本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株生防鏈霉菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著人們對生態(tài)平衡、有機(jī)食品和綠色健康的概念越來越重視和深入了解，生物防治手段因其可以有效地避免化學(xué)農(nóng)藥所帶來的一系列問題，同時(shí)又具有深刻的社會效益、生態(tài)效益和長遠(yuǎn)利益，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛且前所未有的關(guān)注，在農(nóng)業(yè)科學(xué)可持續(xù)發(fā)展的大背景下，生物防治也是農(nóng)業(yè)發(fā)展的必由之路。放線菌是最早應(yīng)用最為廣泛的生防微生物，在植物病害的生物防治中發(fā)揮了巨大作用。放線菌仍然是目前世界范圍內(nèi)研制開發(fā)新醫(yī)藥、新農(nóng)藥和生物防治活菌劑的研究熱點(diǎn)，其種類繁多代謝功能各異，是一類有著廣泛實(shí)際用途的微生物資源。

桃子是最為人們喜愛的水果之一，桃樹也已成為很多地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)。由鏈核盤菌(Monilinia spp.)引起的褐腐病是桃生產(chǎn)中最重要的病害之一，也是世界范圍內(nèi)核果類最重要的采后病害。此病在采前、采后及貯藏運(yùn)輸期均可造成大量減產(chǎn)，采后尤為嚴(yán)重，在歐美損失高達(dá)59-90％。但桃褐腐病是桃果生長期和貯藏期的一種常見且發(fā)生嚴(yán)重的病害，呈世界性分布。中國的南北方均有發(fā)生，尤其以浙江、山東等沿海地區(qū)和江淮流域的桃產(chǎn)區(qū)發(fā)生最重，自2000年以來，桃褐腐病在北京的平谷區(qū)普遍發(fā)生，且逐年加重。很多研究報(bào)道，果實(shí)的腐爛主要?dú)w因于病原微生物的侵入所致。為了能有效地減少水果采后腐爛引起的損失，長期以來人們多采用低溫、氣調(diào)、減壓等物理措施配合使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治褐腐病等諸多真菌病害的發(fā)生。但目前主要應(yīng)用化學(xué)藥劑防治該病害，雖能有效、快速地達(dá)到防治目的，但大量使用會造成農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境和對人類健康產(chǎn)生不良影響，如長期單一使用，病菌會產(chǎn)生抗性，如上所述，生物防治因具備對環(huán)境安全、無污染且成本較低，符合農(nóng)業(yè)生態(tài)和可持續(xù)發(fā)展的要求，成為目前研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何抑制植物病原菌并促進(jìn)植物生長。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一株鏈霉菌。

本發(fā)明所提供的鏈霉菌，稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)，其菌株號為JZB130180，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No.13270。下文中簡稱為稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180或菌株JZB130180。

稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180在固體培養(yǎng)基上，菌落呈規(guī)則邊緣整齊的圓形，菌體呈黃色，菌落表面出現(xiàn)皺縮，中央凸起，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，出現(xiàn)灰白色的孢子堆。稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180為革蘭氏陽性菌，可液化明膠，接觸酶和氧化酶陽性，能將牛奶凝固和胨化，能將淀粉水解，能微弱利用檸檬酸鹽，不產(chǎn)生黑色素和硫化氫。稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180具有序列表中的序列1的16S rDNA序列，具有序列表中序列2-4所示的atpD，recA，rpoB基因序列。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了含有稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180或/和稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180的代謝物的菌劑。

上述菌劑具體可為病原菌抑制劑或病害抑制劑。

上述病原菌抑制劑的活性成分可為稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180或/和稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180的代謝物，上述病原菌抑制劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，上述病原菌抑制劑的其他活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)對病原菌的抑制效果確定。

上述病害抑制劑的活性成分可為稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180或/和稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180的代謝物，上述病害抑制劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，上述病害抑制劑的其他活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)對病害的抑制效果確定。

稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180或/和稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180的代謝物的下述任一種應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

1)在抑制病原菌中的應(yīng)用；

2)在制備病原菌抑制劑中的應(yīng)用；

3)在制備病害抑制劑中的應(yīng)用；

4)在抑制病害中的應(yīng)用。

上文中，所述病原菌可為下述全部或部分病原菌：植物灰霉病菌，植物褐腐病菌，小麥紋枯病菌，小麥赤霉病菌，小麥全蝕病菌，辣椒炭疽病菌，葡萄炭疽病菌，植物枯萎病菌，水稻紋枯病菌，百合根腐病菌，蘋果輪紋病菌，辣椒瘡痂病菌，黃瓜角斑病菌，茄子青枯病菌，蠟狀芽胞桿菌，土壤根癌桿菌和大白菜黑腐病菌。

所述植物枯萎病菌可為下述病菌中的全部或部分：黃瓜枯萎病菌，棉花枯萎病菌，西瓜枯萎病菌和甘藍(lán)枯萎病菌。

所述芽胞桿菌可為蠟狀芽胞桿菌。

所述植物褐腐病菌中，所述植物的果實(shí)為核果，如桃。植物褐腐病菌具體可為美澳型核果鏈核盤菌(Monilinia fructicola)。

所述植物灰霉病菌中，所述植物可為茄科植物，如番茄。

上文中，所述病害可為下述全部或部分病害：植物灰霉病，植物褐腐病，小麥紋枯病，小麥赤霉病，小麥全蝕病，辣椒炭疽病，葡萄炭疽病，植物枯萎病，水稻紋枯病，百合根腐病，蘋果輪紋病，辣椒瘡痂病，黃瓜角斑病，茄子青枯病和大白菜黑腐病。

所述植物枯萎病可為下述四種病中的全部或部分：黃瓜枯萎病，棉花枯萎病，西瓜枯萎病和甘藍(lán)枯萎病。

所述植物褐腐病中，所述植物的果實(shí)可為核果，如桃。

所述植物灰霉病中，所述植物可為茄科植物，如番茄。

上文中，所述菌劑中，除所述活性成分外，還含有載體。所述載體可為農(nóng)藥領(lǐng)域常用的且在生物學(xué)上是惰性的載體。所述載體可為固體載體或液體載體；所述固體載體可為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇或/和聚二醇；所述液體載體可為有機(jī)溶劑、植物油、礦物油或水；所述有機(jī)溶劑可為癸烷或/和十二烷。

所述菌劑的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。

根據(jù)需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩(wěn)定劑(如抗氧化劑)、pH調(diào)節(jié)劑等。

稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180或/和稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180的代謝物在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述應(yīng)用中，所述植物可為下述任一種植物：

