本發(fā)明涉及一種從環(huán)境樣品中提取純化總細(xì)菌的方法，屬于環(huán)境科學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著科技的進(jìn)步，pcr技術(shù)逐漸被應(yīng)用到環(huán)境微生物中特定細(xì)菌的檢測(cè)中，如土壤、未經(jīng)處理的生活廢棄物、醫(yī)院廢棄物、工廠廢棄物、垃圾和人畜糞便以及大氣中的漂浮物和氣溶膠等環(huán)境中的微生物檢測(cè)。

隨著規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)量的增加，畜禽的糞便和污水排放量劇增，環(huán)境污染問(wèn)題越來(lái)越突出，一些致病性微生物如豬副豬嗜血桿菌、沙門(mén)桿菌等混跡其間，將對(duì)人畜健康造成極大的危害，也會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來(lái)無(wú)法估量的經(jīng)濟(jì)損失。因此，需要對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境病原微生物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以防止動(dòng)物疫病的爆發(fā)與蔓延。

迄今，對(duì)病原菌的檢測(cè)和鑒定大多采用傳統(tǒng)的方法，即對(duì)病料進(jìn)行病原培養(yǎng)分離，配合血清型鑒定來(lái)診斷畜禽疾病。該方法雖然比較準(zhǔn)確，但耗時(shí)費(fèi)力，鑒定時(shí)間長(zhǎng)(一般需要2～4天)，易受細(xì)菌生理?xiàng)l件和抗生素使用限制，常導(dǎo)致培養(yǎng)假陰性，很難滿(mǎn)足臨床要求。

pcr技術(shù)以其敏感性強(qiáng)，特異性好，檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于許多病原菌的快速鑒定。但對(duì)于環(huán)境中的病原菌而言，環(huán)境中存在大量干擾物質(zhì)影響pcr檢測(cè)，如腐殖質(zhì)等。所以傳統(tǒng)的解決辦法就是采用去除腐殖質(zhì)試劑對(duì)樣品進(jìn)行洗滌，去除腐殖質(zhì)，然后用裂解試劑裂解環(huán)境中的細(xì)菌，析出dna復(fù)合物，用蛋白酶去除dnp中的蛋白質(zhì)，析出dna，再經(jīng)純化，洗滌作為dna檢測(cè)的樣品試劑。此類(lèi)方法存在繁瑣的dna的提取純化過(guò)程，且常常會(huì)導(dǎo)致提取失敗。目前市場(chǎng)上有針對(duì)具體病原菌dna提取的試劑盒，但步驟繁多，且價(jià)格昂貴，難以推廣進(jìn)行日常使用。

菌落pcr因?yàn)椴挥锰崛〖?xì)菌dna而直接進(jìn)行檢測(cè)而廣受追捧，但如何提取純化能直接用于pcr檢測(cè)的環(huán)境樣品中的病原菌，仍然是一個(gè)很難解決的問(wèn)題。

因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中，亟需快速檢測(cè)鑒定技術(shù)來(lái)幫助廣大基層獸醫(yī)工作者來(lái)快速診斷檢測(cè)，為盡早防治病原菌的侵襲提供寶貴的時(shí)間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種從環(huán)境樣品中提取純化總細(xì)菌的方法，它包括如下操作步驟：

(1)取環(huán)境樣品，加入水或緩沖液，混勻；

(2)加入苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，待溶劑分層，移取上層備用；

(3)將移取的上層進(jìn)行離心，棄上清，保留沉淀；

(4)將沉淀洗滌至基本無(wú)色，用無(wú)菌水或緩沖液重懸菌液即可。

本方法可用于多種環(huán)境中的總細(xì)菌的提取純化，如土壤、未經(jīng)處理的生活廢棄物、醫(yī)院廢棄物、工廠廢棄物、垃圾和人畜糞便以及大氣中的漂浮物和氣溶膠等環(huán)境中微生物的提取純化。本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式中，用于提取純化(包括檢測(cè))的環(huán)境樣品為養(yǎng)殖環(huán)境中的糞樣、墊草、墊土(即土壤)。

優(yōu)選地，加入環(huán)境樣品中和重懸沉淀(總細(xì)菌)的水為無(wú)菌水(如ddh2o)或無(wú)菌生理鹽水，緩沖液為pbs緩沖液或tris-hcl緩沖液。

