本技術(shù)發(fā)明屬于精子體外處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層提高精子活力的方法。

背景技術(shù)：

體外受精是指哺乳動(dòng)物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)。在生物學(xué)中，把體外受精胚胎移植到母體后獲得的動(dòng)物稱試管動(dòng)物。人工授精技術(shù)是一項(xiàng)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物的繁育高新技術(shù)，利用人工授精，結(jié)合胚胎移植技術(shù)，可以更好地開發(fā)遺傳特性優(yōu)良的母畜繁殖潛力，較快地?cái)U(kuò)大良種畜群。

自1978年第一例試管嬰兒出生以來，不孕、不育癥的治療獲得了突破。在利用體外受精技術(shù)與胚胎移植技術(shù)相結(jié)合獲得試管嬰兒的過程中，提高體外精子的活力及精子的體外獲能是該技術(shù)的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。自1992年卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)問世以來，即使精液中無精子的患者也有望利用睪丸、附睪中的精子進(jìn)行ICSI獲得生育。但是，睪丸中的精子不能運(yùn)動(dòng)，難以判斷其是否為活精子，需要體外培養(yǎng)一段時(shí)間部分精子才能獲得一定運(yùn)動(dòng)能力。為了提高睪丸、附睪內(nèi)精子的活力和活率，便于選擇成活精子用于ICSI中，本技術(shù)發(fā)明對(duì)睪丸、附睪內(nèi)精子用睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層進(jìn)行體外共培養(yǎng)處理，能夠在體外實(shí)現(xiàn)提高附睪內(nèi)精子活力和活率的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的解決上述技術(shù)問題，提供一種體外提高附睪內(nèi)精子活力的方法，其以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層對(duì)附睪內(nèi)精子進(jìn)行體外處理，以期增加體外附睪內(nèi)精子的活力和活率，進(jìn)而提高體外精子的受精能力。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層提高精子活力的方法，其包括下列步驟：

（1）睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)：

1）取出生后4-6天的動(dòng)物睪丸，將其放入預(yù)熱溫度為37℃的生理鹽水中沖洗，再在含有雙抗的PBS中清除多余脂肪并剝離白膜，將剝離好的睪丸轉(zhuǎn)入DMEM/F12吹打混勻離心去上清；

2）加入適量的透明質(zhì)酸酶和膠原酶IV消化2分鐘，加入適量的DMEM/F12吹打混勻離心去上清；

3）加入適量的胰酶和DNase酶消化2分鐘，加入體積相當(dāng)于胰酶和DNase酶體積的之和的含10%FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)液，終止消化，將細(xì)胞懸液先后通過80目、200目、300目的細(xì)胞篩，離心，棄上清，向沉淀中加入含10%FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)液2ml混勻制成細(xì)胞懸液，將2ml細(xì)胞懸液全部加入底層鋪有明膠的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；

4）培養(yǎng)1小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，貼壁細(xì)胞即為睪丸支持細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，傳代后，備用；

（2）支持細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備：支持細(xì)胞分離培養(yǎng)2天后，細(xì)胞單層形成，加入絲裂霉素C處理2小時(shí)，制備成睪丸支持細(xì)胞滋養(yǎng)層；

（3）從成熟雄性動(dòng)物的附睪中獲取精子，加入以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中，將精子與支持細(xì)胞共培養(yǎng)。

進(jìn)一步地，步驟（1）的1）中，選取的是剛出生后4-6天的動(dòng)物的睪丸。

進(jìn)一步地，步驟（1）的2）中，加入的透明質(zhì)酸酶的體積為1ml-3ml。

進(jìn)一步地，步驟（1）的2）中，加入的膠原酶IV的體積為1ml-3ml。

進(jìn)一步地，步驟（1）的2）中，加入的透明質(zhì)酸酶和膠原酶IV體積相同。

進(jìn)一步地，步驟（1）的2）中，加入的DMEM/F12的體積相當(dāng)于透明質(zhì)酸酶與膠原酶IV的體積的總和。

進(jìn)一步地，步驟（1）的3）中，加入的胰酶的體積為1ml-3ml。

進(jìn)一步地，步驟（1）的3）中，加入的DNase酶的體積為1ml-3ml。

進(jìn)一步地，步驟（1）的3）中，加入的胰酶和DNase酶體積相同。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：采用本發(fā)明的技術(shù)，提高了精子的活力和活率，增加了精子受精的能力。本發(fā)明通過上述具體方法，以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層體外培養(yǎng)睪丸、附睪內(nèi)的精子，解決了現(xiàn)有技術(shù)中體外精子活力低的問題，提高了體外精子的活力和活率，增加了精子的受精能力。

