本發(fā)明屬于生物化學領域，涉及一種順鉑熒光配合物，還涉及該順鉑熒光配合物在制備核苷酸和蛋白質探針中的應用。

背景技術：

熒光素是具有共軛雙鍵體系化學結構的化合物，當受到特定波長光照射時，被激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)恢復到基態(tài)過程中可發(fā)出熒光。熒光素的這一特性，被廣泛運用于生物學和醫(yī)學領域的檢測中。熒光素在生物學和醫(yī)學領域中的運用始于上世紀80年代末，目前，在生物學和醫(yī)學領域，熒光素主要用于標記核苷酸和蛋白質。具體分述如下：

核苷酸(DNA，RNA)的熒光素標記技術，主要包括：(1)酶促生物素標記核酸法：主要是以生物素化的脫氧核苷三磷酸(Bio-11-dUTP,Bio–7–dATP、Bio-11-dCTP等)經DNA聚合酶作用摻入DNA。Bio-dUTP代替dTTP,Bio-dATP代替dATP，Bio-dCTP代替dCTP。(2)末端標記法：主要分為5’-磷酸的化學標記法和3’-OH的酶促標記法。5’-磷酸的化學標記法是在寡核苷酸上的5’-磷酸上接一個乙二胺，然后用琥珀酰亞胺生物素，將生物素基團連接在磷酸酰胺基上。3’-OH的酶促標記法是用末端轉移法將Bio-11–dUTP加于其3’-OH端(脫去一個焦磷酸)。(3)酶標DNA法：使用辣根過氧化酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)作為標記試劑。通過對苯醌(PBQ)與聚乙烯亞胺(PEI)連接成(HRP-PBQ-PEI+)，此試劑在戊二醛的作用下與變性的DNA結合，使HRP與DNA連接在一起，組成HRP標記的DNA探針。(4)酶標寡核苷酸法：包括核苷酸5’末端標記HRP法和內部標記AP法。核苷酸5’末端標記HRP法是在HRP中產生一個-HS反應基團，在寡核苷酸合成終了加在5’端，帶一個C6的-HS基，與活化的HRP反應生成5’-HRP寡核苷酸。內部標記AP法是在全成寡核苷酸過程中將一個5’帶連接臂及CF3基團的尿苷3’亞磷酰亞胺合成在寡核苷酸鏈中，合成后此活化的寡核苷酸與AP反應即得到AP標記的寡核苷酸。(5)DNA半抗原標記法：其原理與Bio-11-dTUP相同，只是用毛地黃甙代替生物素形成Dig–11-dUTP，酶促摻入DNA分子。用抗毛地黃甙抗體檢測標記在DNA上的半抗原分子(地高辛)。

此外，常用的核苷酸鏈熒光標記技術主要包括缺口平移法和隨機引物標記法兩種。

其中，所述缺口平移法是指：在DNA合成酶的作用下，隨機在雙鏈DNA分子的一條鏈上隨機切開若干個缺口，在3’—OH端逐個加入新的核苷酸，同時切除5’端游離的核苷酸，導致了新鏈合成缺口的平移，新鏈核苷酸的合成是以另一互補鏈為模板，按堿基互補的原則合成；在新鏈合成中用上述方法標記dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dUTP)，標記熒光的核苷酸就被摻入到新鏈中，達到核苷酸鏈標記目的。

其中，所述隨機引物標記法是指：在Klenow酶催化下，通過隨機引物結合目標核苷酸序列，以模板鏈為參照合成互補鏈的方法。在此過程中，用熒光素、生物素、半抗原(地高辛)等標記過的脫氧核苷三磷酸dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dUTP)摻入到核苷酸新鏈中，從而使靶核苷酸鏈(DNA鏈)得以高效標記。

此外，蛋白質的標記主要是通過熒光素衍生化反應來實現的。其主要原理是，蛋白質結構中的一些功能性氨基酸基團與熒光素以共價鍵相連接，從而使目的蛋白質被標記。通常在以蛋白質氨基端作為衍生化位點，其上的氫原子在堿性條件下被熒光基團取代，且反應條件相對溫和，因此，是目前常用的蛋白質標記方法。