進(jìn)一步優(yōu)選地，加入環(huán)境樣品中和重懸沉淀(總細(xì)菌)的為pbs緩沖液，其效果略?xún)?yōu)于水和其他緩沖液。

優(yōu)選地，環(huán)境樣品和pbs緩沖液的質(zhì)量體積比為1g：3ml。

所述“溶劑分層”，是指步驟(2)引入的有機(jī)溶劑與步驟(1)中引入的水或緩沖液，由于兩者不能完全互溶而分為兩層(也可以稱(chēng)為兩相)，本發(fā)明中取上層(主要是水相)。但有機(jī)溶劑與水或緩沖液可能會(huì)有一定互溶比例，因此，不排除各相溶劑中均含有一定量的有機(jī)溶劑和水。本發(fā)明中溶劑分層，可以采取多種方式，如靜置、離心等。

優(yōu)選地，步驟(2)中，苯酚-氯仿-異戊醇混合液中，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1～100:24:1

進(jìn)一步優(yōu)選地，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1。

優(yōu)選地，步驟(2)中，加入的苯酚-氯仿-異戊醇混合液與pbs緩沖液的體積比為5:3。

優(yōu)選地，步驟(4)中，洗滌液為tenpp緩沖液，tenpp緩沖液組成為：50mmol/ltris，20mmol/ledta，100mmol/lnacl，1％pvpp，ph10.0。

通常洗滌3～5次沉淀即可洗至基本無(wú)色，重懸菌液可用無(wú)菌水或各種常用的緩沖液，如pbs緩沖液，tris緩沖液等。

優(yōu)選地，上述需離心的各步驟中，離心轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心時(shí)間為2～5min。

若環(huán)境中的總細(xì)菌較少，或?yàn)榱颂岣弑景l(fā)明方法的檢測(cè)靈敏度，可在步驟(2)移取上層后向下層樣品(主要是有機(jī)相)中再加入pbs緩沖液，混勻，離心，移取上清備用；此步驟可再重復(fù)1～2次；合并前面移取的上層，然后進(jìn)行步驟(3)及后面的操作。

本發(fā)明還提供了苯酚-氯仿-異戊醇混合液和tenpp緩沖液用于從環(huán)境樣品中提取純化總細(xì)菌的用途，其中，苯酚-氯仿-異戊醇混合液中，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1～100:24:1；tenpp緩沖液組成為：50mmol/ltris，20mmol/ledta，100mmol/lnacl，1％pvpp，ph10.0。

優(yōu)選地，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25：24：1。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種檢測(cè)環(huán)境樣品中革蘭氏陰性菌的方法，它包括如下步驟：

(1)采用上述任一本發(fā)明方法提取純化總細(xì)菌，重懸菌液備用；

(2)將重懸的菌液直接上機(jī)進(jìn)行菌落pcr擴(kuò)增目標(biāo)細(xì)菌的任一段特定的dna序列；

(3)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，與陽(yáng)性對(duì)照比較，判斷提取純化的總細(xì)菌中是否含有目標(biāo)革蘭氏陰性菌。

此即為菌落pcr檢測(cè)方法。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了環(huán)境樣品中布氏桿菌的檢測(cè)方法，即采用上述革蘭氏陰性菌的檢測(cè)方法，用于擴(kuò)增的上游引物序列如seqno.1所示，下游引物序列如seqno.2所示：

seqno.1：5'-ggttgttaaaggagaacagc-3’，

seqno.2：5'-gacgatagcgtttcaacttg-3’。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了環(huán)境樣品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法，即采用上述革蘭氏陰性菌的檢測(cè)方法，用于擴(kuò)增的上游引物序列如seqno.5所示，下游引物序列如seqno.6所示。

