shù)有限公司)的操作手冊，進(jìn)行棉花材料總DNA的提取。取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)其亮度和帶型來初步判斷提取DNA的質(zhì)量。采用紫外分光光度計(jì)測定所提取的DNA的濃度和純度。

2.3溫室種植單株棉花材料的檢測

采用建立的由3條引物531-GF(基因組正向引物)、531-GR(基因組反向引物)和531-TR(插入片段反向引物)組成的MON531轉(zhuǎn)化體定性PCR檢測方法，選擇純合、雜合和不含MON531轉(zhuǎn)化體的溫室棉花材料單株進(jìn)行驗(yàn)證。

PCR反應(yīng)體系：GoGreenMaster Mix 10μL，引物757-GF、757-GR和757-TR(10μmol/L)各1μL，DNA模板2μL，補(bǔ)超純水至總體積20μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃保溫10min。

在MON531轉(zhuǎn)化體雜合樣品中，三條引物分別擴(kuò)增插入位點(diǎn)之間的棉花基因組序列和插入序列的5’連接區(qū)序列，從而獲得613和529bp的兩種擴(kuò)增產(chǎn)物；

在MON531轉(zhuǎn)化體純合樣品中，僅能獲得插入序列5’連接區(qū)序列的529bp的擴(kuò)增產(chǎn)物即531-GF(基因組正向引物)和531-TR(插入片段反向引物)擴(kuò)增所得擴(kuò)增所得；而基因組正反向引物之間由于包括的插入片段(MON531轉(zhuǎn)化體)完整區(qū)域預(yù)期超過10kb，在普通PCR條件下不可能獲得擴(kuò)增；

而不含MON531轉(zhuǎn)化體的樣品中，僅能獲得棉花基因組序列的613bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，即531-GF(基因組正向引物)和531-GR(基因組反向引物)擴(kuò)增所得。

驗(yàn)證結(jié)果表明，如圖3所示，純合MON531轉(zhuǎn)化體植株(泳道3,8)僅擴(kuò)增得到一條529bp的片段，雜合植株(泳道7)得到529bp和613bp兩條條帶，不含MON531轉(zhuǎn)化體的植株(泳道1,2,4-6)只得到一條613bp的條帶，這與預(yù)期結(jié)果完全一致。

因此，本發(fā)明建立的MON531轉(zhuǎn)化體定性PCR方法及引物組能有效地鑒別MON531轉(zhuǎn)化體及其存在狀態(tài)。

2.4棉花種子樣品中MON531轉(zhuǎn)化體的定性PCR檢測

隨機(jī)抽取鑒定為鄂雜棉1號MON531雜合植株的自交種子30粒，采用建立的MON531轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR方法進(jìn)行鑒定(圖4)。結(jié)果表明30粒種子中MON531轉(zhuǎn)化體純合、雜合和不含有的分別為9、12和9粒。

說明，本發(fā)明的方法及試劑盒能夠準(zhǔn)確鑒定單個(gè)棉花材料是否含有MON531轉(zhuǎn)化體，且鑒定MON531轉(zhuǎn)化體的雜純合狀態(tài)，而且還可以用來鑒定一個(gè)群體中雜合或純合個(gè)體所占的比例。

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120>一種定性檢測棉花材料中mon531轉(zhuǎn)化體的pcr檢測試劑盒及方法

<130> P160826-ZWB

<160>3

<210>1

<211>24

<212>dna

<213> 人工序列

<220> 基因組正向引物

<400>1

gaaagaacta aacaattagt accc 24

<210>2

<211>18

<212>dna

<213> 人工序列

<220> 插入序列反向引物

<400> 2

ctcgcacacg gcttcgac 18

<210>3

<211>20

<212>dna

<213> 人工序列

<220> 基因組反向引物

<400>3

aaaccaatgc caccccactg 20

<210>4

<211>529

<212>dna

<213> 人工序列

<220> 陽性擴(kuò)增序列

<400>4

gaaagaacta aacaattagt acccactgtt cccacctaac tcatcatctc cttccctgtc 60

tatccctcct gagctaccat gtcacaataa aaaaactaga atattattta ccttacaaaa 120

atggcaatgg catcatgcag tcaaaggagc ttcatgggtt ttagttttac ttccatttta 180

gtgaaatgat tgttgggcta taagcagtca tttcagaaaa aaaaaccatt gaattctagt 240

ttgtattctt atgtatgtgc ctgcaggaaa aaaaatattg aaactcatgc aggagctgtc 300

agactgtttg acattttgtt tatcattaaa tgagattttt ttttgatttt tcaccattga 360

aaggtcacta atattcttct ttttctttct ttcttttctc tatcagatca aatttttttt 420

aaaaaaatgg aggggccaat gcctcgtgat tgttctctgc aagaatatac agtgataaat 480

tatatatgtg tatattataa ccagaaacgc cgtcgaagcc gtgtgcgag 529

<210>5

<211>613

<212>dna

<213> 人工序列

<220> 陰性擴(kuò)增序列

<400>5

gaaagaacta aacaattagt acccactgtt cccacctaac tcatcatctc cttccctgtc 60

tatccctcct gagctaccat gtcacaataa aaaaactaga atattattta ccttacaaaa 120

atggcaatgg catcatgcag tcaaaggagc ttcatgggtt ttagttttac ttccatttta 180

gtgaaatgat tgttgggcta taagcagtca tttcagaaaa aaaaaccatt gaattctagt 240

ttgtattctt atgtatgtgc ctgcaggaaa aaaaatattg aaactcatgc aggagctgtc 300

agactgtttg acattttgtt tatcattaaa tgagattttt ttttgatttt tcaccattga 360

aaggtcacta atattcttct ttttctttct ttcttttctc tatcagatca aatttttttt 420

aaaaaaatgg aggggccaat gcctcgtgat tgttctctgc aagaatatac agtgataaat 480

tatatatgtg tatattataa ccaaaatgta taattgatga tgttgtcgtg tcgtgtgacc 540

ttttaccaac acatataaat ttattgttgg taaaaaagaa gagctaagtg ggtcagtggg 600

gtggcattgg ttt 613