目前，以上標記方法已被廣泛應用于核酸和蛋白質標記的研究和醫(yī)學診斷中，有些已作為臨床診斷和評估的指標。例如：應用熒光原位雜交探針，原位雜交探針，抗體和蛋白質標記技術檢測各種疾病中相關指標的改變。目前常用的熒光素一般為FITC，羅丹明等。但是，現有技術中的標記方法仍然存在標記效率不高、標記時間長和熒光強度不穩(wěn)定等缺陷。

因此，如何設計并合成出一種新的配合物，使得其既能與熒光素相連接，又能與脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白質牢固連接，以期用該配合物作為生物探針的連接主體，應用于目標DNA、RNA和蛋白質的檢測。

技術實現要素：

針對上述現有技術中存在的缺陷與不足，發(fā)明人合成了一種新的以金屬鉑為骨架的配位化合物，并發(fā)明了以之為介導的核苷酸或蛋白質的標記新方法；該方法實現以金屬鉑為骨架的配位化合物為介導，牢固連接熒光素和靶分子(核苷酸或蛋白質)，從而達到熒光標記的目的。

具體地，本發(fā)明第一方面提供了一種順鉑熒光配合物，具有如下結構式：

其中，n＝3，4，5，6，7，8，9；

其中，Marker為標記基團，至少包括熒光素。

優(yōu)選地，上述順鉑熒光配合物中，所述標記基團還包括：生物素和/或半抗原。其中，半抗原例如為地高辛。

值得說明的是，本發(fā)明所提供的順鉑熒光配合物中，金屬Pt原子分別與3個氮原子和1個氯原子配位，當其與核苷酸或蛋白質相結合時，氯原子會被脫去而與核苷酸或蛋白質上的結合位點形成共價鍵。具體地，所述順鉑熒光配合物可以連接生物素，并連接地高辛等半抗原化合物，也可以直接連接熒光素(如羅丹明，FITC，DEAC，Cy5，Cy3)，同時，可牢固地連接鳥嘌呤(Guanine)氮原子N7位點，產生共價鍵牢固結合，達到標記核酸鏈(DNA鏈，RNA鏈)的目的?；谏鲜鎏攸c，本發(fā)明所述的順鉑熒光配合物能用于對熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)，原位雜交(in situ Hybridization，ISH)，比較基因組雜交(comparative genomic hybridization，CGH)以及基因芯片中的核苷酸鏈進行熒光或者染料標記。而在所述順鉑熒光配合物與蛋白質結合時，具體的結合位點為：例如，所述順鉑熒光配合物與甲硫氨酸(Methionine)，半胱氨酸(Cysteine)側鏈上的硫原子形成共價鍵，和組氨酸(Histidine)分子上的氮原子形成穩(wěn)定的化學結構。

優(yōu)選地，上述順鉑熒光配合物中，所述標記基團選自以下A～I中的任一種：

本發(fā)明的第二方面，還提供了一種本發(fā)明第一方面所述順鉑熒光配合物在制備核苷酸和蛋白質探針中的應用。

本發(fā)明的第三方面，還提供了一種本發(fā)明第一方面所述順鉑熒光配合物在制備試劑盒中的應用，其中，所述試劑盒用于疾病的早期診斷、治療隨診、預后或復發(fā)診斷。

本發(fā)明所提供的順鉑熒光配合物，既能與熒光素相連接，又能與脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白質牢固連接，從而能夠作為生物探針的連接主體，十分適用于目標DNA、RNA和蛋白質的檢測。相較于現有技術中的標記方法，本發(fā)明所提供的順鉑熒光配合物用于核苷酸和蛋白質標記具有如下優(yōu)點：(1)標記速度快：經多次實驗表明，完成對DNA標記的平均時間不超過45分鐘，完成對RNA標記的平均時間不超過20分鐘，完成對蛋白質(抗體)標記的平均時間不超過30分鐘；(2)操作步驟簡單，避免使用傳統(tǒng)的酶標記技術，操作條件不苛刻，使用方便；(3)對石蠟標本，福爾馬林包埋組織的標記效果顯著；(4)不受標記分子大小的限制，理論上對于Micro RNA(約20bp)至大片段核酸探針(>20kb)都能進行有效標記；不受標記混合體系的pH值的影響；可以廣泛用于核苷酸、蛋白質(抗體)、核酸和蛋白質微陣列(Micro Arrays)，比較基因組雜交等細分領域。