seqno.3：5’-gattctggtactaatggtgatgatc-3’，

seqno.4：5’-gccaggctatcgccaataac-3’。

本發(fā)明方法利用特定配比的有機(jī)溶劑、水或緩沖液將細(xì)菌從環(huán)境樣品中提取出來(lái)，再通過(guò)洗滌進(jìn)一步純化，可用于快速高效地提取純化環(huán)境樣品中的總細(xì)菌，繼而用于pcr檢測(cè)。環(huán)境中的總細(xì)菌既包括革蘭氏陰性菌，又包括革蘭氏陽(yáng)性菌，二者的主要區(qū)別在于細(xì)胞壁。革蘭氏陽(yáng)性菌不能通過(guò)熱裂解來(lái)直接進(jìn)行菌落pcr檢測(cè)，還需要用蛋白酶對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行破壁，析出細(xì)菌dna，再進(jìn)行pcr檢測(cè)，類(lèi)似于傳統(tǒng)pcr檢測(cè)方法。本發(fā)明提取純化的總細(xì)菌中，雖含有革蘭氏陽(yáng)性菌，但如果在后續(xù)pcr實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不引入其他的裂解步驟，革蘭氏陽(yáng)性菌的存在對(duì)革蘭氏陰性菌的菌落pcr檢測(cè)方法并無(wú)影響。所以，本發(fā)明方法特別適合用于環(huán)境樣品中的革蘭氏陰性菌的pcr檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1苯酚-氯仿-異戊醇濃度篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

圖2糞樣中布氏桿菌菌落pcr檢測(cè)圖

圖3墊草中副豬嗜血桿菌菌落pcr檢測(cè)圖

圖4墊土中沙門(mén)氏菌菌落pcr檢測(cè)圖

圖5墊土中大腸桿菌菌落pcr檢測(cè)圖

具體實(shí)施方式

下面以具體實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行說(shuō)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

材料與試劑

(1)所用菌株

致病性豬副豬嗜血桿菌，西南民族大學(xué)張斌副教授贈(zèng)送；沙門(mén)氏菌cvcc504，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；布氏桿菌，蘭州獸醫(yī)所研制的布氏桿菌(a群)弱毒苗，腸毒性大腸桿菌cvcc196購(gòu)至中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

(2)主要試劑

2×pcrmix、marker、苯酚、氯仿、異戊醇、pbs緩沖液，pvpp等，均購(gòu)自tiangen公司；糞便dna提取試劑盒，土壤dna提取試劑盒，細(xì)菌總dna提取試劑盒(用于墊草中細(xì)菌dna提取)，以上試劑盒購(gòu)自omega公司，其他試劑均為分析純。

(3)引物：

表1引物序列表

均由英駿生物技術(shù)有限公司合成。

實(shí)施例1苯酚-氯仿-異戊醇混合液配比的篩選

1材料：

待檢細(xì)菌：布氏桿菌；載體：土壤。

2實(shí)驗(yàn)方法：

實(shí)驗(yàn)組共有7組，苯酚-氯仿-異戊醇配比(體積比)分別為：第1組0:24:1；第2組25:96:4；第3組50:72:3；第4組25:24:1；第5組：75:48:2；第6組為100:24:1；第7組為100:0:0。各組菌采用相同的細(xì)菌起始濃度，3×10⁶cfu/g。

將待檢細(xì)菌加入土壤中，然后用本發(fā)明方法從混有細(xì)菌的土壤中將細(xì)菌提取純化出來(lái)，進(jìn)行菌落pcr檢測(cè)。以空白樣品為陰性對(duì)照(第9組)，同時(shí)采用相應(yīng)dna提取試劑盒為陽(yáng)性對(duì)照(第8組)。

具體過(guò)程為：稱(chēng)取0.1g土壤于1mlep管中，加入300μlpbs緩沖液(ph7.2～7.4，nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l)，渦旋混勻，加入苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)500ml，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層于另一干凈滅菌ep管中；再加入300μlpbs緩沖液，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層于上次的ep管中，重復(fù)pbs緩沖液操作一次，合并前述三次上層(主要為水相)。將合并的菌液(上層)12000rpm離心5min，棄上清。將沉淀用500μltenpp緩沖液(20mmol/ledta，50mmol/ltris,1％pvpp，100mmol/lnacl，ph10.0)洗滌3～5次至上清基本無(wú)色。用50μlddh2o重懸菌液。取此菌液1μl進(jìn)行后續(xù)pcr檢測(cè)。

pcr反應(yīng)體系及條件：

反應(yīng)體系(25μl)：2×pcrmix12.5μl，模板1μl，上、下游引物各1μl，用ddh2o補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