P1)種子植物；

P2)雙子葉植物；

P3)茄科植物；

P4)番茄。

上述應(yīng)用中，所述促進(jìn)植物生長可為提高植物主根長度和/或提高植物須根數(shù)和/或提高莖高和/或植株重量。

上文中，稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180的代謝物可從稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180的發(fā)酵液中獲得。稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180的代謝物具體可按照如下方法制備：在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180，除去液體培養(yǎng)物(發(fā)酵液)中的稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180即得到稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180的代謝物。

本申請中，所述番茄灰霉病菌可為灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。

稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)生嚴(yán)重的14種植物病原真菌和6種植物病原細(xì)菌有顯著的拮抗作用，抑菌譜廣。該菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蛋白酶和嗜鐵素，具備生防菌的基本特征，該菌株的發(fā)酵液對番茄灰霉病和桃褐腐病有較強(qiáng)的防控效果，且對番茄植株具有明顯的促生作用，說明該菌株在植物病害的生物防治領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

保藏說明

菌種名稱：稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)

菌株編號：JZB130180

保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC

地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號

保藏日期：2016年11月14日

保藏中心登記入冊編號：CGMCC No.13270

附圖說明

圖1為分離平板。

其中，A-E為土壤分離時(shí)平板上的菌落，F(xiàn)為純化后保存的放線菌斜面。

圖2為平板拮抗活性測定對桃褐腐病菌的拮抗結(jié)果。

其中，CK為桃褐腐病菌對照。

圖3為菌株JZB130180在三種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)狀態(tài)(左圖)及在400倍光鏡下的菌絲體形態(tài)(右圖)。

圖4為菌株JZB130180鑒定中的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

M：DL2000DNA Marker，泳道1和2：提取的DNA樣品；泳道3-6：依次為16S rDNA，atpD，recA，rpoB的基因擴(kuò)增條帶。

圖5為基于菌株JZB130180的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖6為菌株JZB130180對植物病原菌的抑菌測定結(jié)果。

其中，A:小麥紋枯病菌，B:小麥赤霉病菌，C:小麥全蝕病菌，D:辣椒炭疽病菌，E:葡萄炭疽病菌，F(xiàn):桃褐腐病菌，G:番茄灰霉病菌，H:黃瓜枯萎病菌，I:棉花枯萎病菌，J:西瓜枯萎病菌，K:甘藍(lán)枯萎病菌，L:水稻紋枯病菌，M:百合根腐病菌，N:蘋果輪紋病菌，O:辣椒瘡痂病菌，P:黃瓜角斑病菌，Q:茄子青枯病菌，R:蠟狀芽胞桿菌，S:根癌土壤桿菌C58，T:大白菜黑腐病菌。

圖7為菌株JZB130180產(chǎn)與生防相關(guān)胞外酶的檢測。

其中，A：幾丁質(zhì)酶檢測；B：蛋白酶檢測；C：纖維素酶檢測；D：嗜鐵素檢測

圖8為菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液對桃褐腐病菌的抑菌效果。

圖9為桃褐腐病菌在含毒介質(zhì)中生長情況。

其中，1～6表示菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液在含毒介質(zhì)中的濃度依次為0μg/mL12.5μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。

圖10為菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液對桃褐腐病的抑制效果。

其中，1-3行依次為處理B1、處理C1和陰性對照。

圖11為菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液對番茄灰霉病的抑制效果。

其中，1-4行依次為處理B2、處理C2、處理D和陰性對照。

圖12為菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液對番茄植株的促生作用測定。

其中，AZ10、BZ10和CZ10為浸種處理的從播種起10天的結(jié)果；DZ20為浸種處理的從播種起20天的結(jié)果；DG20為灌根處理的從播種起20天的結(jié)果；EZ30為浸種處理的從播種起30天的結(jié)果；EG30為灌根處理的從播種起30天的結(jié)果；FZ40為浸種處理的從播種起40天的結(jié)果；FG40為灌根處理的從播種起40天的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中所用到的病原菌公眾可從野外采集，也可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請實(shí)驗(yàn)：

甘藍(lán)枯萎病菌——尖孢鐮刀菌粘團(tuán)?；蚚Fusarium oxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen](李明遠(yuǎn)等.十字花科蔬菜枯萎病及其病原鑒定.植物保護(hù).2003,29(6):44-45)；

西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)(耿麗華等.西瓜枯萎病菌生理小種鑒定技術(shù)體系的建立和驗(yàn)證.中國蔬菜.2010，(20)：52-56)

小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)(紀(jì)兆林等.小麥紋枯病菌毒素對小麥植株的作用.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)).2011,3 2(3):55-59)；

小麥全蝕病菌(Gaeumannomyces graminis(Sacc.)Arx&Olivier var.tritici J.Walker)(劉衛(wèi)國.藥劑處理對小麥全蝕病防效及其產(chǎn)量因素的影響.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué).2012,51(16):3483-3487)；

番茄灰霉病菌——灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)(李興紅等.北京地區(qū)番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性檢測.植物保護(hù).2012，38(4)：141-143)；

桃褐腐病菌——鏈核盤菌(Monilinia fructicola(wint.)Rehm)(王菲等.桃褐腐病的發(fā)生與防治.果樹花卉.2012,5:58)；

辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)(宋根苗等.噻霉酮和苯醚甲環(huán)唑混配對4種不同病原菌的增效作用.植物保護(hù).2012，38(4)：171-174)；

葡萄炭疽病菌——膠孢炭疽菌(Colletortrichum gloeosporioides Penz.e t Sacc.)(李利霞等.葡萄炭疽病菌S R AP遺傳多樣性分析.中國農(nóng)學(xué)通報(bào).2012，2 8(1 2)：230-235)；

黃瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)(A.T.Alleyne.et.al.Identification of Pseudomonas syringae pv.lachrymans in Barbados by rep-PCR.Journal of Agricultural Science and Technology B1.2001,593-597)；

茄子青枯病菌(Ralstonia solanacearum)(封林林等.茄子青枯病抗性材料的鑒定及性狀觀察.長江蔬菜.2000,(10):35-37)；

大白菜黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campsetris)(翟文慧等.大白菜黑腐病鑒定的濕度試驗(yàn)及其苗期與成株期抗病性的相關(guān)分析.中國蔬菜.2010，(10)：59-63)；

百合根腐病菌-尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum Schlecht)(安智慧等.百合根腐病病原鑒定及防治方法.中圈蔬菜.2010,(3)：23-24)

根癌土壤桿菌C58(Agrobacterium tumefaciens C58cereon)(范成明等.根癌土壤桿菌C58Cereon中分泌蛋白信號肽分析.微生物學(xué)報(bào).2005,45(4):561-566)；

小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum Schw.)(陳然等，小麥赤霉病生物防治研究進(jìn)展.河南農(nóng)業(yè)科學(xué).2014,43(12):1-5)

黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen)(韋巧婕等.黃瓜枯萎病拮抗菌的篩選鑒定及其生物防效.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2013，36(1):40－46)

棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)(朱薇玲等，棉花枯萎病菌的拮抗細(xì)菌篩選.2006,25(2)：7-9)

水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)(陳思宇等，水稻紋枯病菌拮抗細(xì)菌的篩選及鑒定.植物保護(hù)學(xué)報(bào).2013,40(3):211-218)

蘋果輪紋病菌(Botryosphaeria dothidea)(劉保友等，蘋果輪紋病菌對苯醚甲環(huán)唑和氟硅唑的敏感性及其交互抗性.植物病理學(xué)報(bào).2013,43(5):541-548)

辣椒瘡痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)(向平安等，辣椒瘡痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)和水稻細(xì)菌性條斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola)的質(zhì)粒及其與耐鏈霉素和耐銅性關(guān)系.植物病理學(xué)報(bào).2003，33(4):330-333)

蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)(衛(wèi)昆等，蠟狀芽胞桿菌對芘的降解特性及降解酶研究.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào).2016，36(2):506-512)

下述實(shí)施例中涉及的部分培養(yǎng)基如下：

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200g，洗凈切成約1cm³的小塊煮沸約30min后用四層紗布過濾，濾液用自來水補(bǔ)足至1000ml，加葡萄糖20g，瓊脂15g，pH自然，121℃高壓滅菌30min。

PD液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，洗凈切成約1cm³的小塊煮沸約30min后用四層紗布過濾，濾液用自來水補(bǔ)足至1000ml，加葡萄糖20g，pH自然，121℃高壓滅菌30min。

高氏一號瓊脂培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，KNO₃ 1g，F(xiàn)eSO₄﹒7H₂O 0.01g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄﹒7H₂O 0.5g，瓊脂20g，自來水1000ml，pH 7.2～7.4，121℃滅菌30min。

放線菌分離培養(yǎng)基Ⅰ：葡萄糖10g，牛肉膏2g，天門冬素0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，瓊脂20g，自來水1000ml，pH6.8或自然，121℃滅菌30min。

放線菌分離培養(yǎng)基Ⅱ：可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，KNO₃ 1g，F(xiàn)e₂(SO₄)₃ 0.01g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄﹒7H₂O 0.5g，瓊脂20g，自來水1000ml，pH 7.2～7.4，121℃滅菌30min。

放線菌分離培養(yǎng)基Ⅲ：甘油20g，NaCl 1g，CaCO₃ 0.1g，L－精氨酸2.5g，F(xiàn)eSO₄﹒7H₂O 0.1g，MgSO₄﹒7H₂O 0.1g，瓊脂20g，自來水1000ml，pH 6.8～7.0，121℃滅菌15min。

放線菌分離培養(yǎng)基Ⅳ：蔗糖15g，NaNO₃ 2g，酵母膏4g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄﹒7H₂O0.5g，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO₄﹒7H₂O 0.01g，瓊脂20g，自來水1000ml，pH 7.2，121℃滅菌20min。

放線菌分離培養(yǎng)基Ⅴ：可溶性淀粉10g，(NH₄)₂SO₄ 2g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄﹒7H₂O 1g，NaCl 1g，CaCO₃ 3g，瓊脂15g，自來水1000ml，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20min。

放線菌分離培養(yǎng)基Ⅵ：燕麥粉浸液20g，跡量鹽溶液(FeSO₄﹒7H₂O 0.1g，MnCl₂﹒4H₂O 0.1g，ZnSO₄﹒7H₂O 0.1g，自來水100ml)1ml，瓊脂15g，自來水1000ml，pH 7.2，121℃滅菌90min。

放線菌分離培養(yǎng)基Ⅶ：葡萄糖1g，可溶性淀粉2g，酵母膏0.5g，N-Z Amine 0.5g，CaCO₃0.1g，瓊脂20g，自來水1000ml，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20min。

ISP2培養(yǎng)基：酵母膏4.0g，麥芽汁10.0g，葡萄糖4.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH7.2-7.4，121℃滅菌20min。

實(shí)施例1、稻瘟霉素鏈霉菌JZB130180的分離與鑒定

1.1菌株分離

采集中國貴州省雷公山高海拔區(qū)域的土壤樣品經(jīng)過干熱處理，在室溫干燥1-2周，經(jīng)磨細(xì)過篩后，在鼓風(fēng)干燥箱中將每份土樣于100℃處理1個(gè)小時(shí)后再進(jìn)行分離。準(zhǔn)確稱取土樣1g放入裝有9ml無菌鹽溶液與小玻璃珠的50ml無菌三角瓶中，在搖床上充分振蕩均勻后，即為10^-1濃度稀釋液，再用1ml移液器吸取10^-1濃度稀釋液移入9ml無菌三角瓶中，搖勻即成10^-2濃度稀釋液，以此類推，稀釋到10^-3濃度的稀釋液。樣品懸浮液準(zhǔn)備好后，用無菌移液器嚴(yán)格按照無菌操作要求吸取10^-2濃度和10^-3濃度稀釋液各0.1ml分別放入事先倒好的、對應(yīng)編號的放線菌分離培養(yǎng)基平板上(培養(yǎng)基中含有20mg/l K₂Cr₂O₇作為抑制劑來抑制土樣中的真菌和細(xì)菌)，然后用無菌的玻璃涂布鏟在平板上將懸浮液輕輕涂布均勻，將涂布好的平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，至長出菌落。觀察在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的放線菌，將生長成熟的菌落及時(shí)用無菌接種針挑取到高氏一號瓊脂培養(yǎng)基斜面上，劃線培養(yǎng)，為分離更多的放線菌，每個(gè)培養(yǎng)皿中至少傾倒25-30ml的分離培養(yǎng)基，以防干裂菌體失活，培養(yǎng)時(shí)間延長至3-4周，分批挑菌。同一土壤樣品在不同培養(yǎng)基上分離到的不同放線菌菌株統(tǒng)一編號后，在4℃冰箱暫時(shí)斜面保存(圖1)。

生防菌株的篩選：以桃褐腐病菌為靶標(biāo)病原菌，在PDA上于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，此時(shí)平板上均有大量的孢子層產(chǎn)生。在厚度均勻一致的PDA平板上先在中央點(diǎn)接少許桃褐腐病菌的孢子，然后在距離病原菌2cm處分別點(diǎn)上四株已分離純化的放線菌孢子少許，以周圍未接放線菌的病原菌為空白對照。做好標(biāo)記后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照平板鋪滿整個(gè)平板時(shí)，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該試驗(yàn)重復(fù)三次。

試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果共得到20余株對桃褐腐病菌抑菌作用較強(qiáng)的拮抗放線菌菌株，其中一株編號為JZB130180的菌株抑菌效果最好，其抑菌帶寬在7mm以上(圖2)。