綜上所述，所述順鉑熒光配合物在用于標記核苷酸或蛋白質時，顯著提高了標記效率，縮短了標記時間并增加了熒光強度穩(wěn)定性，取得了優(yōu)異的標記效果；因此，本發(fā)明所提供的順鉑熒光配合物在核苷酸和蛋白質探針的制備、生物醫(yī)藥研發(fā)、疾病的診斷等領域具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1顯示了本發(fā)明所述的順鉑熒光配合物的結構式，并示出了其標記基團與用于連接核算或蛋白質的部位；

圖2為n＝6時本發(fā)明所述的順鉑熒光配合物的合成路線圖；

圖3為n＝3，標記基團分別為E，C，G，I時，所述順鉑熒光配合物的濃度(X軸)與熒光強度(Y軸)的關系曲線圖；

圖4為n＝6，標記基團分別為E，C，G，I時，所述順鉑熒光配合物的濃度(X軸)與熒光強度(Y軸)的關系曲線圖；

圖5為n＝9，標記基團分別為E，C，G，I時，所述順鉑熒光配合物的濃度(X軸)與熒光強度(Y軸)的關系曲線圖；

圖6為所述順鉑熒光配合物結合生物素(n＝6)、親和素以及Cy5標記的熒光抗體進行標記后，所形成的生物素-親和素-熒光抗體復合物的濃度(X軸)與熒光強度(Y軸)的關系曲線圖；

圖7為實施例4中所實施的鉑－熒光素標記方法用于標記的熒光原位雜交探針在精子染色體中的熒光檢測圖；其中(1000倍油鏡下)，藍色代表DAPI復染的精子核部分，紅色代表精子Y染色體，綠色信號代表X染色體(原圖為彩色，此處為灰度圖)；

圖8為實施例5中所標記的精子的熒光檢測圖，其中(1000倍油鏡下)，綠色代表熒光染料FITC發(fā)出的熒光，熒光信號明亮，該熒光集中在精子尾部，精子頭部較少染色(原圖為彩色，此處為灰度圖)；

圖9為實施例6對照組中的順鉑熒光配合物標記抗體標記膀胱癌T24細胞凋亡的顯微圖，其中，棕褐色表示凋亡細胞，藍色表示正常細胞，因此可見凋亡細胞極少(原圖為彩色，此處為灰度圖)；

圖10為實施例6實驗組中的順鉑熒光配合物標記抗體標記膀胱癌T24細胞凋亡的顯微圖，其中，棕褐色表示凋亡細胞，藍色表示正常細胞，因此可見大量的凋亡細胞(原圖為彩色，此處為灰度圖)。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實施方式。

實施例1

n＝6時本發(fā)明所述的順鉑熒光配合物的合成

如圖2所示的合成路線，具體步驟如下：

(1)以1,6-二氨基己烷作為起始反應物；首先將(Boc)₂O(12.3g,0.056m ol)溶解在100mL二氯甲烷中，然后緩慢滴加溶有1,6-二氨基己烷(33g,0.28mol)的150mL二氯甲烷溶液，0℃下反應4小時，然后室溫下反應20小時；反應完全后，用4×100mL飽和食鹽水洗滌反應液，分液，有機相用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，得到14.3g無色油狀液體，即N-Boc-1,6-二氨基己烷(N-Boc-1,6-diaminohexane，中間體a)，無需純化，直接進行下一步反應。

(2)將[Pt(en)Cl2](500mg，1.53mmol)溶解在50ml DMF中，然后加入AgNO₃(248mg,1.46mmol,0.95equiv)，避光室溫攪拌16小時，過濾除去AgCl，將化合物a(315mg,<0.8equiv)溶解在25mL正己烷中，加入到上述濾液中，40℃下反應過夜，減壓除去溶劑，柱色譜分離純化，得到白色粉末，即中間體b([Pt(II)(N-tert-Butoxycarbonyl-1,6-hexanediamine)(en)Cl](NO₃))(650mg收率74％)，1H NMR(D2O):δ＝3.11(2H),2.71(4H),2.63(2H),1.69(2H),1.52(2H),1.46(9H),1.39(4H)ppm；195Pt-NMR:δ＝-2625ppm。