凝膠電泳檢測(cè)：

pcr產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示(lane1-7分別為酚-氯仿-異戊醇提取第1～7組，lanem為marker,lane8為陽(yáng)性對(duì)照，lane9為陰性對(duì)照)，第4、5、6、7組和陽(yáng)性對(duì)照組都能檢出布氏桿菌的條帶，第7組為單純苯酚組，苯酚具有一定的親水性，不能很好地將水相與有機(jī)相分離，萃取操作時(shí)，分界不明顯，會(huì)造成二次操作，特別麻煩，所以苯酚-氯仿-異戊醇三者的配比為25:24:1～100:24:1較為合適。

實(shí)施例2pcr擴(kuò)增及凝膠電泳法檢測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境樣品中提取純化的病原菌

1.材料：

1.1所用菌株：致病性豬副豬嗜血桿菌，沙門(mén)氏菌cvcc504，布氏桿菌，大腸桿菌cvcc196。

1.2環(huán)境載體：糞樣，墊草，墊土。

1.2引物，見(jiàn)表1：

2、方法：

2.1pcr反應(yīng)體系及條件

反應(yīng)體系(25μl):2×pcrmix12.5μl，模板1μl，上、下游引物各1μl，用ddh2o補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件:94℃5min；94℃30s，55℃30s(布氏桿菌采用60℃30s)，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

2.2凝膠電泳檢測(cè)

pcr產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.4本發(fā)明方法提取純化病原菌用于pcr檢測(cè)的有效性和敏感性試驗(yàn)

將布氏桿菌、副豬嗜血桿菌、沙門(mén)氏菌cvcc504、大腸桿菌cvcc196新鮮菌液分別計(jì)數(shù)后進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)?×10⁰，1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7稀釋度各10μl加入0.1g環(huán)境樣品中(布氏桿菌加入糞樣中，副豬嗜血桿菌加入墊草中，沙門(mén)氏菌和大腸桿菌加入墊土中)用本發(fā)明實(shí)施例1的方法提取純化各細(xì)菌，并檢測(cè)pcr敏感性。以空白樣品為陰性對(duì)照，同時(shí)采用相應(yīng)dna提取試劑盒為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)比本發(fā)明方法的有效性和敏感性。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

采用2.4相同的方法，將病原菌濃度為3×10⁶cfu/g的布氏桿菌梯度稀釋后加入5個(gè)相同的樣品進(jìn)行相同操作檢測(cè)，以檢驗(yàn)本發(fā)明方法的重復(fù)性。

2.結(jié)果

2.1方法的有效性和敏感性

如圖2、圖3、圖4、圖5所示，本方法均能從環(huán)境樣品中提取出這些細(xì)菌，完成菌落pcr檢測(cè)。

圖2、圖3、圖4、圖5中l(wèi)anem均為marker，marker條帶從上到下為2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。

圖2為糞樣中布氏桿菌菌落pcr檢測(cè)圖，lane1-4為采用本發(fā)明方法進(jìn)行pcr的檢測(cè)結(jié)果，lane5-8為采用標(biāo)準(zhǔn)dna提取試劑盒提取dna后進(jìn)行pcr的檢測(cè)結(jié)果。其中，lane4和lane8的糞樣布氏桿菌濃度為3×10⁷cfu/g；lane3和lane7為3×10⁶cfu/g；lane2和lane6為3×10⁵cfu/g；lane1和lane5為3×10⁴cfu/g。

圖2結(jié)果表明，本發(fā)明方法能從環(huán)境樣品中提取檢測(cè)到布氏桿菌的濃度下限為3×10⁵cfu/g，和市售dna提取試劑盒檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)。

圖3為墊草中副豬嗜血桿菌pcr檢測(cè)圖，lane1-5為采用本發(fā)明方法進(jìn)行pcr的檢測(cè)結(jié)果，lane6-10為采用標(biāo)準(zhǔn)dna提取試劑盒提取dna后進(jìn)行pcr的檢測(cè)結(jié)果。其中，lane1和lane6的墊草中副豬嗜血桿菌濃度為1×10⁶cfu/g，lane1-5為依次10倍濃度稀釋?zhuān)琹ane5和lane10為100cfu/g。