1.2菌株鑒定

形態(tài)培養(yǎng)特征：將活化后的菌株JZB130180分別劃線接種于PDA、ISP2及高氏一號瓊脂平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，在培養(yǎng)第2天、4天、6天、8天和10天時(shí)分別觀察并記錄該菌株在各培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形態(tài)，采用插片法接菌培養(yǎng)5-7d，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照氣生菌絲的形態(tài)。結(jié)果表明菌株JZB130180在上述三種培養(yǎng)基上均能生長，菌落呈規(guī)則邊緣整齊的圓形，菌體呈黃色，菌落表面出現(xiàn)皺縮，中央凸起，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，出現(xiàn)灰白色的孢子堆。在上述三種培養(yǎng)基中，該菌在ISP2培養(yǎng)基上生長較為茂盛，產(chǎn)孢能力較強(qiáng)，其次為PDA培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基上的菌生長較差。從菌落形態(tài)和顯微觀察，初步認(rèn)為該菌屬于放線菌(圖3)。

生理生化特征:對菌株JZB130180參考文獻(xiàn)《土壤微生物研究原理與方法》(林先貴，2010)中方法進(jìn)行淀粉酶水解、硫化氫產(chǎn)生、檸檬酸鹽利用、明膠液化、接觸酶、黑色素產(chǎn)生、硝酸鹽還原、牛奶凝固與胨化等部分生理生化特性測定。結(jié)果表明菌株JZB130180為革蘭氏陽性菌，可液化明膠，接觸酶和氧化酶陽性，能將牛奶凝固和胨化，能將淀粉水解，能微弱利用檸檬酸鹽，不產(chǎn)生黑色素和硫化氫。

序列測定及分析：將菌株JZB130180在PDA平板上活化，28℃培養(yǎng)5d，轉(zhuǎn)接入PD液體培養(yǎng)基中搖培24h，取1mL菌液，離心留菌體，采用Biomed細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取JZB130180菌株的基因組DNA。擴(kuò)增所選基因的引物序列設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增程序等詳細(xì)介紹見表1。PCR均采用25μL擴(kuò)增體系：10pmoL/L上下游引物各1μL，超純dNTP Mixture(10mmol/L)1μL，2.5U Taq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，基因組DNA模板(10ng)1μL，ddH₂O 18μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標(biāo)條帶經(jīng)切膠回收純化后，連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，X-gal藍(lán)白斑篩選，PCR方法檢測陽性克隆子，將陽性克隆子的菌液送往公司測序。本研究中的引物合成和序列測序均由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成。菌株JZB130180的16S rRNA基因擴(kuò)增并測序后，在LPSN(http://www.bacterio.net/)中選取同源性較高種的標(biāo)準(zhǔn)菌株，以Actinoalloteichuscyanogriseus IFO 14455^T為外圍，獲得的序列在NCBI網(wǎng)站利用BLAST進(jìn)行比對分析，并通過DNAMAN 5.2.2和MEGA 5.2.1Version 3軟件與GenBank中相近序列進(jìn)行多重序列匹配排列分析，Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)bootstrap(1000次循環(huán))驗(yàn)證系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。結(jié)果表明菌株JZB130180的16S rDNA，atpD，recA，rpoB的基因擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。從菌株JZB130180的16S rDNA序列(序列表中的序列1)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)上可以看出，菌株JZB130180與稻瘟霉素鏈霉菌Streptomyces blastmyceticus NRRL B-5480AY999802.1聚在了一個(gè)分支上。擴(kuò)增得到的菌株JZB130180的看家基因atpD，recA，rpoB的序列分別如序列表中序列2-4所示。這幾個(gè)看家基因的序列經(jīng)過NCBI網(wǎng)站的Blast搜索比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和由16S rDNA序列比對分析的結(jié)果基本一致，因此，將JZB130180菌株鑒定為稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)。

表1PCR擴(kuò)增基因及引物序列

稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180已于2016年11月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.13270。下文簡稱稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180或菌株JZB130180。

實(shí)施例2、稻瘟霉素鏈霉菌(Streptomyces blastmyceticus)JZB130180的抑菌譜測定

供試培養(yǎng)基：

LB瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g,瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.0～7.2；

LB液體培養(yǎng)基：除不加瓊脂外，其他同LB瓊脂培養(yǎng)基制作。

KB培養(yǎng)基：蛋白胨20.0g，甘油10.0mL，K₂HPO₄ 1.50g，MgSO₄·7H₂O 1.50g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，KOH調(diào)pH值至7.2；

上述所有培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓滅菌20min。

試驗(yàn)方法：

(1)對植物病原真菌的抑菌作用測定采用平板對峙法。具體操作步驟如下：先將菌株JZB130180和各種植物病原真菌(表2)分別在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4-5d，用直徑為7mm的無菌打孔器打制菌餅，在空白PDA平板上，平板中央放置病原菌菌餅，菌絲面緊貼培養(yǎng)基，在距離病原菌2.5cm處呈180°將菌株JZB1301800的菌餅反貼至培養(yǎng)基上，在25-28℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5-7d，以僅接病原菌的平板為空白對照，測定病原菌和菌株JZB130180菌落邊緣之間的抑菌帶寬和各病原菌空白對照的菌落直徑，每種病原菌三次重復(fù)；

(2)對植物病原細(xì)菌的抑菌作用測定采用雙層培養(yǎng)法，具體操作步驟如下：將活化的菌株JZB130180菌液點(diǎn)種在KB平板上，28℃培養(yǎng)48h，用3mL三氯甲烷以其蒸汽殺死菌株JZB130180菌體，靜置10～12h，以便三氯甲烷蒸氣揮發(fā)完全。植物病原細(xì)菌(表2)分別在LB液體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，180r/min 28℃振蕩培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)好的各種靶標(biāo)病原細(xì)菌分別用無菌生理鹽水制備成10⁸cfu/mL菌懸液。吸取100μl菌懸液加入3mL融化后冷卻至50℃的1％水瓊脂中，迅速混勻，立即倒入三氯甲烷已殺死菌株JZB130180的平板上，鋪成均勻的薄層，每個(gè)處理三次重復(fù)，28℃培養(yǎng)36h，觀察抑菌效果并十字交叉法測量抑菌圈直徑。

試驗(yàn)結(jié)果：

抑菌譜測定結(jié)果表明(見表2和圖6)，該菌幾乎對所有的植物病原真菌都有非常明顯的抑菌作用，對甘藍(lán)枯萎病菌和小麥紋枯病菌的抑菌帶寬達(dá)12mm，對蘋果輪紋病菌的抑菌作用較小，抑菌帶寬為0.5mm。對所選的植物病原細(xì)菌也均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑在35-50mm之間。表明該菌有較寬的抑菌譜。