(3)將化合物b(28mg,0.05mmol)溶解在2mL三氟乙酸中，50℃下過夜反應，然后用5M NaOH溶液調節(jié)到中性，過濾，干燥得到中間體c，將中間體c溶解在一定量的DMF中，加入1.2equiv EDC和三乙胺，室溫下反應12小時，反應結束后柱色譜分離得到最終產物。

實施例2

本實驗將鉑與羅丹明，DEAC，gloxalic acid,FITC,TRITC,Alexa fluor 594等熒光素進行標記，并對熒光強度進行測定。結果提示順鉑為介導的配合物能與以上熒光素很好地結合，發(fā)射熒光。(本實驗使用的順鉑熒光配合物的n＝3，6，9)。將marker-Pt配位化合物溶解在0.1M三羥甲基氨基甲烷的緩沖溶液中，pH＝7.1，室溫下對熒光強度進行測定。有機順鉑熒光化合物(碳鏈長度分別是n＝3，n＝6，n＝9)的熒光強度和配合物濃度之間的關系如圖3～5所示。

我們還采用有機順順鉑熒光配合物結合生物素，并且使用親和素、標記Cy5的熒光抗體進行標記，形成生物素-親和素-熒光抗體復合物，熒光信號得到顯著放大。其結果見圖6。

實施例3

采用本發(fā)明所述的順鉑熒光配合物制備核酸和蛋白質探針的實驗

一、核苷酸標記方法

將100ug的純化的靶核苷酸克隆與2ug純化后的鉑－生物素－熒光素(FITC，Cy5)標記物(本實驗采用順鉑熒光配合物中的n＝6)混合，80℃反應約40min(反應時間根據靶分子類型可做適當調整，RNA反應時間可以縮短至20min左右)，吸出標記樣本的混合物，經過上述醋酸纖維素液相分離柱，得到純化的熒光素化的核苷酸序列。

二、蛋白質分子探針標記方法

將100ug的蛋白質(本實驗所用為抗體IgG)與1ug純化后的鉑－生物素－熒光素(FITC，Cy5)標記物(本實驗采用順鉑熒光配合物中的n＝6)混合，37℃反應約20min后，吸出標記樣本的混合物，經過液相分離柱，得到純化的熒光素化的抗體(蛋白質)。

結構式如下：

其中，復合物中的Marker可以被異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)，羅丹明(Rohdamine)，四甲基異氰酸羅達明(tetrametrylrhodarnine isothiocyante，TRITC)，Cy5，Cy3標記，該復合物也可以與半抗原類物質(如地高辛Digoxin)以及其他細胞染料等化合。

最終產物的分離和純化：使用醋酸纖維素液相色譜分離柱，在均相條件下合成了醋酸纖維素，將其涂漬在修飾硅膠表面，制備涂漬型高效液相色譜固定相。將合成后的產物裝入色譜柱，控制壓力為40Mpa左右，高效液相色譜正相色譜條件下，對產物進行高效分離。

三、采用本發(fā)明所述的順鉑熒光配合物制備的標記探針實驗結果

(1)評價標記手段：通過檢測探針的熒光信號值(F)，確定含有熒光基團的單核苷酸量(s)，并以此計算出該種核苷酸的總量(n)，最終可獲得探針DNA的量(w)。以總的探針DNA的質量(w)、或以總的探針DNA的質量(w)除以模板mRNA或DNA的質量(r)的比值e來表示熒光標記效率，可表示為：w＝4×324.5×n＝1298×(mk+1)×s；e＝(w/r)×100％＝(1298×(mk+1)×s/r)×100％。(2)標記效率結果：將已被克隆純化的人類乳腺癌Her-2基因，運用本發(fā)明標記技術(有機順鉑標記)標記法進行標記效率進行實驗比較，實驗組順鉑熒光配合物按照碳鏈長度分為n＝3，n＝6，n＝9三組，每組共重復進行5次標記實驗。實驗結果用SPSS14.0軟件進行統(tǒng)計分析。當碳鏈長度n＝3時，順鉑熒光配合物標記效率達到(2.563±0.461)％；當碳鏈長度n＝6時，順鉑熒光配合物標記效率達到(2.865±0.229)％；當碳鏈長度n＝9時，順鉑熒光配合物標記效率達到(2.665±0.327)％，結果表明：順鉑熒光配合物(n＝3，6，9)三組之間標記效率無顯著差異(p>0.05)。