附圖說明

圖1為全自動(dòng)精子分析儀記錄的對(duì)照組精子活力情況；

圖2為全自動(dòng)精子分析儀記錄的實(shí)驗(yàn)組精子活力情況；

圖3為統(tǒng)計(jì)的對(duì)照組精子活力情況結(jié)果圖示；

圖4為統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)組精子活力情況結(jié)果圖示。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1

本實(shí)施例為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組的處理如下：

一種以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層提高精子活力的方法，其包括下列步驟：

（1）取出生后4-6天小鼠睪丸，將其放入預(yù)熱溫度為37℃的生理鹽水中沖洗，再在含有雙抗的PBS中清除多余脂肪并剝離白膜，將剝離好的睪丸轉(zhuǎn)入DMEM/F12吹打混勻離心去上清；

（2）加入1.5ml透明質(zhì)酸酶和1.5ml膠原酶IV消化2分鐘，加入等體積(3ml)的DMEM/F12吹打混勻離心去上清；

（3）加入1.5ml胰酶和1.5ml DNase酶消化2分鐘，等體積(3ml)含10%FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)液，終止消化，將細(xì)胞懸液先后通過80目、200目、300目的細(xì)胞篩，離心，棄上清，向沉淀中加入含10%FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)液2ml混勻制成細(xì)胞懸液，將2ml細(xì)胞懸液全部加入底層鋪有明膠的3.5cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；

（4）培養(yǎng)1小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，貼壁細(xì)胞即為睪丸支持細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，傳代后，備用；

（5）支持細(xì)胞分離培養(yǎng)2天后，細(xì)胞單層形成，加入絲裂霉素C處理2小時(shí)，制備成睪丸支持細(xì)胞滋養(yǎng)層；

（6）成熟公鼠脫臼法處死，立即摘出睪丸和附睪，在滅菌濾紙上除去血液和脂肪組織，用眼科剪刀剪開附睪尾，取出精子團(tuán)，加入以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層的1ml培養(yǎng)體系中，置培養(yǎng)箱內(nèi)37℃，培養(yǎng)2h。

培養(yǎng)2h后，利用全自動(dòng)精子分析儀計(jì)錄精子的活力。

實(shí)施例2

本實(shí)施例為對(duì)照組的具體實(shí)施方式，對(duì)照組的處理如下：

（1）成熟公鼠脫臼法處死，立即摘出睪丸和附睪，在滅菌濾紙上除去血液和脂肪組織；

（2）用眼科剪刀剪開附睪尾，取出精子團(tuán)，加入1ml含10%FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)體系中，置培養(yǎng)箱內(nèi)37℃，培養(yǎng)2h。

（3）培養(yǎng)2h后，利用全自動(dòng)精子分析儀計(jì)錄精子的活力。

如圖1和圖2所示為全自動(dòng)精子分析儀結(jié)果圖片，紅線代表快速前向運(yùn)動(dòng)精子，綠線代表慢速前向運(yùn)動(dòng)精子，藍(lán)線代表非前向運(yùn)動(dòng)精子，黃點(diǎn)代表不動(dòng)精子。

如圖3和圖4所示，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，對(duì)照組快速前向運(yùn)動(dòng)精子占44%(圖中的灰色區(qū)域)，不動(dòng)精子占37%(圖中的白色網(wǎng)格區(qū)域)；實(shí)驗(yàn)組（即支持細(xì)胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)組）快速前向運(yùn)動(dòng)精子占62%(圖中的灰色區(qū)域)，不動(dòng)精子占15%(圖中的白色網(wǎng)格區(qū)域)。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明以睪丸支持細(xì)胞為滋養(yǎng)層體外培養(yǎng)睪丸、附睪內(nèi)的精子，顯著提高了體外精子的活力和活率、增加了精子的受精能力。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。