表2JZB130180菌株的抑菌譜測定結(jié)果

注：“-”表示未測該項(xiàng)內(nèi)容；表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)數(shù)值的平均值，相同字母表示差異不顯著(P＜0.05)。

實(shí)施例3、菌株JZB130180的生防相關(guān)活性測定

1、供試培養(yǎng)基：CAS培養(yǎng)基(檢測嗜鐵素)由4種溶液(混合前單獨(dú)滅菌)組成。溶液1(CAS/HDTMA溶液)包括CAS溶液：60.5mg CAS(鉻天青)溶解在50mL水中；鐵溶液：含有1mmol/L FeCl₃·6H₂O的10mmol/L HCl溶液，pH為2.0；HDTMA溶液：72.9mg溴化十六碳烷基三甲氨溶解于40mL水中；把50mL的CAS溶液與10mL鐵溶液混合后加入40mL的HDTMA溶液并攪拌均勻，把得到的藍(lán)黑色液體滅菌，該液體即CAS/HDTMA溶液；溶液2(Salts/Buffer溶液)：將30.24g Pipes溶解于750mL Salts溶液(KH₂PO₄0.3g，NaCl0.5g，NH₄Cl 1.0g)中，以50％(W/V)KOH調(diào)節(jié)pH至6.8，加入15g瓊脂并用蒸餾水定容至800mL，高壓滅菌后冷卻至50℃；溶液3(750mL)：葡萄糖2g，甘露醇2g，MgSO₄·7H₂O 493mg，CaCl₂ 11mg，H₃BO₃ 1.4mg，ZnSO₄·7H₂O 1.2mg，MnSO₄·2H₂O 1.17mg，Na₂MoO₄·2H₂O 1mg，CuSO₄ 40μg，蒸餾水定容至750mL，高壓滅菌后冷卻至50℃。將750mL的溶液3加入到800mL溶液2后，并與30mL溶液4即過濾除菌的10％(W/V)casamino acid混合，最后將1580mL混合液加入100mL溶液1中，緩慢攪拌(避免產(chǎn)生泡沫)，鋪平板。

幾丁質(zhì)培養(yǎng)基(檢測幾丁質(zhì)酶)：膠體幾丁質(zhì)2.5g，K₂HPO₄ 0.7g，KH₂PO₄0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。

脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基(檢測蛋白酶)：進(jìn)口脫脂奶粉40g，瓊脂10g，去離子水1000mL，115℃高壓滅菌30min，與LB固體培養(yǎng)基1:9混勻，鋪成平板備用。

剛果紅培養(yǎng)基(檢測纖維素酶)：MgSO₄·7H₂O 0.25g，K₂HPO₄ 0.5g，纖維素1.88g，剛果紅0.2g，明膠2g，瓊脂4g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。

Pikovskaya’s瓊脂培養(yǎng)基(檢測磷酸酯酶)：酵母提取物0.5g，葡萄糖10g，Ca₃(PO₄)₂5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KCl0.2g，MgCl₂ 0.1g，MnSO₄·H₂O0.1mg，F(xiàn)eSO₄ 0.1mg，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。

液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉30.0g，葡萄糖10.0g，豆粕粉20.0g，蛋白胨6.0g，硫酸銨2.50g，MgSO₄﹒7H₂O 1.50g，KH₂PO₄ 0.30g，NaCl 7.50g，CaCO₃ 4.0g，高溫淀粉酶0.05g，蒸餾水1000mL，pH 7.0～7.4。

上述所有培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓滅菌20min。

2、試驗(yàn)

2.1生防相關(guān)胞外酶的檢測

2.1.1嗜鐵素的檢測

將菌株JZB130180先經(jīng)28℃在高氏一號培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5d后，接種于CAS培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3-5天后，觀察菌落外圍是否產(chǎn)生黃色暈圈。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。由于嗜鐵素競爭培養(yǎng)基中EDTA螯合的鐵離子，使培養(yǎng)基由藍(lán)色變成黃色，因此菌落周圍黃色暈圈出現(xiàn)表明嗜鐵素的產(chǎn)生。

2.1.2幾丁質(zhì)酶的檢測

將菌株JZB130180先經(jīng)28℃在高氏一號培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5d后，接種于幾丁質(zhì)培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3-5天后，觀察菌落外圍透明圈的產(chǎn)生，出現(xiàn)透明圈表明幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2.1.3蛋白酶的檢測

將菌株JZB130180先經(jīng)28℃在高氏一號培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5d后，接種于脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3-5天后，后觀察菌落外圍透明圈的產(chǎn)生，出現(xiàn)透明圈表明蛋白酶的產(chǎn)生。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2.1.4纖維素酶的檢測

將菌株JZB130180先經(jīng)28℃在高氏一號培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5d后，接種于剛果紅培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3-5天后，觀察菌落周圍紅色水解圈的產(chǎn)生，出現(xiàn)紅色水解圈表明纖維素酶的產(chǎn)生。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2.1.5磷酸酯酶的檢測

將菌株JZB130180先經(jīng)28℃在高氏一號培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5d后，接種于Pikovskaya’s瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3-5天后，觀察菌落周圍透明圈的產(chǎn)生，出現(xiàn)透明圈表明磷酸酯酶的產(chǎn)生。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

結(jié)果表明，菌株JZB130180能夠分泌幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、嗜鐵素和蛋白酶，不分泌磷酸酯酶(圖7)。其中的幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和嗜鐵素活性均是生防菌具備生防功能的重要參考指標(biāo)。

2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液的制備

菌株JZB130180在ISP2培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)5～7d后，取2環(huán)菌體接種到液體種子培養(yǎng)基(50mL裝量/500mL三角瓶)中，28℃200r/min在搖床上振蕩培養(yǎng)20～24h，取少量培養(yǎng)液于顯微鏡下觀察，觀察到大量菌絲且沒有被球狀或桿狀細(xì)菌污染，即為種子培養(yǎng)液，以3％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(100mL裝量/500mL三角瓶)中，28℃200r/min振蕩培養(yǎng)5～7d，結(jié)束發(fā)酵后，即為制備的發(fā)酵培養(yǎng)液。將該發(fā)酵培養(yǎng)液12000rpm離心10min取上清液，采用0.22μm微孔濾膜過濾上清液除菌，得到菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液。