(3)標記時間結果：運用順鉑熒光配合物標記法對人類乳腺癌Her-2克隆基因進行標記，其中實驗組順鉑熒光配合物按照碳鏈長度分為n＝3，n＝6，n＝9三組。每組共重復進行5次標記實驗。統(tǒng)計標記所需時間差異，結果用SPSS14.0軟件進行分析。當碳鏈長度n＝3時，順鉑熒光配合物標記方法所用的平均標記時間為(40±3.42)分鐘；當碳鏈長度n＝6時，順鉑熒光配合物標記方法所用的平均標記時間為(32.2±5.69)分鐘；當碳鏈長度n＝9時，順鉑熒光配合物標記方法所用的平均標記時間為(42.8±6.21)分鐘。順鉑熒光配合物標記方法三組之間(碳鏈n＝3，6，9時)，三者差異有顯著性(p<0.05)，當碳鏈長度n＝6時，標記時間更短。

(4)標記靶分子長度比較結果：采取X染色體著絲粒寡核苷酸重復序列和P53基因克隆進行鉑－熒光素方法標記(采用碳鏈長度n＝3，n＝6，n＝9三組進行實驗)。X染色體探針序列長度42bp(5’GACGATGGAGTTAACTCAGGGAGCT GAACATTCGTTATGATG3’)，P53基因長度約為20kb，按照(n＝3，n＝6，n＝9)分3組對X著絲粒序列和P53基因分別標記，每組重復實驗10次，并用FI TC標記的鉑復合物進行標記反應，反應時間40min，溫度82℃。反應完成后將混合物經過醋酸纖維素液相色譜柱，40Mpa高壓分離過柱純化。將純化后的標記產物在紫外分光光度計檢測下，控制檢測波長480nm左右，統(tǒng)計吸光度，并按照上述評價標記手段進行標記長度結果統(tǒng)計。實驗結果使用SPSS14.0軟件分析。本發(fā)明方法對小片段的X染色體DNA探針標記率：當n＝3時，標記效率達到(2.660±0.501)％；n＝6時，標記效率達到(2.792±0.483)％；n＝9時，標記效率達到(2.611±0.495)％。標記人類P53基因(>20kb)的標記效率：當n＝3時，標記效率達到(2.632±0.596)％；當n＝6時，標記效率達到(2.807±0.310)％，當n＝9時，標記效率達到(2.718±0.441)％。n＝3，6，9時，X著絲粒片段組相對P53組其標記效率均無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。由此可見，該標記技術能高效標記核酸片段，并且不受片段長度影響。

實施例4

采用本發(fā)明所述順鉑熒光配合物介導標記的寡核苷酸熒光原位雜交探針檢測人類精子染色體的試驗(熒光原位雜交技術(FISH))

針對X，Y染色體著絲粒區(qū)域的高度串聯重復片段(Satellite III，Alpha S atellite)，設計DNA寡核苷酸探針序列，具體序列如下：

X染色體著絲粒序列

5’GACGATGGAGTTAACTCAGGGAGCTGAACATTCGTTATGATG3’

5’ATTTCTTTGGAATCGGGAGTCAATATTTCCACAG3’

Y染色體著絲粒序列

5’TCCATTGGAGTCAATTCTACGCTTTCGACACCCA3’

5’CCAGTCGAATCCATTCTGCAGAGTACATACC3’

5’CTGCATACAATTTCATGCCTCCATTCGTTCCCA3’