圖3結(jié)果表明，本發(fā)明方法能從環(huán)境樣品中提取檢測(cè)到副豬嗜血桿菌的濃度下限為1×10⁴cfu/g，和市售dna提取試劑盒檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)。

圖4為墊土中沙門(mén)氏菌菌落pcr檢測(cè)圖，lane1-8為采用本發(fā)明方法進(jìn)行pcr的檢測(cè)結(jié)果，lane9-16為采用標(biāo)準(zhǔn)dna提取試劑盒提取dna后進(jìn)行pcr的檢測(cè)結(jié)果。.其中，lane1，lane9為未加入墊草的標(biāo)準(zhǔn)菌液，lane8和lane16的墊草中沙門(mén)氏菌濃度為3×10⁷cfu/g，lane8-2和lane16-10為依次10倍濃度稀釋?zhuān)琹ane2和lane10為30cfu/g。

圖4結(jié)果表明，本發(fā)明方法能從環(huán)境樣品種提取檢測(cè)到沙門(mén)氏菌的濃度下限為3×10⁵cfu/g，和市售dna提取試劑盒檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)。

圖5為墊土中大腸桿菌菌落pcr檢測(cè)圖，lane1-8為采用本發(fā)明方法進(jìn)行的pcr檢測(cè)結(jié)果。lane9-16為采用標(biāo)準(zhǔn)dna提取試劑盒提取dna后進(jìn)行pcr檢測(cè)結(jié)果。其中，lane1，lane9為標(biāo)準(zhǔn)菌液，lane2-8和lane10-16的對(duì)應(yīng)菌液濃度相同。lane8和lane16的墊土中大腸桿菌濃度為3×10⁷cfu/g，lane8-2和lane10-16均為10倍濃度稀釋?zhuān)琹ane2和lane10濃度為30cfu/g。

圖5結(jié)果表明，本發(fā)明方法能從環(huán)境樣品種提取檢測(cè)到大腸桿菌的濃度下限為3×10⁵cfu/g，和市售dna提取試劑盒檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)。

2.2方法的重復(fù)性

5個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果完全相同，表明本方法具有良好的重復(fù)性。

實(shí)施例3一種從環(huán)境樣品中提取純化總細(xì)菌的方法

稱(chēng)取0.1g土壤于1mlep管中，加入400μlpbs緩沖液(ph7.2～7.4，nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l)，渦旋混勻，加入苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)500ml，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層(主要為水相)于另一干凈滅菌ep管中；再加入300μlpbs緩沖液，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層于上次的ep管中，將兩次移取的上層合并。將合并的菌液(上層)12000rpm離心5min，棄上清。將沉淀用600μltenpp緩沖液(20mmol/ledta，50mmol/ltris,1％pvpp，100mmol/lnacl，ph10.0)洗滌至上清基本無(wú)色。用50μlddh2o重懸菌液，即完成對(duì)土壤樣品中總細(xì)菌的提取純化。

上述表明，本發(fā)明方法簡(jiǎn)化了pcr檢測(cè)的前處理步驟，省去了繁瑣的dna提取步驟，直接用本方法處理得到的稀釋菌液或菌落為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，重復(fù)性好，靈敏高，特異性好，檢測(cè)時(shí)間短，節(jié)省人力物力，大大降低了檢測(cè)成本。

sequencelisting

<110>四川省畜牧科學(xué)研究院

<120>一種從環(huán)境樣品中提取純化總細(xì)菌的方法

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>dna

<213>檢測(cè)布氏桿菌的上游引物

<400>1

ggttgttaaaggagaacagc20

<210>2

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<212>dna

<213>檢測(cè)布氏桿菌的下游引物

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gacgatagcgtttcaacttg20

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<212>dna

<213>檢測(cè)沙門(mén)氏菌的上游引物

<400>3

gattctggtactaatggtgatgatc25

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<211>20

<212>dna

<213>檢測(cè)沙門(mén)氏菌的下游引物

<400>4

gccaggctatcgccaataac20

<210>5

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<212>dna

<213>檢測(cè)大腸桿菌上游引物

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<212>dna

<213>檢測(cè)大腸桿菌下游引物

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<213>檢測(cè)副豬嗜血桿菌上游引物

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<213>檢測(cè)副豬嗜血桿菌下游引物

<400>8

ggcttcgtcaccctctgt18