2.3菌株JZB130180對桃褐腐病菌的抑菌活性

將桃褐腐病菌接種于PDA平板上，22℃培養(yǎng)5～7d至整個(gè)平板產(chǎn)豐富的孢子，加適量的無菌水至產(chǎn)孢平板上，將孢子刮下過自制的脫脂棉濾層，除掉菌絲，將孢子懸浮液用無菌水稀釋至10⁷個(gè)孢子/mL備用。一次性培養(yǎng)皿(Φ＝9cm)每皿倒入25mL PDA培養(yǎng)基，待凝固后吸取200μL桃褐腐病菌的孢子懸浮液均勻涂布于PDA平板上，在無菌條件下，將在PDA平板上培養(yǎng)好的桃褐腐病菌用Φ＝7mm的無菌打孔器打制菌餅，取出菌餅，每孔加入100μL的步驟2.2的菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液，放置22℃恒溫培養(yǎng)2～3d，觀察并測量抑菌圈直徑。

結(jié)果表明菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液在平板上對桃褐腐病菌的抑菌圈直徑達(dá)3.0cm以上(圖8)，說明菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液中含有對桃褐腐病菌強(qiáng)抑菌活性的物質(zhì)。

2.4菌株JZB130180對桃褐腐病菌的毒力測定

2.4.1桃褐腐病菌菌餅的制作

將桃褐腐病菌接種于PDA平板上，22℃培養(yǎng)5～7d至整個(gè)平板產(chǎn)豐富的孢子，加適量的無菌水至產(chǎn)孢平板上，將孢子刮下過自制的脫脂棉濾層，除掉菌絲，將孢子懸浮液用無菌水稀釋至10⁷個(gè)孢子/mL備用。一次性培養(yǎng)皿(Φ＝9cm)每皿倒入25mL PDA培養(yǎng)基，待凝固后吸取200μL桃褐腐病菌的孢子懸浮液均勻涂布于PDA平板上，在無菌條件下，將在PDA平板上培養(yǎng)好的桃褐腐病菌用Φ＝6mm的無菌打孔器打出一定數(shù)量的桃褐腐病菌菌餅。

2.4.2含毒介質(zhì)制備：當(dāng)PDA培養(yǎng)基熔化涼至45℃左右，將步驟2.2的菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液和PDA(20mL)按照1.25％、2.5％、5％、10％、20％的比例混合，菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液的最終濃度為12.5μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL制成薄厚一致的均勻平板，得到含毒介質(zhì)。以不加菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液的PDA為空白對照。每個(gè)處理3次重復(fù)，冷卻后待用。

2.4.3室內(nèi)毒力測定

用無菌的接種針把2.4.1的桃褐腐病菌菌餅置于2.4.2的含毒介質(zhì)上，菌絲面朝下，每個(gè)平板中央上放置1塊6mm菌餅，22℃低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

結(jié)果記錄：培養(yǎng)5～7d后，十字交叉法測量菌落直徑，數(shù)據(jù)分析回歸求出發(fā)酵液的EC₅₀。

菌落直徑(mm)＝實(shí)際測量菌落直徑平均值-6

相對抑制率(％)＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100％

以菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液在PDA中的含量為濃度，濃度的對數(shù)值為自變量X、抑制率幾率值為因變量Y，求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、EC₅₀值結(jié)果見表3。

從表3可知，菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液對桃褐腐病菌的EC₅₀為40.5μg/mL，說明菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液對桃褐腐病原具有較強(qiáng)的抑制作用。從圖9可以明顯看出隨著濃度的增加對桃褐腐病原菌菌絲的生長抑制作用越強(qiáng)，濃度為20％時(shí)，菌絲完全不生長。

表3菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液對桃褐腐病的毒力測定結(jié)果

2.5菌株JZB130180對桃褐腐病和番茄灰霉病防效的測定

2.5.1病原菌的孢子懸浮液制備：桃褐腐病菌和番茄灰霉病菌分別在PDA上23～25℃恒溫培養(yǎng)4～5d后，刮取其分生孢子置于無菌水中，放到振蕩器上振蕩，配成桃褐腐病菌孢子懸浮液(桃褐腐病菌含量為10⁸cfu/mL)和番茄灰霉病菌孢子懸浮液(番茄灰霉病菌含量為10⁸cfu/mL)。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)方法如下：選擇外表整齊、沒有病蟲害和機(jī)械損害的桃果實(shí)(品種：久保)和番茄果實(shí)(品種：佳粉19)。先用0.5％NaClO將果實(shí)處理1min，用無菌水多次沖洗干凈。在果實(shí)腰部用無菌接種針刺5mm(深)×3mm(寬)的傷口，每個(gè)果實(shí)扎4個(gè)孔，傷口晾干后，將桃果實(shí)隨機(jī)均分為3組，每組5個(gè)果實(shí)，分別為處理A1(陰性對照)、處理B1和處理C1。將番茄果實(shí)隨機(jī)均分為4組，每組5個(gè)果實(shí)，分別為處理A2(陰性對照)、處理B2、處理C2和處理D。

處理A1的每個(gè)桃果實(shí)接種50μl無菌水，待完全吸收后，每個(gè)桃果實(shí)接種30μl步驟2.5.1的桃褐腐病菌孢子懸浮液；處理B1的每個(gè)桃果實(shí)接種50μl步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液，待完全吸收后，每個(gè)桃果實(shí)接種30μl步驟2.5.1的桃褐腐病菌孢子懸浮液；處理C1的每個(gè)桃果實(shí)接種50μl步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液5倍稀釋液(用無菌水稀釋步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液5倍得到的液體)，待完全吸收后，每個(gè)桃果實(shí)接種30μl步驟2.5.1的桃褐腐病菌孢子懸浮液。處理A2的每個(gè)番茄果實(shí)接種50μl無菌水，待完全吸收后，每個(gè)番茄果實(shí)接種30μl步驟2.5.1的桃褐腐病菌孢子懸浮液；處理B2的每個(gè)番茄果實(shí)接種50μl步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液，待完全吸收后，每個(gè)番茄果實(shí)接種30μl步驟2.5.1的桃褐腐病菌孢子懸浮液；處理C2的每個(gè)番茄果實(shí)接種50μl步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液5倍稀釋液(用無菌水稀釋步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液5倍得到的液體)，待完全吸收后，每個(gè)番茄果實(shí)接種30μl步驟2.5.1的桃褐腐病菌孢子懸浮液；處理D的每個(gè)番茄果實(shí)接種50μl步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液10倍稀釋液(用無菌水稀釋步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液10倍得到的液體)，待完全吸收后，每個(gè)番茄果實(shí)接種30μl步驟2.5.1的桃褐腐病菌孢子懸浮液。放置到塑料包裝箱中，外套一層保鮮膜，23℃，保濕(濕度不低于90％)培養(yǎng)。每隔24h統(tǒng)計(jì)各處理發(fā)病情況和病斑直徑。根據(jù)病斑直徑按照如下公式計(jì)算桃褐腐病和番茄灰霉病的防治效果：防治效果(％)＝(陰性對照病斑直徑－相應(yīng)處理的病斑直徑)/陰性對照病斑直徑×100％。

