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一種利用分子標(biāo)記快速鑒定黃瓜砧木合力二純度的方法與流程

文檔序號(hào):12412804閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種利用分子標(biāo)記快速鑒定黃瓜砧木合力二純度的方法,其特征在于:利用EST-SSR引物進(jìn)行鑒定,所述的EST-SSR引物命名為HELI2,其正向序列為5’-GAATCAGAGGAAGGTTTGCG-3’,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;反向序列為5’-CACTTCCTTCATGCTTCTCG-3’,其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用分子標(biāo)記快速鑒定黃瓜砧木合力二純度的方法,其特征在于:具體步驟如下:

(1)提取黃瓜砧木合力二雜交種及其親本幼根基因組DNA;

(2)以第(1)步提取的基因組DNA為模板,用EST-SSR引物HELI2進(jìn)行PCR擴(kuò)增:

PCR反應(yīng)體系為10μL,其中包括10×PCR Buffer 1μL,0.2mM dNTPs,DNA模板100ng,引物各5μM,0.5U Taq DNA聚合酶,無菌超純水補(bǔ)齊至10μL;

擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min;95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸20s,35個(gè)循環(huán);72℃終延伸5min;PCR產(chǎn)物保存于10℃;

(3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):5μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL上樣緩沖液混合,之后經(jīng)丙烯酰胺質(zhì)量體積比為8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,180v恒定電壓電泳1.5h,銀染顯色進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì);

其中所采用的非變性聚丙烯酰胺凝膠中丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺的質(zhì)量比為29∶1;

(4)根據(jù)特異譜帶的擴(kuò)增結(jié)果鑒定“黃瓜砧木合力二”雜交種的純度,判定標(biāo)準(zhǔn)為:

母本具有177bp特異譜帶,其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;父本具有159bp特異譜帶,其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;雜交種具有159bp和177bp兩條特異譜帶;

根據(jù)上述鑒定結(jié)果,可以換算黃瓜砧木合力二品種純度(%)=(1-n/N)×100%,其中N為待測(cè)砧木種子數(shù)目,n為單獨(dú)具有父本譜帶特征或單獨(dú)具有母本譜帶特征或既不同于“黃瓜砧木合力二”譜帶特征也不同于父母本譜帶特征的植株數(shù)目。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用分子標(biāo)記快速鑒定黃瓜砧木合力二純度的方法,其特征在于:

步驟(3)中所采用的上樣緩沖液選自10×甘油凝膠上樣液。

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