用合適的合成方法合成上述DNA序列(X，Y染色體)，取合成產物(約2OD值)，加100ul去離子水后與純化的熒光素標記物混合，其中含Y染色體D NA序列用鉑－羅丹明(紅色)標記物1ug；含X染色體DNA序列用鉑－FITC(綠色)標記物1ug(本實驗采用所述順鉑熒光配合物中碳鏈長度n＝6)。將混合物80℃反應40min，取出，進液相分離柱純化待用。

將精子細胞常規(guī)固定，經過二硫蘇糖醇(DTT)，二碘水楊酸鋰(LIS)處理后，于75℃下變性5min，取出經70％－80％－90％乙醇脫水，將標記的DNA探針經92℃變性10min后，20℃處理30min，取出，滴加于精子玻片雜交區(qū)域，封片，37℃雜交過夜。取出玻片，經過0.4×SSC/0.3％Nonidet-P40溶液清洗，梯度脫水，晾干，DAPI復染，熒光顯微鏡(Olympus BX51)觀察。

結果顯示：熒光信號明顯，特異性高，無彌散信號，其中紅色代表精子Y染色體著絲粒區(qū)域，綠色代表X染色體著絲粒區(qū)域，以鉑為介導的復合物標記方法能夠有效對DNA進行標記，且被標記的熒光探針同樣具有較滿意的熒光強度(見圖7)。

實施例5

采用本發(fā)明所述的順鉑熒光配合物為介導的熒光素標記抗體，檢測人類精子一種谷氨酸受體，N－甲基－D－天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)進行抗原抗體特異反應的試驗(蛋白質抗體熒光標記)

自Sigma公司采購抗NMDA抗體，以及二抗。將100ug的二抗IgG與1u g純化后的鉑－生物素－FITC標記物混合(本實驗采用所述順鉑熒光配合物中的n＝6)，37℃反應約20min后，吸出標記樣本的混合物，40Mpa經過液相分離柱，得到純化的熒光素化的抗體備用。

人類精子樣品從21－43歲男子節(jié)欲3天后手淫獲得。精子于37℃液化30分鐘，檢測到正常精子，在含4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液中固定30分鐘，涂于明膠包被的載玻片上，干燥、固定。人類精子涂片用0.01M PBS洗滌，然后用含10％山羊或兔血清及0.1％Triton X-100的PBS緩沖液封閉以降低非特異性免疫染色。用初級抗體或作為陰性對照的正常非免疫血清4℃過夜，孵化后，涂片用PBS漂洗3次，并與已經標記好的相應的二抗(鉑－FITC)結合，室溫下孵化2小時，然后用PBS漂洗，最后涂片在熒光顯微鏡下檢測并拍照。

結果顯示：實驗發(fā)現在精子尾部可清楚地觀察到NR2B特異性的綠色熒光(FITC)但精子頭部無免疫活性(見圖8)，說明NR2B受體主要存在于精子的尾部，從而證明鉑介導的熒光標記技術同樣能有效對蛋白質抗體進行標記。

實施例6

采用本發(fā)明所述順鉑熒光配合物為介導的熒光素標記抗體標記膀胱癌T24細胞凋亡的試驗

取膀胱癌T24細胞，加入木黃酮40mg/L。分別于12、24、36、48h收獲膀胱癌T24細胞，用TUNEL法檢測凋亡細胞，觀察木黃酮對T24細胞的影響，加藥48h后收獲細胞，離心、棄上清液。具體按試劑盒說明書進行操作，加入0.01mol/L PBS混勻，將細胞懸液滴于經二甲藍處理的載玻片上，放置20min，載玻片放入4％多聚甲醛中過夜，PBS及雙蒸水洗片3次，加標記緩沖液，室溫下放置15min，加混合液及標記緩沖液；37℃于濕盒中標記60min，其中標記物為本發(fā)明的新化合物與地高辛－Pt－dUTP復合物(本實驗采用所述順鉑熒光配合物中的n＝6)，常規(guī)封片，于光學顯微鏡下觀察細胞并拍照，細胞染成棕褐色為凋亡細胞，藍色為正常細胞。圖9顯示對照組活細胞呈藍色，凋亡細胞極少；圖10顯示，實驗組見大量染成棕色的凋亡細胞，該鉑－復合物介導的標記手法同樣可以用于組織化學染色，且能很好顯色。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內。