從桃果實(shí)的發(fā)病率與病斑直徑可以看出，步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液(簡稱原液)和步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液5倍稀釋液(簡稱5倍稀釋液)對褐腐病菌均表現(xiàn)抑制效果，濃度越高抑制效果較好(表4和圖10)。原液處理的果實(shí)在前2天防治效果達(dá)100％。在第3天以后，原液對褐腐病菌的防效高于5倍稀釋液10％以上。說明接種菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液能推遲桃果實(shí)褐腐病的發(fā)生，并對病斑擴(kuò)展也有一定抑制作用，對桃褐腐病的防治效果達(dá)50％以上。

表4菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液對桃褐腐病的防效測定結(jié)果

步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液(簡稱原液)和步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液5倍稀釋液(簡稱5倍稀釋液)和步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液10倍稀釋液(簡稱10倍稀釋液)對番茄灰霉病菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制效果(表5和圖11)。原液處理表現(xiàn)最好，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中一直未發(fā)病，其次是5倍稀釋液處理，最后是10倍稀釋液。前2天所有的處理病斑直徑均不明顯，但發(fā)病率隨濃度的增加而降低。在第6天時(shí)，5倍稀釋液和10被稀釋液的發(fā)病率為20％和70％均明顯低于CK(100％)，并隨培養(yǎng)時(shí)間延長，防治效果仍很明顯。隨著濃度的增加，處理組與CK相比病斑直徑小，發(fā)病率低。說明步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液能夠預(yù)防番茄灰霉病的發(fā)生，可有效預(yù)防番茄灰霉病。

表5菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液對番茄灰霉病的防效測定結(jié)果

實(shí)施例4、菌株JZB130180對植物的的促生作用測定

(1)浸種處理：佳粉19番茄種子使用75％酒精表面消毒5分鐘，無菌水沖洗3次，10％次氯酸鈉溶液表面消毒10min，無菌水漂洗5次后，將形態(tài)盡量一致的番茄種子分為自來水浸種處理(空白對照CK1)、50倍浸種處理、100倍浸種處理和500倍浸種處理。

50倍發(fā)酵稀釋液浸種處理(50X)：用實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液50倍稀釋液(用自來水稀釋實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液50倍得到的液體)浸種24h，每12h更換一次處理液。

100倍發(fā)酵稀釋液浸種處理(100X)：用實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液(用自來水稀釋實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液100倍得到的液體)浸種24h，每12h更換一次處理液。

500倍發(fā)酵稀釋液浸種處理(500X)：用實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液500倍稀釋液(用自來水稀釋實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液500倍得到的液體)浸種24h，每12h更換一次處理液。

自來水浸種處理(空白對照CK1)：用等體積的自來水浸種24h，每12h更換一次處理液。

浸種后，將其播種于營養(yǎng)缽(滅菌土+草炭＝1:1)中，以自來水浸種為對照，在播種后培養(yǎng)的第10d、20d、30d和40d時(shí)調(diào)查促生效果。每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5個(gè)營養(yǎng)缽，每缽播三粒番茄種子。

(2)澆灌處理：將經(jīng)過預(yù)處理萌發(fā)的佳粉19番茄種芽播種于營養(yǎng)缽中，待苗長至兩葉期，分為自來水灌根處理(空白對照CK2)、50倍灌根處理、100倍灌根處理和500倍灌根處理。

50倍發(fā)酵稀釋液灌根處理(50X)：用20mL實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液50倍稀釋液開始進(jìn)行第一次根部澆灌，以后每隔10d用與第一次澆灌相同體積的實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液50倍稀釋液根部澆灌1次，共澆灌三次。

100倍發(fā)酵稀釋液灌根處理(100X)：用20mL實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液開始進(jìn)行第一次根部澆灌，以后每隔10d用與第一次澆灌相同體積的實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液100倍稀釋液根部澆灌1次，共澆灌三次。

500倍發(fā)酵稀釋液灌根處理(500X)：用20mL實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液500倍稀釋液開始進(jìn)行第一次根部澆灌，以后每隔10d用與第一次澆灌相同體積的實(shí)施例3的步驟2.2菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液500倍稀釋液根部澆灌1次，共澆灌三次。

空白對照灌根處理(空白對照CK2)：用20mL自來水開始進(jìn)行第一次根部澆灌，以后每隔10d用與第一次澆灌相同體積的自來水根部澆灌1次，共澆灌三次。

每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5個(gè)營養(yǎng)缽，每缽播三粒番茄種子。

測定指標(biāo)和方法：苗高和根長，根數(shù)，發(fā)芽率、苗鮮重等。用直尺測量各處理幼苗和根的長度，其中根以最長的一根為測量對象，以每一處理的所有參試幼苗的平均值作為苗高和根長。根數(shù)：統(tǒng)計(jì)所有長度大于1cm的根的條數(shù)，最后同樣取每一處理的所有參試幼苗的平均值。

試驗(yàn)結(jié)果：

連續(xù)檢測40d的試驗(yàn)結(jié)果表明，與自來水處理的空白對照相比，各濃度菌株JZB130180無菌發(fā)酵濾液處理后番茄苗的長勢旺，其中，經(jīng)過浸種處理的番茄，苗的須根數(shù)明顯增多，主根長占明顯優(yōu)勢；經(jīng)過灌根處理的番茄苗，莖粗、主根及莖長，須根數(shù)、株高、植株鮮重等與空白對照相比有顯著差異，且在生長后期上述各指標(biāo)優(yōu)于空白對照自來水浸種處理番茄苗(表6和圖12)。綜合考慮統(tǒng)計(jì)結(jié)果，選擇100倍發(fā)酵稀釋液灌根，500倍發(fā)酵稀釋液浸種效果為最佳。

表6 JZB130180菌株處理對番茄幼苗的促生作用測定(從播種起第20d調(diào)查結(jié)果)

注:表中a.b.c.d.列的數(shù)據(jù)均為所設(shè)試驗(yàn)重復(fù)的平均值。

<110> 北京市農(nóng)林科學(xué)院

<120> 一株生防鏈霉菌及其應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1535

<212> DNA

<213> 稻瘟霉素鏈霉菌（Streptomyces blastmyceticus）

<400> 1

agcttgcatg cctgcaggtc gacgattgag agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg 60

cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacga tgaagccttt cggggtggat tagtggcgaa 120

cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct gcactctggg acaagccctg gaaacggggt 180

ctaataccgg ataatacctg ccgaggcatc tcggtgggtt gaaagctccg gcggtgcagg 240

atgagcccgc ggcctatcag cttgttggtg gggtgatggc ctaccaaggc gacgacgggt 300

agccggcctg agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 360

gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga 420

gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg aagaagcgag agtgacggta 480

cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa 540

gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gcttgttgcg tcggatgtga 600

aagcccgggg cttaaccccg ggtctgcatt cgatacgggc aggctagagt tcggtagggg 660

agatcggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac accggtggcg 720

aaggcggatc tctgggccga tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga 780

ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gttgggaact aggtgtgggc gacattccac 840

gtcgtccgtg ccgcagctaa cgcattaagt tccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct 900

aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcagcgg agcatgtggc ttaattcgac 960

gcaacgcgaa gaaccttacc aaggcttgac atacaccgga aacggccaga gatggtcgcc 1020

cccttgtggt cggtgtacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080

ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg ttctgtgttg ccagcatgcc cttcggggtg 1140

atggggactc acaggagact gccggggtca actcggagga aggtggggac gacgtcaagt 1200

catcatgccc cttatgtctt gggctgcaca cgtgctacaa tggccggtac aatgagctgc 1260

gataccgtga ggtggagcga atttcaaaaa gccggtctca gttcggattg gggtctgcaa 1320

ctcgacccca tgaagttgga gttgctagta atcgcagatc agcattgctg cggtgaatac 1380

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca cgtcacgaaa gtcggtaaca cccgaagccg 1440

gtggcccaac ccttgtggag ggagccgtcg aaggtgggac tggcgattgg gacgaagtcg 1500

taacaaggta tccgtaatct ctagaggatc cccgg 1535

<210> 2

<211> 870

<212> DNA

<213> 稻瘟霉素鏈霉菌（Streptomyces blastmyceticus）

<400> 2

tccgagatca ccgagcgctg gccgatccac cgcaaggcgc cgaacttcga ccagctcgag 60

tccaagaccg agatgttcga gaccggcgtc aaggtcatcg acctgctgac cccgtacgtc 120

aagggcggca agatcggtct gttcggtggt gccggtgtcg gcaagaccgt gctgatccag 180

gaaatgatct accgcgtggc caacaaccac gacggtgtgt cggtgttcgc cggtgtcggt 240

gagcgcaccc gtgagggcaa cgacctcatc gaggaaatga ccgactcggg cgtcatcgac 300

aagacggcgc tcgtcttcgg ccagatggac gagcccccgg gcacccgtct gcgcgtcgcc 360

ctggccggtc tgaccatggc ggagtacttc cgcgatgtgc agaagcagga cgtgctcttc 420

ttcatcgaca acatcttccg ttacacccag gccggttccg aggtgtccac cctgctcggc 480

cgcatgccgt ccgcggtggg ttaccagccg aacctggcgg acgagatggg tctgctgcag 540

gagcgcatca cctcgacccg cggtcactcg atcacctcga tgcaggcgat ctacgtcccc 600

gcggacgacc tgaccgaccc ggcgccggcc accaccttcg cccacctgga cgcgacgacc 660

gttctgtcgc gtccgatctc ggagaagggc atctacccgg cggtcgaccc gctggactcg 720

acgtcccgca tcctggaccc gcgctacatc gcgcaggagc actacgactg cgccatgcgc 780

gtcaagacga tcctgcagaa gtacaaggac ctccaggaca tcatcgcgat cctcggtatc 840

gacgagctgg gcgaggagga caagctcgtc 870

<210> 3

<211> 825

<212> DNA

<213> 稻瘟霉素鏈霉菌（Streptomyces blastmyceticus）

<400> 3

cctcggcgac cggccgaacg accccatcga ggtcatcccc accgggtcga ccgcactcga 60

cgtcgctctc ggcgtcggcg ggctgccccg cggccgcgtc gtggaggtgt acggaccgga 120

gtcctccggt aagaccaccc tcaccctgca cgccgtggcc aacgcccaga aggcgggcgg 180

caccgtcgcc ttcgtcgacg cggagcacgc gctcgacccg gagtacgcga aggcgctggg 240

cgtcgacacc gacaacctca tcctctccca gccggacacc ggcgagcagg cgctggagat 300

cgtggacatg ctggtccgct ccggcgccct cgacctgatc gtcatcgact ccgtcgccgc 360

gctcgtgccg cgtgcggaga tcgagggcga gatgggcgac tcccacgtcg gcctccaggc 420

gcgactgatg agccaggcgc tccgcaagat caccagcgcg ctcaaccagt ccaagaccac 480

cgcgatcttc atcaaccagc tccgcgagaa gatcggcgtc atgttcggct cgccggagac 540

gacgaccggt ggccgggccc tgaagttcta cgcctcggtg cgcctggaca tccgccgcat 600

cgagaccctc aaggacggca cggaggccgt cggcaaccgc acccgcgtca aggtcgtcaa 660

gaacaaggtc gcgccgccct tcaagcaggc cgagttcgac atcctctacg gccagggcat 720

cagccgcgag ggcggcctga tcgacatggg cgtggagcac ggcttcgtcc gcaaggccgg 780

cgcctggtac acgtacgagg gcgaccagct cggccagggc aagga 825

<210> 4

<211> 871

<212> DNA

<213> 稻瘟霉素鏈霉菌（Streptomyces blastmyceticus）

<400> 4

tcaaggagtt cttcggcacc agccagctgt cccagttcat ggaccagacg aacccgctgt 60

cgggcctgac ccacaagcgc cgtctgtccg cgctgggccc cggtggtctg tcccgtgagc 120

gggccggctt cgaggtccga gacgtccacc cgtcgcacta cggccgcatg tgcccgatcg 180

agacgcccga aggcccgaac atcggtctga tcggctcgct cgcgtcgtac ggccgcgtca 240

acgcgttcgg tttcgtcgag accccgtacc gcaaggtcgt gggcggcgtc gtcaccgacg 300

acgtggacta cctgactgcc gacgaggaag accgcttcgt catcgcgcag gcgaacgccc 360

ccctcaccga ggacatgcgt tacgccgagt cgcgcgtgct ggtccgccgc cgtggcggcg 420

agatcgacta catcgccggc gacgacgtcg actacatgga cgtctccccg cgccagatgg 480

tgtcggtcgc gaccgcgatg atccccttcc tcgagcacga cgacgccaac cgcgcgctca 540

tgggatcgaa catgatgcgc caggccgttc cgctgatcaa ggcggaggcc ccgctggtcg 600

gcaccggcat ggagtaccgc tgtgcggtcg acgccggtga cgtcatcaag gcggagaagg 660

acggtgtggt ccaggaggtc tccgcggact acgtcaccgt cgccaacgac gacggcacgt 720

acaacacgta ccgggtcgcc aagttctccc gctccaacca gggcacgtcc ttcaaccaga 780

aggtcgtcgt cgacgagggc gcccgggtcg tctccggcca ggtgctcgcc gacggtccgt 840

ccacggacga gggcgagatg gccctcggca a 871